基因工程上课件

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1、基因重组基因重组(DNA重组重组):将不同来源的将不同来源的DNA分子分子通过磷酸二酯键连接而形成新的通过磷酸二酯键连接而形成新的DNA分子的过程分子的过程基本概念基本概念克隆克隆(clone)是指通过是指通过无性繁殖无性繁殖过程所产生的与过程所产生的与亲代亲代完全相同的子代群体完全相同的子代群体分子克隆分子克隆是在体外对是在体外对DNA分子按照既定的目的和分子按照既定的目的和方案进行人工重组，将重组分子导入到合适的受方案进行人工重组，将重组分子导入到合适的受体细胞中，使其在细胞中扩增和繁殖，以获得体细胞中，使其在细胞中扩增和繁殖，以获得DNA分子大量复制，并使受体细胞获得新的遗传分子大量复制

2、，并使受体细胞获得新的遗传特征的过程特征的过程。 基因工程的概念：基因工程的概念： 利用利用DNADNA体外重组或体外重组或PCRPCR扩增技术从扩增技术从某种生物基因组中某种生物基因组中分离分离感兴趣的基因，感兴趣的基因，或是用人工合成的方法获取基因，然后或是用人工合成的方法获取基因，然后经过一系列经过一系列切割切割，加工修饰，加工修饰，连接连接反应反应形成重组形成重组DNADNA分子，再将其分子，再将其转转入适当的入适当的受体细胞，以期获得基因受体细胞，以期获得基因表达表达的过程的过程. . 遗传工程遗传工程(genetic engineering);(genetic engineerin

3、g); 基因克隆基因克隆(gene cloning);(gene cloning); 分子克隆分子克隆(molecular cloning);(molecular cloning); 基因操作基因操作(gene manipulation);(gene manipulation); 重组重组DNADNA技术技术(recombination DNA technique)(recombination DNA technique)1 1、从复杂的生物有机体基因组中，经过酶切消化或、从复杂的生物有机体基因组中，经过酶切消化或PCRPCR扩增等步骤，扩增等步骤，分离分离出带有目的基因的出带有目的基因的DN

4、ADNA片段。片段。2 2、在体外，将带有目的基因的外源、在体外，将带有目的基因的外源DNADNA片段片段连接连接到能到能够自我复制的并具有选择记号的载体分子上，形成够自我复制的并具有选择记号的载体分子上，形成重组重组DNADNA分子分子3 3、将重组、将重组DNADNA分子分子转移转移到适当的受体细胞到适当的受体细胞( (亦称寄主细亦称寄主细胞胞) )，并与之一起增殖。，并与之一起增殖。4 4、从大量的细胞繁殖群体中，、从大量的细胞繁殖群体中，筛选筛选出获得了重组出获得了重组DNADNA分子的受体细胞克隆。分子的受体细胞克隆。5 5、从这些筛选出来的受体细胞克隆，、从这些筛选出来的受体细胞克

5、隆，提取提取出已经得到出已经得到扩增的目的基因，供进一步分析研究使用。扩增的目的基因，供进一步分析研究使用。6 6、将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使、将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能之在新的遗传背景下实现功能表达表达，产生出人类所，产生出人类所需要的物质需要的物质。 1996 1996年年7 7英国爱英国爱丁堡罗斯林（丁堡罗斯林（RoslinRoslin）研究所用药物促使母研究所用药物促使母羊排卵，将卵吸空，羊排卵，将卵吸空，制成空卵壳，再从母制成空卵壳，再从母羊乳腺中取出一个体羊乳腺中取出一个体细胞，使它与卵壳合细胞，使它与卵壳合成一个含有遗

6、传物质成一个含有遗传物质的卵细胞。当卵细胞的卵细胞。当卵细胞分裂形成胚胎后被植分裂形成胚胎后被植入母羊子宫内，母羊入母羊子宫内，母羊产下了与自己有相同产下了与自己有相同基因的多莉！基因的多莉！ 一、一、限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 二、二、DNADNA聚合酶聚合酶 三、逆转录酶三、逆转录酶 四、四、DNADNA连接酶连接酶 五、碱性磷酸酶五、碱性磷酸酶 六、末端脱氧核苷酸转移酶六、末端脱氧核苷酸转移酶一、限制性核酸内切酶一、限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(RE)(RE)是由细菌产生的一种能识别双链是由细菌产生的一种能识别双链DNADNA中的特定位点，并水解该点磷酸二酯键的

7、核酸内切酶中的特定位点，并水解该点磷酸二酯键的核酸内切酶( (简称限制酶或内切酶简称限制酶或内切酶) )，多在原核生物中存在，多在原核生物中存在. .限制酶的分类限制酶的分类I I型限制酶：型限制酶：具有限制和具有限制和DNADNA修饰作用，这种酶通常在修饰作用，这种酶通常在识别位点下游识别位点下游1001001000bp1000bp处切割处切割DNADNA；型限制酶：型限制酶：与与I I型酶一样，具有限制与修饰活性，能型酶一样，具有限制与修饰活性，能在识别位点附近切割在识别位点附近切割DNADNA，切割位点很难预测，切割位点很难预测. .型限制酶：型限制酶：能在能在DNADNA分子内部的特异

8、位点识别和切割分子内部的特异位点识别和切割双链双链DNADNA，其切割位点的序列可知、固定，其切割位点的序列可知、固定, ,是基因工程常是基因工程常用酶。用酶。限制酶的命名限制酶的命名第一个字母第一个字母取自产生该酶的细菌取自产生该酶的细菌属名属名，用，用大写大写；第二、第三个字母第二、第三个字母是该细菌的是该细菌的种名种名，用，用小写小写；第四个字母第四个字母代表代表株株。另外用另外用罗马数字罗马数字代表同一菌株中不同限制酶的编号，代表同一菌株中不同限制酶的编号，现在常用来表示发现的现在常用来表示发现的先后次序先后次序EcoEcoRR：E E代表代表EscherichiaEscherichi

9、a属属 coco代表代表colicoli 种种 R R代表代表RY13RY13株株 I I代表该菌株中首次分离到的核酸内切酶代表该菌株中首次分离到的核酸内切酶粘性末端粘性末端在识别序列的两个对称点切开在识别序列的两个对称点切开DNADNA双链，产生双链，产生带单链尾的粘性末端带单链尾的粘性末端如 EcoR 切 割 后 产 生 5粘 性 末 端 ， Pst 切 割 后 产 生 3粘 性 末 端 ：-CTGCAG-GACGTC-53355-CTGCA3-GG-3ACGTC-5+Pst I-GAATTC-CTTAAG-5-G3-CTTAAAATTC-3G-5+5335EcoR I限制酶的识别和切割位

10、点限制酶的识别和切割位点特点：特点：4-84-8个个bpbp，具有回文结构的，具有回文结构的DNADNA片段片段平末端：平末端：切割点是识别序列的对称轴，产生平端或钝切割点是识别序列的对称轴，产生平端或钝端端(blunt end)(blunt end)。如如SmaSma-CCCGGG-GGGCCC-53355-CCC3-GGGGGG-3CCC-5+Sma IGTCCAGGCCTAGGATCC GGGATCCCCTAGGGTCGACCAGCTGGACCTG平端切口平端切口粘端切口粘端切口特殊性质的特殊性质的型限制酶：型限制酶：同裂酶：同裂酶：又称异源同工酶，是从不同的原核生物中又称异源同工酶，是

11、从不同的原核生物中分离出来的不同的酶。它们分离出来的不同的酶。它们识别相同的序列识别相同的序列，在切，在切割割DNADNA时，其切割点可以是相同的，也可以是不同时，其切割点可以是相同的，也可以是不同的的。例如：例如：Aha Aha 和和DraDra的识别和切割序列都相同，的识别和切割序列都相同，产生平端：产生平端：-TTTAAA-AAATTT-53355-TTT3-AAAAAA-3TTT-5+Aha Dra 又如又如KpnKpn和和AspAsp718718的识别位点相同，但切割的识别位点相同，但切割位点不相同，前者产生位点不相同，前者产生33粘性末端，而后者产生粘性末端，而后者产生55粘性末端

12、粘性末端-GGTACC-CCATGG-GGTACC-CCATGG-53355-GGTAC3-CC-3CATGG-5+Kpn I53355-G3-CCATGGTACC-3G-5+Asp718 I同尾酶同尾酶(isocaudarner)(isocaudarner)：有些限制酶的识别序列有些限制酶的识别序列不同，但是它们作用后不同，但是它们作用后产生相同的粘性末端产生相同的粘性末端，故，故称为同尾酶。称为同尾酶。例如例如MboMbo、BamHBamH、BglBgl的识别切割序列分别的识别切割序列分别为：为：-GATC- -GGATCC- -AGATCT-CTAG- -CCTAGG- -TCTAGA-

13、533553355335( (一一)DNA)DNA聚合酶聚合酶I I 催化催化DNADNA缺口平移反应，制备高比活性缺口平移反应，制备高比活性DNADNA探针；探针；第二条第二条cDNAcDNA链的合成；链的合成；对对DNA3DNA3突出末端标记；突出末端标记；DNADNA序列分析。序列分析。 用枯草杆菌蛋白酶可将用枯草杆菌蛋白酶可将DNADNA聚合酶聚合酶I I裂解为裂解为36kD36kD和和76kD76kD两个片段，两个片段，大片段称为大片段称为KlenowKlenow片段片段. .具有具有5353聚合酶活性及聚合酶活性及3535外切外切酶活性，而失去了酶活性，而失去了5353外切酶活性。

14、它外切酶活性。它具有的具有的3535外切酶活性能保证外切酶活性能保证DNADNA复制的复制的准确性，把准确性，把DNADNA合成过程中错误配对的核苷合成过程中错误配对的核苷酸去除，再把正确的核苷酸接上去。酸去除，再把正确的核苷酸接上去。聚 合 酶 外 切 酶5 3 3 5 3 6 kD 7 6 kDNNCD N AIK le n o w聚 合 酶片 段大 肠 杆 菌C用 枯 草 杆 菌 蛋 白 酶 裂 解 全 酶5 3 外 切 酶 聚 合 酶 外 切 酶5 3 3 5 v补齐双链补齐双链DNADNA的的3 3末端。末端。 5 5-G-OH -G-OH KlenowKlenow 5 5-GTTA

15、A-OH-GTTAA-OH 3 3-CAATT-OH dATP,dTTP 3-CAATT-OH dATP,dTTP 3-CAATT-OH-CAATT-OH KlenowKlenow片段的主要用途：片段的主要用途：v在在cDNAcDNA克隆中，第二股链的合成。克隆中，第二股链的合成。 vDNADNA序列分析。序列分析。v3 3末端标记。末端标记。 5 5-G-OH Klenow 5-G-OH Klenow 5-GTT-GTT* *A A* *A-OHA-OH 3 3-CAATT-OH d-CAATT-OH d* *ATP,dTTP 3ATP,dTTP 3-CAA T T-OH-CAA T T-O

16、H TaqDNA TaqDNA聚合酶是一种依赖聚合酶是一种依赖DNADNA的耐热的耐热DNADNA聚合酶聚合酶 主要用于聚合酶链反应主要用于聚合酶链反应(PCR)(PCR)中，能以中，能以DNADNA为模板，以结合在模板上的引物为起点，以为模板，以结合在模板上的引物为起点，以dNTPdNTP为原料，按碱基配对方式，从为原料，按碱基配对方式，从5353方向方向合成新的合成新的DNADNA链。链。TaqDNATaqDNA聚合酶聚合酶在在70707575o oC C时具时具有最佳的生物活性有最佳的生物活性，随着温度的降低，酶活性，随着温度的降低，酶活性明显下降。同时此酶缺乏明显下降。同时此酶缺乏35

17、35外切酶活性，外切酶活性，无校正功能无校正功能。 以以RNARNA为模板合成为模板合成DNADNA的的DNADNA聚合酶称为逆转聚合酶称为逆转录酶，合成的录酶，合成的DNADNA产物称为互补产物称为互补DNA(cDNA)DNA(cDNA)。 应用于：应用于：将将mRNAmRNA逆转录成逆转录成cDNAcDNA，构建，构建cDNAcDNA文库；文库；补平和标记补平和标记5-5-末端突出的末端突出的DNADNA片段；片段；代替代替KlenowKlenow酶用于酶用于DNADNA序列分析；序列分析；制备制备杂交探针等杂交探针等。 DNADNA连接酶催化双链连接酶催化双链DNADNA一端一端33端羟

18、基与另一端羟基与另一双链双链DNADNA的的55端磷酸基连接，形成端磷酸基连接，形成3,5-3,5-磷磷酸二酯键，使具有相同粘性末端或平端的酸二酯键，使具有相同粘性末端或平端的DNADNA末端连接起来。从而把两个末端连接起来。从而把两个DNADNA分子连接起来，分子连接起来，或连接双链或连接双链DNADNA中一条链的切口中一条链的切口 最常用的最常用的DNADNA连接酶是由连接酶是由T4T4噬菌体编码的噬菌体编码的T4 T4 DNADNA连接酶。连接酶。 要求：两个双链要求：两个双链DNADNA片段间存在互补的粘性末片段间存在互补的粘性末端或平头末端端或平头末端五、碱性磷酸酶五、碱性磷酸酶碱性

19、磷酸酶能去除碱性磷酸酶能去除DNADNA或或RNA 5RNA 5端的磷酸根端的磷酸根用途：用途：制备载体时，用碱性磷酸酶处理后，可制备载体时，用碱性磷酸酶处理后，可防止载体自身连接，提高重组效率防止载体自身连接，提高重组效率 将脱氧核苷酸加到将脱氧核苷酸加到DNADNA的的33端羟基上，主端羟基上，主 要用于探针标记；或者在载体和待克隆的片要用于探针标记；或者在载体和待克隆的片段上形成同聚物尾，以便于进行连接。段上形成同聚物尾，以便于进行连接。六、末端脱氧核苷酸转移酶六、末端脱氧核苷酸转移酶 概念：概念： 载体载体(vector)(vector)是指能在连接酶作用是指能在连接酶作用下和外源下和

20、外源DNADNA片段连接，实现外源片段连接，实现外源DNADNA的无性繁殖或表达有意义的蛋的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的白质所采用的DNADNA分子。分子。 外源外源 DNADNA一般没有明显的遗传标志，一般没有明显的遗传标志，如果将其直接导入宿主细胞，没有有效的如果将其直接导入宿主细胞，没有有效的方法能将导入了外源方法能将导入了外源 DNADNA片段的细胞和未片段的细胞和未导入外源导入外源DNADNA的细胞区分开来。的细胞区分开来。 外源外源 DNADNA导入宿主细胞后，不能随宿导入宿主细胞后，不能随宿主细胞的繁殖而复制，即主细胞的繁殖而复制，即没有自主复制能没有自主复制能力，力，达

21、不到使外源达不到使外源DNADNA片段扩增的目的。片段扩增的目的。 如果要将外源如果要将外源 DNADNA片段导入宿主片段导入宿主细胞进行扩增或表达，就需要有一个细胞进行扩增或表达，就需要有一个能在该宿主细胞内进行自我复制和表能在该宿主细胞内进行自我复制和表达的载体来携带。外源达的载体来携带。外源DNADNA片段与载体片段与载体在体外连接，构成重组分子，然后导在体外连接，构成重组分子，然后导入宿主细胞，使之进行扩增或表达。入宿主细胞，使之进行扩增或表达。 一、载体的分类一、载体的分类( (一一) )克隆载体克隆载体(cloning vector)(cloning vector) -为使插入的外

22、源为使插入的外源DNADNA序列被扩增而特意设计的载体。序列被扩增而特意设计的载体。包括包括: : 质粒、噬菌体以及病毒等质粒、噬菌体以及病毒等载体必须具备以下基本条件：载体必须具备以下基本条件：有自身的复制子，有自身的复制子，能借助自身的复制和调控系统对携带能借助自身的复制和调控系统对携带的目的基因进行复制增殖；的目的基因进行复制增殖；具备多克隆位点具备多克隆位点，易于外源易于外源DNADNA分子与载体连接及重组；分子与载体连接及重组；具有具有多个利于选择和筛选的遗传表型或标志多个利于选择和筛选的遗传表型或标志，包括抗药包括抗药性、营养缺陷型、噬菌斑形成及显色反应等；性、营养缺陷型、噬菌斑形

23、成及显色反应等；有有足够的容量足够的容量以容纳外源以容纳外源DNADNA片段，同时具有拷贝数高、片段，同时具有拷贝数高、易与宿主细胞的易与宿主细胞的DNADNA分离并易提取、抗剪切力强等特点；分离并易提取、抗剪切力强等特点；可导入受体细胞可导入受体细胞。polylinker(二二)表达型载体表达型载体(expression vector)：为使插入的外源为使插入的外源DNADNA序列可转录翻译成多肽链而特意序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体。设计的载体。表达型载体除具有克隆载体所具有的特性表达型载体除具有克隆载体所具有的特性外还具备外还具备表达系统元件表达系统元件原核表达载体的表达系统元件

24、是原核表达载体的表达系统元件是启动子启动子- -核糖体结合位点核糖体结合位点- -克隆位点克隆位点- -转录终止转录终止信号信号真核表达载体的表达系统元件是真核表达载体的表达系统元件是启动子启动子- -核糖体结合位点核糖体结合位点- -克隆位点克隆位点- -终止信号终止信号和和poly(A)poly(A)信号信号粘粒粘粒(cosmid)(cosmid)(超纯质粒 )噬菌体噬菌体(phage)(phage) 质粒（质粒（plasmidplasmid）近年来发展了一系列新的载体系近年来发展了一系列新的载体系 统，它们能在细菌中扩增，在真统，它们能在细菌中扩增，在真 核细胞中表达。核细胞中表达。病毒

25、载体病毒载体(virus)(virus) M13M13噬菌体噬菌体(M13 phage) (M13 phage) 载体载体(vector)(vector)主要类型：主要类型：二、常用的载体二、常用的载体(一一)质粒质粒质粒质粒(plasmid)(plasmid)是是细细菌染色体外菌染色体外的遗传单的遗传单位，是一种位，是一种环状环状的双的双链链DNADNA分子，其结构分子，其结构比病毒更简单，无蛋比病毒更简单，无蛋白外壳，也无细胞外白外壳，也无细胞外的生命周期，是仅能的生命周期，是仅能存在于宿主细胞质内、存在于宿主细胞质内、独立于染色体的、自独立于染色体的、自主复制的遗传成分主复制的遗传成分1

26、 1、pBR322pBR322载体载体2 2、pUCpUC载体载体优点：优点：1 1、分子量较小，为、分子量较小，为4363bp4363bp，不仅利于自身不仅利于自身DNADNA的纯化，的纯化，可容纳的外源可容纳的外源DNADNA也较大。也较大。2 2、具有两种抗菌素抗性基因、具有两种抗菌素抗性基因可供转化子的选择记号。可供转化子的选择记号。3 3、具有较高的拷贝数，经过、具有较高的拷贝数，经过氯霉素扩增后，每个细胞中氯霉素扩增后，每个细胞中可累积可累积1000-30001000-3000个拷贝，个拷贝，为重组体为重组体DNADNA的制备提供了的制备提供了极大的方便。极大的方便。p pB BR

27、 R3 32 22 2B Ba am mH HI IS Sa al lI IH Hi in nd dI II II IP Ps st tI IS Sc ca aI IA Am mp pr ro or ri i( (4 4. .3 36 6 k kb b) ) pUCpUC系列质粒载体具有三个显著特点：系列质粒载体具有三个显著特点： （1 1）分子量更小，仅为）分子量更小，仅为2.7KB2.7KB，容纳外源，容纳外源DNADNA量增大；具有更量增大；具有更高的拷贝数（不用氯霉素扩增，每个细胞含高的拷贝数（不用氯霉素扩增，每个细胞含500-700500-700个拷贝）。个拷贝）。 （2 2）含易于

28、检测是否有外源）含易于检测是否有外源DNADNA插入的标记基因插入的标记基因LacZLacZ，可利，可利用用 - -互补原理进行蓝白筛选。互补原理进行蓝白筛选。 （3 3）多克隆位点区（）多克隆位点区（MCSMCS） 由人工合成的多个单一酶切位点构成。每一种限制性内切由人工合成的多个单一酶切位点构成。每一种限制性内切酶会产生不同的粘性末端，可选用两种内切酶组合在质粒载酶会产生不同的粘性末端，可选用两种内切酶组合在质粒载体和外源体和外源DNADNA上产生相同的末端，进行双粘端连接，既提高克上产生相同的末端，进行双粘端连接，既提高克隆的效率，又可以定向克隆。隆的效率，又可以定向克隆。 EcoSac

29、KpnSmaBamXbaSalPstSphHinRI I I I HI I I I I dIIIpUC18pUC19HinSphPst SalXbaBamSmaKpnSacEcodIII I I I I HI I I I RIApOriLacZ(2.68kb)r1. 1. 目的基因的获取目的基因的获取2. 2. 克隆载体的选择与构建克隆载体的选择与构建3. 3. 外源基因与载体的连接外源基因与载体的连接4. 4. 重组重组DNADNA导入受体菌导入受体菌5. 5. 重组体的筛选重组体的筛选6. 6. 克隆基因的表达克隆基因的表达一、目的基因的获取一、目的基因的获取( (一一) )制备基因组制备

30、基因组DNADNA文库文库 采用限制酶将基因组采用限制酶将基因组DNADNA切成片段，每一切成片段，每一DNADNA片段都与一个载体分子拼接成重组片段都与一个载体分子拼接成重组DNADNA。将。将所有的重组所有的重组DNADNA分子都引入宿主细胞并进行扩增，分子都引入宿主细胞并进行扩增，得到分子克隆的混合体，这样一个混合体称为得到分子克隆的混合体，这样一个混合体称为基因组文库基因组文库(genomic library)(genomic library)。用适当的筛选。用适当的筛选方法从菌落中选出含有某一基因的菌落，再行方法从菌落中选出含有某一基因的菌落，再行扩增，将重组扩增，将重组DNADNA

31、分离、回收，获得目的基因的分离、回收，获得目的基因的克隆。克隆。(二二)制备制备cDNA文库文库 以以mRNAmRNA为模板，利用逆转录酶合成其互为模板，利用逆转录酶合成其互补补DNADNA，再复制成双链，再复制成双链cDNAcDNA片段，与适当载体片段，与适当载体连接后转入受体菌，扩增为连接后转入受体菌，扩增为cDNAcDNA文库文库(cDNA (cDNA library) library) 。采用适当方法从。采用适当方法从cDNAcDNA文库中筛文库中筛选出选出目的目的cDNAcDNA。 在细胞中，表达基因一般仅占基因总数在细胞中，表达基因一般仅占基因总数的的15%15%左右，所以从左右，

32、所以从mRNAmRNA出发分离目的基因出发分离目的基因极极大地缩小了搜索目的基因的范围。大地缩小了搜索目的基因的范围。(三三)聚合酶链反应聚合酶链反应(PCR) 如果知道目的基因的全序列或其两侧序列，如果知道目的基因的全序列或其两侧序列，可以通过合成一对与模板可以通过合成一对与模板DNADNA互补的引物采用互补的引物采用PCR PCR 方法即可有效地分离目的基因。方法即可有效地分离目的基因。 PCR PCR 方法方法十分十分简捷简捷。现代分子生物学发展到今天，人类基因组。现代分子生物学发展到今天，人类基因组全序列已经测出，并且越来越多的生物的基因组全序列已经测出，并且越来越多的生物的基因组全序

33、列正在被测出，全序列正在被测出， PCR PCR 方法已经成为分离目方法已经成为分离目的基因的主要手段。的基因的主要手段。(四四)人工合成基因人工合成基因 人工合成基因需先知道目的基因的结构与核人工合成基因需先知道目的基因的结构与核苷酸序列及其他相关的基因信息。应用苷酸序列及其他相关的基因信息。应用DNADNA测序测序技术能测定基因的核苷酸序列，同时也可以通过技术能测定基因的核苷酸序列，同时也可以通过氨基酸序列分析反推核苷酸序列。通过化学合成氨基酸序列分析反推核苷酸序列。通过化学合成的方法合成目的基因。适用于小的方法合成目的基因。适用于小DNADNA分子质量的分子质量的基因。基因。(一一) 粘

34、性末端连接粘性末端连接(二二) 平头末端连接平头末端连接(三三) 人工接头法人工接头法(四四) 同源多聚尾连接法同源多聚尾连接法 (三三)人工接头法人工接头法 人工接头主要用于在人工接头主要用于在DNADNA分子的平头末分子的平头末端上添加新的内切酶位点，产生粘性末端，端上添加新的内切酶位点，产生粘性末端，以提高连接效率。目前此方法常用于基因以提高连接效率。目前此方法常用于基因克隆、文库构建等操作中。克隆、文库构建等操作中。IBamHI5555 (末端脱氧核苷酸转移酶) 三、重组三、重组DNADNA导入宿主细胞导入宿主细胞 外源外源DNA(DNA(含目的含目的DNA)DNA)与载体在体与载体在

35、体外连接成重组外连接成重组DNADNA分子后，需将其导分子后，需将其导入受体细胞入受体细胞( (形成转化子形成转化子) )。随受体细。随受体细胞生长、增殖，重组胞生长、增殖，重组DNADNA分子也复制、分子也复制、扩增，这一过程即为无性繁殖。扩增，这一过程即为无性繁殖。 进行无性繁殖时所采用的受体细胞又称宿主进行无性繁殖时所采用的受体细胞又称宿主细胞，在选择适当的受体细胞后，经特殊方法处细胞，在选择适当的受体细胞后，经特殊方法处理，使之成为感受态细胞理，使之成为感受态细胞(competent cell)(competent cell)，具，具备接受外源备接受外源DNADNA能力。能力。 用作受

36、体细胞的原核生物主要是用作受体细胞的原核生物主要是E.coliE.coli、链球菌及枯草杆菌等，可用于重组体复制与表链球菌及枯草杆菌等，可用于重组体复制与表达。真核生物包括酵母、植物细胞、昆虫细胞达。真核生物包括酵母、植物细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞等，主要用于外源真核基因的和哺乳动物细胞等，主要用于外源真核基因的表达。表达。转化转化在基因克隆技术中，将质粒在基因克隆技术中，将质粒DNADNA及其重组体及其重组体导入细菌的过程称为转化导入细菌的过程称为转化(transformation)(transformation)；转染转染病毒及其重组体导入受体细胞称为转染病毒及其重组体导入受体细胞称为转

37、染(transfection)(transfection)；转导转导噬菌体及其重组体导入受体细胞称为转导噬菌体及其重组体导入受体细胞称为转导(transduction)(transduction)。四、目的基因的筛选和鉴定四、目的基因的筛选和鉴定 将外源基因导入宿主细胞以后，首要将外源基因导入宿主细胞以后，首要任务是筛选含有目的基因的任务是筛选含有目的基因的阳性克隆阳性克隆并加并加以扩增。以扩增。 所用的所用的方法方法主要有遗传学方法、免疫主要有遗传学方法、免疫学方法、核酸杂交法、学方法、核酸杂交法、PCRPCR等等 最常见的载体携带的标志是抗药性标志，如抗氨芐青霉素基因最常见的载体携带的标志

38、是抗药性标志，如抗氨芐青霉素基因（ AmpAmpr r ）、抗四环素基因）、抗四环素基因(tet(tetr r) )、抗卡那霉素基因、抗卡那霉素基因(kan(kanr r) )等。等。 当培养基中含有抗生素时，当培养基中含有抗生素时，只有携带相应抗药性基因载体的细只有携带相应抗药性基因载体的细胞才能生存繁殖，胞才能生存繁殖，这就把凡未能接受载体这就把凡未能接受载体DNADNA的细胞全部筛除掉了。的细胞全部筛除掉了。 如果外源目的序列是插入在载体的抗药性基因中间使这抗药性如果外源目的序列是插入在载体的抗药性基因中间使这抗药性基因失活，这个抗药性标志就会消失。基因失活，这个抗药性标志就会消失。例如

39、质粒例如质粒pBR322pBR322含有含有AmpAmpr r 、和和tettetr r两个抗药基因，若将目的序列插入两个抗药基因，若将目的序列插入tettetr r基因序列中，转化大基因序列中，转化大肠杆菌，让细菌放在含氨芐青霉素或四环素培养基中，凡未接受质肠杆菌，让细菌放在含氨芐青霉素或四环素培养基中，凡未接受质粒粒DNADNA的细胞都不能生长；凡在含氨芐青霉素和四环素中都能生长的细胞都不能生长；凡在含氨芐青霉素和四环素中都能生长的细菌是含有质粒的细菌是含有质粒pBR322pBR322的，但其的，但其pBR322pBR322未插入目的序列，凡在氨未插入目的序列，凡在氨芐青霉素中能生长、而在

40、四环素中不能生长的细菌就很可能是含有芐青霉素中能生长、而在四环素中不能生长的细菌就很可能是含有目的序列的重组质粒。目的序列的重组质粒。pBR322AmprTetr蓝蓝- -白筛选白筛选( (- -半乳糖苷酶法、半乳糖苷酶法、-互补检测法互补检测法) ) -半乳糖苷酶是一种把乳糖分解成葡萄糖和半乳糖的酶，半乳糖苷酶是一种把乳糖分解成葡萄糖和半乳糖的酶， 基基因产物装配为四聚体后才有酶活。该蛋白质可分为两部分：因产物装配为四聚体后才有酶活。该蛋白质可分为两部分：链和链和链。前者负责四聚体装配，后者具链。前者负责四聚体装配，后者具半乳糖苷酶活性；半乳糖苷酶活性；只有当只有当两者都存在时，才会表现出酶

41、活性，两者都存在时，才会表现出酶活性，该作用称之为该作用称之为-互补作用互补作用。这两个部分可独立存在，这两个部分可独立存在， 分别由两个基因编码。为分别由两个基因编码。为链编码的基链编码的基因称之为因称之为lacZlacZ。这两个基因（。这两个基因（LacZLacZ和和LacZLacZ）均可作为标记基因。）均可作为标记基因。 lacZlacZ（lacZlacZ）中含有多克隆位点，当无外源）中含有多克隆位点，当无外源DNADNA片段插入时，片段插入时，质粒表达质粒表达半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的-肽，与缺失突变体宿主菌（不能编肽，与缺失突变体宿主菌（不能编码码-肽）表达的肽）表达的lacZlacZ

42、基因产物（基因产物（ 链）互补，产生有活性的链）互补，产生有活性的半乳糖苷酶，在含有指示剂半乳糖苷酶，在含有指示剂X-galX-gal和诱导剂和诱导剂IPTG(IPTG(异丙基异丙基-硫代半乳糖苷硫代半乳糖苷)的存在下的存在下( (诱导物诱导物IPTGIPTG可诱导可诱导片段的合成，有活性的片段的合成，有活性的半乳糖半乳糖苷酶能水解底物苷酶能水解底物X-galX-gal，产生蓝色化合物。，产生蓝色化合物。) )菌落呈现兰色菌落呈现兰色；外源基；外源基因的插入后，破坏了因的插入后，破坏了lacZ -lacZ -肽基因的结构，细菌内不能产生肽基因的结构，细菌内不能产生半乳糖苷酶活性，半乳糖苷酶活性

43、，菌落呈白色菌落呈白色。 P LacZ LacZ 转录转录 翻译翻译 LacZLacZ基因的结构与产物基因的结构与产物 利用标记的核酸做探针与转化细胞的利用标记的核酸做探针与转化细胞的DNADNA进行进行分子杂交，可以直接筛选和鉴定目的序列克隆。常分子杂交，可以直接筛选和鉴定目的序列克隆。常用的方法是将转化后生长的菌落复印到硝酸纤维膜用的方法是将转化后生长的菌落复印到硝酸纤维膜上，用碱裂菌，菌落释放的上，用碱裂菌，菌落释放的DNADNA就吸附在膜上，再就吸附在膜上，再与标记的核酸探针温育杂交，核酸探针就结合在含与标记的核酸探针温育杂交，核酸探针就结合在含有目的序列的菌落有目的序列的菌落DNAD

44、NA上而不被洗脱。核酸探针可上而不被洗脱。核酸探针可以用放射性核素标记，结合了放射性核酸探针的菌以用放射性核素标记，结合了放射性核酸探针的菌落集团可用放射性自显影（落集团可用放射性自显影（auroradiographyauroradiography）法）法指示出来，核酸探针也可以用非放射性物质标记，指示出来，核酸探针也可以用非放射性物质标记，通常是经颜色呈现指示位置，这样就可以将含有目通常是经颜色呈现指示位置，这样就可以将含有目的序列的菌落挑选出来。的序列的菌落挑选出来。 2 2、原位杂交技术、原位杂交技术 PCRPCR技术的出现给克隆的筛选增加了一技术的出现给克隆的筛选增加了一个新手段。如果

45、已知目的序列的长度和两端个新手段。如果已知目的序列的长度和两端的序列，则可以设计合成一对引物，以转化的序列，则可以设计合成一对引物，以转化细胞所得的细胞所得的DNADNA为模板进行扩增，若能得到为模板进行扩增，若能得到预期长度的预期长度的PCRPCR产物，则该转化细胞就可能产物，则该转化细胞就可能含有目的的序列。含有目的的序列。4、限制酶切图谱鉴定、限制酶切图谱鉴定 DNA DNA分子上每种限制性内切酶的识别序列分布图，称分子上每种限制性内切酶的识别序列分布图，称限制性图谱（限制性图谱（restriction maprestriction map）或称物理图谱）或称物理图谱(physical

46、map)(physical map)。 这是在上述筛选后的进一步分析。目的序列插入载体这是在上述筛选后的进一步分析。目的序列插入载体会使载体会使载体DNADNA限制性酶图谱（限制性酶图谱（restriction maprestriction map）发生变化，）发生变化，例如一个长例如一个长600bp600bp的目的序列利用它两端的的目的序列利用它两端的EcoR IEcoR I和和SalISalI切后的粘末端连接插入切后的粘末端连接插入pUC19pUC19的多克隆点，则重组质粒就的多克隆点，则重组质粒就增大为增大为3.3kb3.3kb，用，用EooR IEooR I和和SalISalI双酶切后

47、会出现双酶切后会出现600bp600bp和和- -2.7kb2.7kb两个两个DNADNA片段，提取转化细菌的质粒片段，提取转化细菌的质粒DNADNA作酶切后做作酶切后做电泳观察其酶切图谱，就能分析得结果；如插入的目的序电泳观察其酶切图谱，就能分析得结果；如插入的目的序列中有其它限制性内切酶位点，也能在酶切电泳图谱上观列中有其它限制性内切酶位点，也能在酶切电泳图谱上观察到。这就可以进一步鉴定重组体是不是所要的目的克隆。察到。这就可以进一步鉴定重组体是不是所要的目的克隆。 所得到的目的序列或基因的克隆，都要所得到的目的序列或基因的克隆，都要用其核酸序列测定来最后鉴定。已知序列用其核酸序列测定来最

48、后鉴定。已知序列的核酸克隆要经序列测定确证所获得的克的核酸克隆要经序列测定确证所获得的克隆准确无误；未知序列的核酸克隆要测定隆准确无误；未知序列的核酸克隆要测定序列才能确知其结构、推测其功能，用进序列才能确知其结构、推测其功能，用进一步的研究。因此核酸序列测定是分子克一步的研究。因此核酸序列测定是分子克隆中必不可少的鉴定步骤。隆中必不可少的鉴定步骤。 人类对大肠杆菌经过长期的研究，对其特人类对大肠杆菌经过长期的研究，对其特性和遗传背景了解得最清楚，大肠杆菌培养操性和遗传背景了解得最清楚，大肠杆菌培养操作简单、生长繁殖快、价格低廉，人们用大肠作简单、生长繁殖快、价格低廉，人们用大肠杆菌用外源基因

49、的表达工具已有二十多年的经杆菌用外源基因的表达工具已有二十多年的经验积累，大肠杆菌表达外源基因产物的水平远验积累，大肠杆菌表达外源基因产物的水平远高于其它基因表达系统，表达的目的蛋白量甚高于其它基因表达系统，表达的目的蛋白量甚至能超过细菌总蛋白量的至能超过细菌总蛋白量的80%80%。因此大肠杆菌是因此大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统。目前应用最广泛的蛋白质表达系统。 要表达真核生物的蛋白质，采用真核表达系统自然要表达真核生物的蛋白质，采用真核表达系统自然应比原核系统优越，常用的酵母、昆虫、动物和哺乳类应比原核系统优越，常用的酵母、昆虫、动物和哺乳类细胞等表达系统。细胞等表达系统。真核表

50、达载体至少要含两类序列：真核表达载体至少要含两类序列：原核质粒的序列原核质粒的序列，包括在大肠杆菌中起作用的复制起始，包括在大肠杆菌中起作用的复制起始序列、能用在细菌中筛选克隆的抗药性基因标志等，以序列、能用在细菌中筛选克隆的抗药性基因标志等，以便插入真核基因后能先在很方便操作的大肠杆菌系统中便插入真核基因后能先在很方便操作的大肠杆菌系统中筛选获得目的重组筛选获得目的重组DNADNA克隆、并复制繁殖得到足够使用克隆、并复制繁殖得到足够使用的数量。的数量。在真核宿主细胞中表达重组基因所需要的元在真核宿主细胞中表达重组基因所需要的元件，件，包括启动子、增强子、转录终止和加包括启动子、增强子、转录终

51、止和加poly-Apoly-A信号序信号序列、列、mRNAmRNA剪接信号序列、能在宿主细胞中复制或增殖的剪接信号序列、能在宿主细胞中复制或增殖的序列，能用在宿主细胞中筛选的标志基因、以及供外源序列，能用在宿主细胞中筛选的标志基因、以及供外源基因插入的单一限制性内切酶识别位点等。基因插入的单一限制性内切酶识别位点等。 一、疾病基因的发现及治疗一、疾病基因的发现及治疗 二、生产蛋白质和多肽类活性物质二、生产蛋白质和多肽类活性物质 三、制备基因工程疫苗三、制备基因工程疫苗 四、改造物种特性四、改造物种特性 五、动物克隆五、动物克隆 六、其它应用六、其它应用把把大大鼠鼠生生长长因因子子基基因因转转入

52、入小小鼠鼠得得到到巨巨大大型型的的转转基基因因小小鼠。鼠。美国转基因猪，其体内含有人类的基美国转基因猪，其体内含有人类的基因，乳汁含有人体蛋白因，乳汁含有人体蛋白fator。只。只需需300600只这样的母猪就能满足只这样的母猪就能满足全世界对这种蛋白的需求。全世界对这种蛋白的需求。 研究中心的杰拉德研究中心的杰拉德斯卡腾博士说，这些克隆斯卡腾博士说，这些克隆猴将用于人类糖尿病和帕金森氏病的研究。猴将用于人类糖尿病和帕金森氏病的研究。 不易腐烂的番茄不易腐烂的番茄 兔毛棉花在我国培育成功：兔毛棉花在我国培育成功：用兔的一种角蛋白转化棉花，用兔的一种角蛋白转化棉花，棉花纤维质量好，具有兔毛般棉花

53、纤维质量好，具有兔毛般的光泽。的光泽。转基因食品转基因食品“分子生物学研究方法分子生物学研究方法”思考题：思考题：1 1、常用的核酸的凝胶电泳是哪两种？它们分辨、常用的核酸的凝胶电泳是哪两种？它们分辨DNADNA片段的范围有何片段的范围有何不同？不同？2 2、核酸的分子杂交的概念？、核酸的分子杂交的概念？ Southern Southern 印迹法、印迹法、Northern Northern 印迹法印迹法和和Western Western 印迹法的检测对象分别是什么？印迹法的检测对象分别是什么？3 3、PCRPCR定义？简述聚合酶链式反应的基本原理？定义？简述聚合酶链式反应的基本原理？4 4、

54、核酸测序的常用方法有哪些？、核酸测序的常用方法有哪些？5 5、列出用于基因克隆的主要工具酶。、列出用于基因克隆的主要工具酶。6 6、限制性核酸内切酶的命名原则。、限制性核酸内切酶的命名原则。7 7、载体的概念。根据它的作用可分为哪两种类型？作为克隆载体、载体的概念。根据它的作用可分为哪两种类型？作为克隆载体必须具备的基本条件是什么？必须具备的基本条件是什么？8 8、基因工程、基因工程( (重组重组DNA)DNA)的基本原理的基本原理( (主要步骤主要步骤) )？9 9、基因组文库、基因组文库( (genomic library) )的概念。的概念。 cDNAcDNA文库的概念。文库的概念。1010、怎样获得目的、怎样获得目的DNADNA片段？目的基因与载体的连接方式有哪些？片段？目的基因与载体的连接方式有哪些？1111、目的基因的筛选和鉴定常用的遗传学检测法有哪些？、目的基因的筛选和鉴定常用的遗传学检测法有哪些？