光合细胞产氢过程中能质传输及超声强化特性的研究（可编辑）

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1、 重庆大学博士学位论文光合细胞产氢过程中能质传办理及超声强化特性研究姓名:谢学旺申请学位级别:博士专业:指导教师:朱恂20110602中文摘要摘 要化石能源价格不断攀升,能源短缺日益成为困扰社会发展的首要问题,同时化石燃料的过量开采对自然环境造成了严重破坏,而氢气燃烧热值高,燃烧产物为水,不释放危害环境的产物,因此被广泛地认为是最具潜力的清洁能源。在多种制氢技术中,光合细菌制氢具有光谱响应范围广、能量转化效率高、反应条件温和、环境友好的优点,非常有利于实现能源的可持续发展。光合细菌的能质传输特性的研究对于解决光合细胞的传输限制性问题,以及光生物制氢中光能利用率低、产氢速率低等问题,具有重要的作

2、用。目前关于光合细菌产氢机理的研究较少,尤其在光合细菌产氢过程中光能的光生化反应和碳源底物的跨膜传输特性方面,已有的研究大多是在细胞结构被破坏的条件下研究光能捕获与电子传递,没有将光能的传递与细胞内物质代谢联系起来。本文采用前期筛选、纯化的高效产氢光合菌沼泽红假单胞.为实验菌种,系统研究了在序批式培养过程中光合细菌的生物学特性以及生长产氢动力学特性;并从光能和底物传递以及微生物代谢的角度研究了底物浓度、值、光波长、光照强度等参数对反应器内光衰减特性、光合细菌的光合色素和细胞内含量、光合细胞膜的渗透系数和细胞内葡萄糖浓度的影响,分析了光衰减对平板式光生物反应器产氢性能的影响,以及光能和底物传输与

3、光合细菌产氢速率的关系,建立了光生物制氢反应器中光衰减系数关联式和光合细菌的葡萄糖跨膜传输及代谢产氢的单细胞模型;同时为了强化光合细菌产氢过程中的能质传输特性,本文进一步研究了在序批式和连续流两种超声波光生物反应器中超声功率、超声时间、底物浓度、光照等操作参数对光合细菌产氢性能的影响。主要研究成果如下:实验获得了沼泽红假单胞菌的生长繁殖方式、菌体生长产氢过程中的形态变化以及菌体活细胞的光谱吸收特性,同时揭示了不同初始底物浓度、初始值、光波长、光照强度下光合细菌的比生长速率、底物比消耗速率、比产氢速率等动力学特性的变化规律。在序批式光生物制氢反应器中,研究了光路长度、细菌浓度、入射光波长和入射光

4、照强度等操作参数下光合细菌的光衰减特性,实验结果表明:在可见光波段范围内,光衰减系数随着光波长的增加而减小,而随着细菌浓度的增加而增加;同时拟合得到光衰减系数与光波长和细菌浓度的实验关联式,结果表明计算值与实验测量值吻合较好。同时研究还发现,光衰减对光合细菌的生长产氢特性影响很大,在较短光路长度、高光照强度下光合细菌的生长速率最快,并且达到重庆大学博学位论文最大产氢速率的时间较早,在光路长度为. 时光生物反应器综合产氢性能/,最佳,此时反应器的产氢速率为. /,葡萄糖消耗速率为.产氢得率为./.,光能转化效率为%。研究了初始底物浓度、初始值、光波长和光照强度对光合细菌产氢过程中光合色素和细胞内

5、含量的影响,实验结果表明:细菌叶绿素和类胡萝卜素具有不同的合成机制,在光波长为 、初始底物浓度为 、初始值为.时,其细菌叶绿素和类胡萝卜素含量最大为. / 和./ ,产氢速率最大为. / /。对光合细菌的葡萄糖跨膜传输特性进行了研究,并且结合定律和.方程计算得到细胞内葡萄糖浓度和光合细胞膜的渗透系数,结果表明:葡萄糖跨膜传输速率最大为./ /,光合细胞膜的最大渗透系数基本维持在儋 /左右。同时建立了光合细菌的葡萄糖跨膜传输及代谢产氢的单细胞模型,分析了光合细菌细胞内、外葡萄糖浓度和氢气浓度分布特性。研究了超声波对光合细菌产氢特性的影响,实验发现:超声波可以增加光合细胞膜的通透性,促进碳源有机底

6、物的跨膜传输;超声波可以释放液相中的氢气,降低氢分压对光合细菌产氢的抑制作用。在序批式超声波反应器中,反应器/、.的最大产氢速率、产氢得率、能量转化效率分别为./.、%。而在连续流超声波光生物反应器中,其最大产氢速率、/、.产氢得率和能量转换效率分别为./.、和.%,可见序批式反应器比连续流反应器具有较高的产氢得率和能量转化效率,而连续流反应器却具有较大的产氢速率,并且还发现在超声波作用下的光合细菌与未超声作用的光合细菌相比产氢速率至少可提高.倍。关键词:光合细菌,产氢,光能传递,跨膜传输,超声强化英文摘要 , ., , , ., .,. . .,.,诚。,. , .,.重庆大学博士学位论文

7、,. , , ,.:, , ,. , , . 、, ,.,、析. . , . ,龇. ./?/, %. , ., . / ,.,英文摘要 .,. / , . /./ .,/ /嬲 / /., . ., , ., ,., , ./,. %,?/?,.叭.?/, .%,. 、访、析. ?.: ,符号说明符号说明超声功率溶液对光谱的吸光度反应器进口流量/光合细菌细胞内含量比产氢率细菌叶绿素含量/啦底物比消耗速率.【宦% 细菌浓度/ 啦蠕动泵转速转/类胡萝卜素含量/光合细菌产氢速率细胞外葡萄糖浓度/ %/ /反应器产氢速率/光合色素的平均吸收系数】订 暑:%, 、 .、时刻细胞外葡萄糖浓度 底物消耗速

8、率/水 取底物浓度/ 反应时间锈初始底物浓度/ 每次超声时间培养温度生物量干重光通过溶液的距离锄 反应器内菌悬液体积产氢得率光照强度/入射光照强度 /葡萄糖跨膜传输速率光衰减系数.丫/ /葡萄糖酶酵解速率米氏常数/ /葡萄糖最大反应速率光路长度/溶液的摩尔吸收系数反应器液相氢浓度/心葡萄糖降解效率%时刻的菌体干重 接种量% 光能转化效率%耻细胞个数个, 总能量转化效率%砸光合细胞膜渗透系数九入射光波长姗/ /比生速率。培养液值州绪论绪论.前言能源是提高人民生活质量的主要物质基础,是制约国民经济发展的重要因素,同时也是维护国家安全的战略保障。当今社会最广泛使用的能源主要是煤、石油、天然气和水力,

9、特别是石油和天然气的消耗量增长迅速,已占全世界能源消费的%左右。然而化石能源价格持续上涨,能源短缺日益困扰国家和政府的发展规划,能源问题已成为影响国民经济发展和国家安全的重中之重:同时化石能源的使用对环境造成了严重的影响和破坏,温室效应、酸雨、臭氧层空洞等问题严重地威胁着地球和人类的可持续发展。因此从国家能源安全和环境保护角度考虑,改变能源生产和消费方式,促使人们开发环境友好和经济适用的可再生能源已经迫在眉睫。年月日至日,首届全球替代能源大会在德国慕尼黑举行,与会代表们强烈呼吁各国政府和公民从现在开始真正认识到替代能源的重要性和紧迫性。年月日我国正式施行中华人民共和国可再生能源法,充分体现了政

10、府对可再生能源开发的高度重视。年月日至日在丹麦首都哥本哈根召开的气候峰会上,温家宝总理提出,到年单位国内生产总值二氧化碳排放要比年下降%一%,这一标准的制定标志着我国正式加入减碳行列,大力发展新能源技术势在必行。在这种可再生能源和低碳生活的强烈呼吁下,氢气因具有燃烧热值高,燃烧产物为水,不会生成碳氧化物、氮氧化物、硫氧化物、碳氢化物、灰尘及其它污染物,易于通过合理的技术获得等优点,而被广泛地认为是不可再生能源煤、石油、天然气等化石燃料的潜在替代能源,是“世界上最干净的的能源”,是世纪的可再生“能源之星”【刁】。目前,氢气的主要生产原料来自于煤、石油、天然气等化石能源和植物、动物等生物质能。采用

11、化石能源制氢的方式主要有:石油的高温氧化裂解制氢、天然气或汽油催化重整制氢、热裂解煤炭制氢等方式,而利用生物质制氢主要是高温气化生物质。其中生产使用的氢气约有%来自轻油或天然气的催化重整,这类消耗化石能源制取氢气的方式尚存在很多不足:制取氢气需要高温高压的环境,而且以消耗化石能源为代价,属于能量密集型产业,生产成本较高,对自然环境造成严重的污染,不利于大规模发展,其经济适用性不强。当今使用光电技术和电解技术相结合制取氢气的方法也是方兴未艾,但是太阳光辐射到地球表面的能量较低,单位面积接收到的光能量仅为 ,因此需要建造巨大的光能接收面以收集足够多的太阳能,同时这种方法最大不足是较高的投资成本和高

12、技术要求,重庆大学博士学位论文这将极大地限制其大规模的推广和应用。利用微生物的代谢能力将有机废弃物转化成氢气的方法具有许多优点:可以直接利用可再生资源植物、动物等生物质和水等做为产氢原料,利用地球最充足的太阳光能,同时实现了环境治理和可再生能源的制取,而且微生物法制氢设备简单,操作方便,可以大规模发展,经济适用性强,投资较省,产生的氢气可以直接供应燃料电池生成电能【】。在微生物制氢中光合产氢微生物种类繁多、易于获得,可以在沙漠等光照充足的自然环境中培养,应用前景广阔。因此光生物制氢属于非能量密集型产业,对其产氢特性的研究对于解决能源短缺、环境污染和社会的可持续发展具有重要意义。目前在光合细菌光

13、合产氢机理的研究仍然处于探索阶段,已进行的较多研究工作主要是在物质代谢与能量代谢相分离的情况下进行,而且在光合系统中的光能捕获吸收和传递过程中没有考虑碳源底物传输代谢对光能传输的影响】。因此单纯的、没有与碳源底物传输代谢相耦合的光子捕获吸收和光合电子传递的研究具有一定的局限性,不利于从光合细菌的能质传输特性和转化机制上解决光合细菌的产氢机理。光合细菌是单细胞微生物,是生理代谢作用的基本单元,利用“三传一反理论研究光合细菌的反应动力学,进一步推广到整个菌群,并与反应器内的“三传一反”理论结合,从微观角度出发解决宏观反应器内的反应、传递及反应器放大问题是目前生化工程的前沿课题【。而目前国内外关于生

14、化工程的研究多偏重于生物过程,或只考虑宏观统计,在生物本质探讨和工程研究间缺乏有机的联系。因此,从光合细菌的微观反应机理和能质传输特性出发,研究细胞基质的跨膜输运、胞内物质转化以及与光能吸收、转化之间的相互影响关系,对研究光合细菌生长产氢动力学特性,提高光合细菌的产氢速率和光能转化效率,实现过程的优化控制和工程放大,具有非常重要的工程意义和学术价值。.光合细菌光合产氢基本原理目前产氢微生物的种类繁多,结果如表.所示,主要包括:光合细菌、厌氧发酵产氢菌、蓝细菌和藻类。按从营养类型可划分为三种方式:光能异养型、光能自养型和化能异养型;按从培养细菌产氢方式可分为:光合细菌光酵解碳源底物产氢、厌氧发酵

15、菌酵解有机物产氢、光合细菌与发酵细菌混合生长代谢产氢、藻类和蓝细菌的生物光解水产氢刀。但是发酵制氢的相对产氢率较低,从热力学角度上可知其不利于大量生产,同时厌氧发酵菌产氢过程中易生成大量的二氧化碳,产氢纯度低【;从底物到氢气的理论能量转化效率较低,最大转化率仅为%,有机底物转化时生成大量的有机酸,因此其在经济和环保方面不十分有利训。光合微藻和蓝细菌制氢过程中存在产氢酶系统的抑制,低光照强度下转化率低,太绪论阳能的非有效利用,氧的敏感性及低周转次数等缺点。表.产氢微生物的类型及方法璺垒曼:垒呈垒堡堕垫曼竺型璺盟坚垒曼型坠堑旦曼旦坚旦垒竖堕旦里.生物类型 优点 缺点 代表种氢酶在吸氢方向上起利用水

16、为底物产氢 海绵状念珠蓝细菌蓝细菌作用,副产物对固固氮酶催化产氢氮酶有抑制作用利用水产氢,太阳能 莱茵衣藻副产物对产氢系统绿藻 转化率高,是绿色植有抑制作用物的倍 发酵液需要处理,以大肠杆菌可昼夜持续产氢,利厌氧细菌 防止水污染,有用碳源底物范围广生成可利用有机废水为底 发酵液需要处理,以 沼泽红假单胞菌光合细菌 物产氢,吸收利用较 防止水污染,有也丝童塑堂堕奎圈堂 生盛光合细菌在光能驱动下以碳源有机物为原料,光酵解有机物产生,属于光能异养型,光合细菌只有光合作用系统 ,同时产生还原力的电子来自环境中的无机物或有机物。光合细菌产氢的优点主要包括:分解有机废弃物特别是琥珀酸、苹果酸、乙酸等小分子

17、有机酸产生氢气,环境友好无污染,有利于实现能源的可持续发展;能够有效利用碳源底物、能广泛的使用生物质作为生长和产氢的原料,具有较广的吸收光谱范围? ,代谢过程中不产生对产氢酶有抑制作用的氧气,产氢纯度高,氢能来自生物质能和太阳能,能量理论转化率高,易于大规模生产、能耗低、无污染、操作简单【;同时光合细菌菌种易于驯化培养,对有机物新陈代谢途径形式多样【,不存在光合系统【。将厌氧发酵产氢细菌和光合细菌相结合的产氢系统能有效地处理有机废弃物,同时高效地产生氢气,该技术对有机废物的再利用与环境保护将具有广阔的应用前途睨引。一般而言,光合细菌产氢其实就是消耗细胞内部多余的能量、电子和质子,维持细胞生理代

18、谢平衡的过程,光合细菌产氢机理如图.所示。光合细菌可利用醇类、糖类、多种二羧酸、低级脂肪酸、芳香族化合物等有机物,为光合细菌代谢产氢提供质子和电子。,但是由于碳源底物进入光合细菌的传输方式不同以及内部代谢途径存在多样性,以致光合细菌的产氢能力存在差异,这种差重庆大学博士学位论文异性主要是因为光合细菌在厌氧光照条件下形成还原性质子的能力不同而造成的。光合细菌在固氮酶的催化下,消耗光合磷酸化合成的,同时利用铁氧还蛋白或黄素蛋白传递到固氮酶上的光合电子,在固氮酶的钼铁蛋白上使碳源代谢生成的质子还原而产生 。光合细菌产氢机理可用化学式.表示:一?竺塑坚竺竺生专, “】目前,研究发现光合细菌产氢过程受到

19、诸多因素的影响,如碳源类型、底物浓度、光照条件、氮源、离子浓度、氢分压、温度和值等,而碳源底物及光照是光合细菌生长的主要能量来源,是影响光合细菌产氢的重要因素。图.光合细菌光合产氢的传递过程 .光合细菌可广泛利用多种有机物如糖类、醇类以及多种酸类作为碳源,进行不同代谢途径的生长产氢。不同碳源有机物的跨膜传输方式不同,在光照厌氧条件下光合细菌代谢生成质子一的能力存在差异,光合细菌内矿积累所形成的还原力和光能激活的光合电子相互作用在固氮酶上释放出,。式.为光合细菌利用不同碳源有机底物产氢的化学方程式:.葡萄糖:.乙酸:.醋酸:.丁酸:.乳酸:.琥珀酸:绪论.苹果酸:.谷氨酰胺:;碳源底物是影响光合

20、细菌生长和产氢性能的重要因素,当底物浓度过低时,营养物质分子较少,细菌代谢活性下降,导致光合细菌生长缓慢或停止生长,产氢速率很低;当底物浓度过高时,就会增大细胞膜内外的渗透压,对细菌的生长代谢产生毒性,损伤细胞内酶的活性,抑制光合细菌产氢。孙琦等【】研究发现碳源底物乳酸浓度低于 /时,细菌产氢水平较低,此时底物浓度限制菌体的生长和代谢。当碳源底物浓度高于/时,发现前期筛选纯化的株细菌中有株出现不产氢现象。结果表明高底物浓度对光合细菌产生抑制,菌体产氢的葡萄糖最适浓度为/,而乙酸、乳酸和丁酸的最适浓度为/./。刘双江等【从湖泊中筛选出株产氢量较高的紫色非硫光合细菌,研究发现在含有 /谷氨酸钠和/

21、苹果酸培养基中,两株光合细菌均可连续稳定产氢.天,产氢速率分别为.和./。张全国等【】研究了畜禽粪便污水原料浓度对红假单胞菌.菌株进行光合产氢的影响规律,结果表明,光合产氢量与原料浓度成正比,当禽畜粪便污水中的含量为/时光合细菌体积产率可达. /。尉,单位体积产氢率达.等研究了四种不同有机酸乙酸、乳酸、丁酸和苹果酸作为碳源底物时三株光合细菌.,和未鉴定菌株的产氢过程,由于碳源底物的种类不同,所以提供光合细菌产氢的电子能力迥异,结果表明 .的产氢能力最强,在光照度为/下最大产氢速率为 /。廖裂等研究了初始底物浓度对序批式培养光合细菌 生长及产氢过程的影响,结果发现光合细菌生长产氢过程中的最适底物

22、浓度为 /,初始底物浓度低于或高于该浓度时,光合细菌生长、降解及产氢过程都受到限制性或抑制性影响,且抑制性影响较限制性影响效果更明显。太阳能是地球上最丰富清洁的一种可再生能源,每年辐射到地球上的能量是全人类年耗能的万多倍。探索研究高效利用太阳能作为光源的光生物制氢技术,对大力发展生物制氢技术,降低生产工艺的成本,促进国内外生物制氢技术产业化具有深远的意义。地球表面接受的太阳辐射能,大约%的能量在可见光谱范.围区波长为 ,%在紫外光谱范围区波长 ,%在红外光谱范围区波长 ,其最大能量分别在光波长 处。太阳能辐射经大气层的吸收、反射、散射,到达地表位置的紫外光谱范围区几乎绝迹,在可见光谱范围区减少

23、至%,而在红外光谱范围区的辐射能增至%。地球表重庆大学博士学位论文明接收太阳光的光强辐射分布,如图.所示。.一童竹旨害一蔷可茁.协图.地面接收太阳光的相对光强分布】.光合细菌依靠自身光合色素捕获光能,通过光合磷酸化过程最终将光能转化为氢气的化学能。增大光照强度能够提高固氮酶的活性和合酶的合成能力,从而能够为光合细菌提供更多的能量和光合电子,提高光合细菌的产氢速率。当光照强度小于光合细菌的极限值时,产氢量随着光照强度的增大而增加。当超过极限值时,光合系统吸收了过多的光能,从而引起了光合反应中心的光合电子过量激发,光合系统效率下降,菌体产氢受到抑制。在较高的光强照射时需要减少光合细菌的捕光光合色素

24、的数量,因为在较高光强下,含量较多的光合色素天线与光合反应中心之比导致了光合系统中光子的过量激发,造成光子能量的浪费,对菌体造成光损伤。因此光源类型、光照强度和光照形式对光合细菌生长产氢有着显著影响。王永忠等【】研究了沼泽红假单胞菌产氢过程中光波长及光照强度对产氢量、光能光生化转化率、底物能量光生化转化率及合成生物量的能量消耗率影响。结果表明:产氢过程受光照强度及光波长共同影响,不同波长光引起的色素分子能级跃迁形式不同,产生不同的光化学途径,低光照强度下,主要进行葡萄糖发酵,光照强度适宜,则以产氢代谢为主,高光照强度下,则对生理代谢产生抑制作用。张全国等研究了光照强度对光合菌群高效产氢过程的影

25、响规律。结果表明:高,最大产氢量达到效产氢光合菌群的良好产氢工艺条件为:光照强度. /。等设置自然光和人工控光对光照和黑暗交替循环绪论下光合细菌产氢特性进行对比实验,结果显示自然交替循环状态下最大光转化效率是人工控制最大光转化效率的.倍。说明自然形式光源是光合细菌生长和产氢的最佳光源形式。等】研究了在厌氧光照条件下紫色非硫光合细菌.的产氢特性,在不同光照波长、光照强度以及光照/黑暗交替时间下,在玻璃光生物反应器中光合细菌的产氢特性不同。结果表明:在光强达到饱和/之前,光合细菌的产氢速率随着光强的增大而增大,而且在缺少红外线波长.时光合细菌的产氢速率下降了%,而且光照/黑暗交替的不同操作对光合细

26、菌的生长产氢特性影响也较大。这是因为在无光照作用下,光合细胞的呼吸作用增强,从而促进大量合成;光合细菌在太阳光照作用下产氢时,由于菌体光合作用增大,细胞内积累了大量的,从而极大提高了细胞内代谢酶的活性,加快了光合细菌的产氢速率。徐向阳和朱核光等分别利用红假单胞菌株和、,以有机废水为碳源底物,研究光合细菌的生长产氢特性,结果均表明光合细菌产氢速率随着光强的增大而增大。总之,光合细菌生长产氢、底物消耗代谢和光能利用过程同其它细菌一样受多种因素的影响,虽然氧、吸氢酶活性、气相成分、值及温度等影响光合细菌的生长产氢,但是碳源底物、光照条件被认为是影响光合细菌产氢的重要因素。目前仅对不同操作条件下光合细

27、菌生长代谢和产氢特性开展了少量的研究工作,等【】研究了生产尼生素菌的代谢过程中,值对菌体生长代谢的影响,并建立了初始值作用下菌体的生长代谢数学模型,研究结果表明细菌受值的影响较大。对底物浓度、光照、反应液值等因素对光合细菌生长、代谢方面的影响研究主要集中在食品科技和污水处理中,对光生物制氢方面光合细菌的研究报道较少,因此研究不同初始值、底物浓度、光照等操作条件下光合细菌的产氢动力学特性对今后的理论研究与工程应用具有非常重要的指导意义。.光合细菌细胞膜上光能传输及转化机制光合细菌只包括一套光合系统 进行厌氧光合产氢,其作用机制类似于海洋微藻、植物等的光合系统。如图.所示,光合细菌的光合作用可划分

28、为三个相互独立的反应过程【】: 光能的吸收与传递; 原初光化学反应;光合电子传递与相偶联的光合磷酸化。光合细菌中光能的吸收与传递过程是指捕光色素天线蛋白复合物吸收光能以及被激发的色素分子的能量在相邻分子间的传递,最终激发能被传递至光合系统单位的光化学反应中心,被细菌叶绿素分子吸是指辐射到天线色素蛋白的光子被捕获吸收。原初光化学反应收后传递到反应中心,同时激发该中心进行光化学反应的过程。原初光化学反应主要发生在光合细胞膜上的光合反应中心。光能的捕获、吸收与传递和原初光化重庆大学博士学位论文学反应都能够在非常短的时间内完成,一般反应时间维持在飞秒,至之间。电子传递与偶联的光合磷酸化过程是指在光化学

29、反应中皮秒,。心内,由原初光化学反应激发产生的光合电子在细菌叶绿素、细菌脱镁绿素和醌类等蛋白复合物之间相互传递,光合电子传递与质子传递相互偶联,从而影响光合细胞膜内外的质子浓度差,随后细胞膜内外两侧形成的质子浓度梯度驱动膜外质子进入细胞质中促进合酶合成。图 光合细胞膜上光能转化机制示意图【.光能的吸收与传递光具有波粒二象性,既可把光看作是一种频率很高的电磁波赫兹,也可把光看成是一个粒子,即光子。当光子照射到光合细菌时,细胞膜上的光合反应系统吸收光子的能量激发出电子,进行能量的捕捉和传递。光合细菌光合反,由外周天线蛋白 、内周天线应系统单位和反应中心等三部分组成。, 和等【.】蛋白对光合反应系统

30、的研究中表明:光合细菌的反应中心蛋白复合体已被分离提纯,含有细菌叶绿素、细菌脱镁叶绿素、泛醌及铁,并且通过射线晶体学的方法已经解析了具有原子分辨率的反应中心和外周天线蛋白的 的三维空间结构。掣对光合细菌捕光天线蛋白的研究认为, 由、亚基形成的二聚体聚集在一起成环形结构,从而成为叶绿素和胡萝卜素的支架。叶绿素在该支架上形成两个环形结构,而胡萝卜素则与蛋白质平行,横跨细胞膜。如图.所示,光子首先被外周天线蛋白 的叶绿素二聚体上的色素分子吸收,其中每个色素分子都具有特殊的吸收光谱带。等利用光子回声光谱绪论技术对紫色光合细菌的捕光色素蛋白的研究表明:外周天线蛋白、选择吸收合适的光照波长将捕获的能量传输

31、到内周天线蛋白,色素天线蛋白利用激子之间的相互作用调节波长来适应蛋白分子的光谱吸收。色素天线高效捕获太阳能后吸光分子处于一个较高的能态上,随着光激发的电子返回到基态,激发能量通过共振能传递邻近的内周天线蛋白 。由于各色素分子排列紧密,分子间存在着强耦合,光激子的传递速度非常快,色素分子吸收的激发能通过电荷分离及一系列电子传递步骤,最终将光子能量传给反应中心。图.光子激发能:色素分,问传递示意图【】 、,.,色素在光合作用中通常色素分子处于能级的最低状态一基态印分子吸收光能后产生激发态跃迁。色素分子吸收光子后,处于能级较低的电子便可作高速运动,在加速过程中该电子便可克服原子核的吸引力而达到能级较

32、高的激发态 。由于激发态十分的不稳定一般寿命约为培,因此就会通过辐射或非辐射的方式将光子能量释放衰减回到基态。激发能的转变方式主要包括色素分子间相互传递、色素蛋白发射荧光和放热等睁】。放热方式是指处于激发态的细菌叶绿素分子在能级降低时将吸收的光能以热的形式释放出去,该转变方式又称为无辐射激退 ,光合系统通过内转化方式可以在卅到 的时间内回到第一激发态。其中一部分光合色素的激发能以振动或转动的方式将能量散发出去,被激发态色素蛋白分子顺着由高到底的顺序跃迁。发射荧光是指处于激发态的光合色素分子耗散能量回至基态时,可以光子的形式将捕获的光能释放。在细菌叶绿素分子第一单线态激发后回到基态时所发射的光称

33、为荧光重庆人学博士学位论文。由于色素分子振动时需要消耗一部分能量,而该能量是由细菌叶绿素分子吸收的光能提供的,且荧光辐射一般是从第一单线态的最低能级开始的,所以辐射出的光能会有损耗,一定低于色素分子吸收的光能。色素分子间的能量传递是指被光子激发的色素分子将能量传递给相邻基态的同种或异种分子从而重新回到基态的过程。在光合细胞膜上,捕光色素蛋白复合物的激发能亦能够通过色素蛋白分子相互作用进行传递,把吸收的光能经过一系列分子的传递到达光合作用中心,保证光化学反应能够持续有效的进行。光合细菌的捕光色素蛋白复合物和光化学反应中心的色素主要有类胡萝卜素和细菌叶绿素组成,类胡萝卜素所吸收的光能传给细菌叶绿素

34、的效率高达%以:【。?图. 共振传递理论示意图【. 光合色素分子吸收光子能量后其激发能的释放不是靠分子之间的相互碰撞,也不是依靠分子问的电子传递,而是以“共振传递”或“激子传递”的方式来实现的。光合细菌色素蛋白复合物吸收捕获光子后,被激发的色素分子从基态直接跃迁至较高的能量状态?激发态。激发能的传递主要包括共振传递和激子传递两种方式,传递是在光合色素分子的振子辐射场作用下,耦合供体分子荧光峰和受体分子吸收峰来实现激发能的传递。这种能量的释放并不需要两个分子的能每或分子中原子的组织结构完全相同,其实影响共振传递重要参数仅是分子问交角和两者距离。如图.所示,激子传递方式是指在相同分子内依靠激子传递

35、来转移能量的方式,其对分子的要求更加严格,仅适用于分子间距离小于,研究发现激发能的传递速率与色素分子距离的立方成反比 。激发能小仪是指吸收太阳光的色素分子,时它可能是绪论某一区域的捕光色素系统集体所共用。.原初光化学反应原初光化学反应是光合细胞膜中的光合作用中心对光能转化的一个最关键的反应过程。原初光化学反应是通过将色素分子的电荷分离把吸收的光子能量转换成不同色素分子的电动势,从而在光化学反应中生成一个强氧化剂和一个强还原剂。如图.所示反光合细菌的光化学反应中心空间分布,该中心结构特征已得到人们的广泛认可。它含有个细菌叶绿素分子,这些色素分子排列为近似对称的条电子传递链。其中原初反应的电子供体

36、是由个细菌叶绿素分子组成的个特殊的”细菌叶绿素,它是原初光化学反应过程中的电子供体;在这条电子传递链上分别包括个脱镁细菌叶绿素分子,该分子是光合细菌进行原初光化学反应的原初电子受体;在光合电子传递链上细菌叶绿素和脱镁细菌叶绿素之间还包括个“辅助”细菌叶绿素分子,从而为光合电子的传递提供了沟通桥梁【缱】。等旧】分离出了紫色光合细菌的光合反应中心,对不同色素蛋白的吸收特性进行了研究,并且利用荧光衍射技术、光子反射光谱研究了反应中心的电子和能量传递以及分析了反应中心的高效率能量转化,揭示了.的物化特性可以用来调节反应中心的氧化还原电势。反应中心是一个大的蛋白复合体,受到激子的激发后,反应中心的细菌叶

37、绿素分子由基态变成激发态释放出电子。释放出的电子经细菌叶绿素单体到达细菌脱镁叶绿素分子,细菌脱镁叶绿素分子将它获得的电子传递给紧密结合的醌,结果产生细菌叶绿素和细菌脱镁叶绿素分子的两个自由基【】:.,叫砌,:.?叫一图.光合细凶光化反戍中已、空间分布图. 重庆大学博士学位论文在细菌叶绿素的特殊对中,由于激发能传递过程中激子之间的相互偶合作用产生两个不同的吸收带,而且分别对应于在和两侧的两个细菌叶绿素分子的对称跃迁和非对称跃迁两种方式,因此相互作用的细菌叶绿素分子间作用力较强。就紫色非硫光合细菌的光合作用中心而言,较低激发态为非对称状态,在 左右时对光子的吸收能力最强,当用该波长的激发色素分子时

38、易于导致电荷的分离。近年来对辅助细菌叶绿素向双分子的激发能传递过程,许多学者采用多种泵浦探测技术进行了探测研究。等【】用波长分别为、和 的光合作用中心,的激光脉冲,激发.和 。从而得到激发能从?传递过程的动力学常数为。等【】用 的激光在 激发光化学反应中心得到的结果为 和从作用中心出来的一部分电子传递到泛醌。等【对泛醌的光合电子传递研究表明:泛醌通过醌/酚或醇结构的互变传递电子,还原型的醌可以在细胞膜的双层上自由扩散离开反应中心,进入溶于膜的还原醌库并通过膜双层的脂相移动到邻近的细胞色素。细胞色素把来自还原型醌的电子转运给细胞周质中的可溶性细胞色素。在电子传递过程中,细胞色素利用电子传送的能量

39、使其发生构象变化,将细胞内的质子泵到细胞膜的另一侧,产生质子浓度差。细胞色素可以在细胞质中自由移动,在接收到电子后并不能以稳态的形式存在,又将电子传递给作用中心的.型细胞色素亚基的个血红素,最终又将电子传递给反应中心的光化学活性分子细菌叶绿素?它是电子的直接供体【。反应中心的光化学活性分子得到电子后回到基态,准备再一次吸收光子,启动下一次循环。.光合电子传递及耦合的光合磷酸化在光合细菌产氢过程中,光合电子传递链由光子在光合反应系统的捕获和传递和激发的光合电子在光合细胞膜上的传递分配两部分组成,如图.所示。光子能量通过光合电子的传递到达反应中心后,使光化学活性分子处于激发态,激发态的活性分子衰减

40、回到基态是一个非常迅速的过程,大约在左右光子的能量转变为热的形式而散发出去,但是作用中心的特殊结构防止了这种内转换引起的低效率。和王水才等【】对光合系统中光合电子传递的研究表明:作用中心的各种成分之间的关系是固定不变的,光在传递时不存在概率碰撞或随机扩散的问题,保证光反应高效、快速的进行,在光系统单位进行光合电子循环的过程中,光合电子传递反应快而且在热力学上其自由能是不断降低的。根据吉布斯自由能定律,当标准自由能变化为负值时反应才能自发进行,因此电子传递过程中被激发的细菌叶绿素是一个很好的电子供体,相继的电子传递每次都是传给标准还原电势高的受体,电子传递反应才能够自发进行。而等网利用模型自组方

41、法学的理论组建了一种人工超分子光能转化系统单位,通过实验研究和绪论理论分析其光能转换效率可以提高到%以上,从而为光合细菌光合电子传递机制的研究提供了新的起点。一图.光合细菌光合电子传递机制.光合电子传递链的分析有利于从光合细菌微观角度分析细胞内的能量代谢机制,为理论计算光合细菌产氢时的光能利用率提供基础。但值得指出的是,光合细菌需要消耗碳源底物来维持自身的生命活动,而碳源大分子一般不能通过浓度差自由扩散到细胞内部,它进入细胞内部是与光合细菌质子泵的作用机制是密切相关的,而质子泵的作用又与光合电子传递过程相互偶联。通过对质子动力势作用机制的分析,有利于了解光合电子传递过程的能量转化,计算与质子泵

42、作用相关的物质跨膜传递量,分析光合细菌产氢过程中合酶的作用机制。光合细菌内质子作用机制如图.所示。在光合电子传递过程中,当还原型醌从光合反应中心运动到细胞色素时还原型醌被氧化释放出两个质子,并且将其放出的电子传递给细胞色素,这种光驱动的循环式电子流为细胞色素泵送质子提供能量。细胞色素还具有吸收质子的功能,细胞质中的运动到色素时释放出质子,与还原型醌释放的质子共同存在细胞色素中。在光合循环电子流的作用下并且利用氧化释放的能量,质子与电子在细胞膜上进行交替传递,使质子从细胞质膜内侧向外侧定向转移。由于细胞膜对旷的不通透性,从而在细胞膜内外两侧形成跨膜的质子梯度差。细胞膜内外两侧形成的质子浓度梯度驱

43、动膜外质子通过合酶进入细胞质中,因此质子形成的动力势与合酶的作用机制密切相关。合酶广泛存在于光合细菌的细胞质膜上,但是合酶催化合成的具体作用机制不是十分重庆大学博士学位论文清楚瞰,只有在对合酶的晶体结构解决之后合酶的作用机制才有可能得到解决。年英国提出化学渗透假说,认为跨膜质子梯度差催化了合酶形成的作用,与内外质子梯度差有关如图.。美国在化学渗透假说的基础上对合酶合成的机制提出了构象变化假说。【弱认为氧化所释放的能量通过合酶催化亚基的构象变化导致的合成。驱动酶的亚基构象变化所需的能量是由跨膜质子梯度提供的。【跖】研究还表明:在一定条件下,也可以通过水解所释放的能量借助驱动旷的主动跨膜运送形成跨

44、膜质子梯度有机物进行三羧酸循环产生的矿,但是在生理条件下合酶主要是合成。图.光合细菌质子作用机制示意图.光合磷酸化是光合细菌产氢的主要能量来源,分析合酶的作用机制是在微观尺度研究光合细菌产氢量的关键因素。细胞色素复合体的晶体结构已经解决,这些复合物在还原型醌被分解时有利于催化促进电子向细胞色素的传递。王德国等对质子泵出的分子机理的分析认为,细胞膜内侧的质子利用电子传递过程中氧化释放的能量通过细胞色素向细胞膜外泵送,调节细胞质的质子浓度,从而建立了细胞膜内外的质子浓度梯度【。等【】通过质子诱导的实验,研究了跨膜电位和膜内外差值对合酶作用机制的影响,首次提供了质子动力势与合酶的作用机制相关的实验证

45、据。通过对光合细菌质子动力势作用机制的分析,细胞膜内外质子浓度差直接或间接影响着合酶光合磷酸化过程。因此光合电子传递及耦合的光合磷酸化过程的研究对光合细菌的光合磷酸化、物质的跨膜传递理论的建立以及提高光合细菌的产氢量、产氢率都起到了至关重要的作用明。绪论.光合细菌碳源底物跨膜传输及代谢特性碳源底物是影响光合细菌生长和制氢最重要的因素。光合细菌可以利用不同碳源底物进行生长代谢,但是不同底物条件下光合细菌的产氢差异较大,主要是由于碳源有机物分子进入光合细菌细胞内的传输方式不同,以及在厌氧条件下代谢产生还原性质子旷的能力存在差异。如图.所示,光合细菌利用底物进行降解产氢可分成四个阶段【删: 底物在水

46、相中的传递; 底物与细胞的有效接触; 底物的跨膜传递; 底物在细胞内的降解产氢。图.碳源底物跨膜传输及代谢产氢示意图 .碳源底物的跨膜传输特性在光合细菌消耗有机物进行生长代谢过程中,一方面碳源代谢生成的氧化磷酸化为菌体进行生命活动提供能量,另一方面为固氮酶的催化产氢提供还原力【】。光合细菌利用碳源代谢的过程可分为两个步骤:首先是在一定的细胞膜通透性下碳源底物通过跨膜传输进入细菌细胞内,该过程的传输能力可以用底物跨膜传输速率进行衡量;其次是进入胞内的底物在代谢酶催化下快速被降解,该过程可以用光合细菌的底物消耗速率进行阐述。许多研究学者发现:光合细菌利用碳源底物的与产氢速率关系密切【,如果碳源底物

47、的代谢速率增加会在一定程度上促进有利于光合细菌的产氢。而碳源底物的跨膜传输过程是光合细菌代谢产氢的重要过程,对光合细菌的生长繁殖和降解有机废弃物有着重要影响。因此,碳源底物的跨膜传输过程及其对光合细菌产氢速率的影响等问题,受到许多研究重庆大学博十学位论文学者的关注一引。在光生化转化过程中,细胞的物质输运、合酶的作用机制以及光合电子链的传递几乎都在细胞膜上完成,光合细胞膜的结构模型基于年美国的。物质穿越细胞膜和提出的液态镶嵌模型的方式主要有三种:被动运输、主动运输、胞吞作用。在光生物制氢过程中微生物代谢产物主要是小分子有机酸、和,对于这些气体小分子可以在浓度差的驱动下直接通过细胞膜的磷脂层自由扩

48、散到细胞外;而对于脂肪酸、二羧酸、葡萄糖、醇类、芳香族化合物等小分子碳源底物来说,进出细胞膜主要是通过易化扩散或主动运输来完成的。瀣豢溢册繁图.葡萄精的跨膜传输过群,意名.叫.葡萄糖的跨膜传输主要有两种方式:被动运输简单扩散和协同扩散与主动运输。葡萄糖既可以通过被动运输的方式直接通过细胞膜的孔道,又可以通过协助扩散的方式与细胞膜上的载体蛋白相结合,通过细胞膜的构象变化作用直接通过细胞膜,即在光合细胞膜上质子泵在消耗能量传递质子的同时将葡萄糖分子传递到细胞膜内。由于细胞内和细胞外的葡萄糖浓度般维持在相对恒定的水平,而细菌需要不断消耗葡萄糖来进行生命活动和代谢产氢,从而使其细胞内葡萄糖不断被代谢酶

49、降解,于是在光合胞膜上载体蛋白的帮助下葡萄糖分子不断进入细菌内。当葡萄糖分子以主动运输方式进入细胞时,传输速率主要与细胞膜内外质子浓度差、细胞内氧化还原电位等因素相关,结果如图.所示。绪论目前,对于在葡萄糖跨膜传输特性的分析主要是以理论与实验相结合的方式,而且大多数理论模型一般均是建立在.酶反应动力学理论方程上,其中以和与和等研究学者为代表,建立了以米氏方程为基础的理论模型:?.历丝丝一,:矿懿.,:哗鱼一警鱼 一戢/%圯巧:瓯.其中恤为细胞内外净传输速率,分别为底物进入细胞内及由细胞内传递到细胞外的速率;丫一,忱。麟分别为底物进入细胞内及由细胞内传递到细胞外的最大通量;,分别为底物在培养液中

50、及底物在细胞质中与载体的亲和常数;,分别为细胞外和细胞内的底物浓度。同时在葡萄糖简单扩散理论的基础上,以菲克定律为基础,建立了相应的理论模型:.彳,?。?,弓?.其中丫为葡萄糖传输速率,为细胞表面积与培养基体积比,为活细胞所占比例;为葡萄糖的扩散通量,为扩散系数,分别为细胞内、外的葡萄糖浓度。无论.模型还是简单扩散模型,胞内葡萄糖浓度对葡萄糖跨膜传输模型的构建和计算都有重要意义。然而由于细胞内葡萄糖浓度很低,通过实验直接测量比较困难,因此尚未见到关于细胞内葡萄糖浓度测量的报道。并且在计算葡萄糖渗透系数时,主要以自由扩散理论为基础,将细胞内浓度假设为零,这样得到的结果又会带来一定的误差。目前,光

51、合细菌产氢特性的研究主要集中于光合细菌产氢机理、产氢工艺、产氢动力学等方面【.删,而对光合细菌产氢过程中碳源底物跨膜传输的研究较少。等【 】研究结果表明:在低、中、高葡萄糖浓度下 的葡萄糖跨膜传输过程主要以自由扩散为主,而葡萄糖的跨膜传输速率主要受菌体的代谢能力所限制。和等【】以自由扩散理论为基础建立了的葡萄糖跨膜传输模型,将该模型应用于其它不同发酵类型时葡萄糖的跨膜传输特性都得到了合理解释。掣对细胞膜上的载体蛋白运输物质的特性进行了研究,通过线性四段模型建立了物质跨膜传输的定量方程,为促进细胞膜的高效率传递奠定了重要基础。杨玉敏等引入有载体参与的主动运输过程来来描述植物细胞生物碱的跨膜传递过

52、程,并将.酶促反重庆大学博士学位论文应动力学公式应用于载体转运,建立了植物细胞中产物释放的饱和特性模型。同时他们在中性生物碱饱和特性模型的基础上,引入膜电位的影响,考虑生物碱阳离子通量对总生物碱扩散通量的影响,从而导出膜电位影响的饱和特性模型。为建立描述生物碱跨膜传递过程的普适性模型提供了理论基础。刘晔等【】研究了烃的选择性跨膜传递,发现对于各单组分烃,跨膜传输效率没有很大差异,在混合烃的竞争性传输实验中,膜表现出显著的选择性。等叫研究了细胞质中葡萄糖跨膜传输的本质特性,发现葡萄糖的传输过程与质子的传输依赖性较大,并通过对葡萄糖扩散传输过程的研究,建立了饱和系统下物质协同运输的数学模型。光合细

53、菌需要消耗碳源底物维持自身的生命活动,因此碳源底物的跨膜传输对光合细菌的生长代谢有着重要的影响。虽然对碳源底物的跨膜传输有许多学者进行了研究,但以光生物制氢为背景,针对光合细胞膜对碳源底物跨膜传输特性的研究,尤其是结合碳源底物代谢和光能传输利用分析光合细菌产氢特性的研究尚未见报道。本课题以光合细菌为研究对象,开展关于光合细菌细胞底物跨膜传输的相关实验,对光合产氢菌沼泽红假单胞菌的葡萄糖跨膜传递过程进行研究,建立葡萄糖跨膜传递量与浓度差的相关模型,为从微观角度分析光合细菌底物传输、消耗以及产氢提供了理论基础。.碳源底物的代谢特性根据大量文献报道,光照强度、波长、底物浓度、产物浓度、值、温度、氧、

54、吸氢酶活性和气相成分等被认为是影响光合微生物产氢的重要因素。大多研究者都在宏观水平上对这些影响参数进行研究,但是细胞是微生物生理代谢作用的基本单元,通过研究细胞微观结构和反应传输机理来获得光合细胞的碳源底物代谢特性,将会对光合细菌的能质传输机理和特性的研究起到重大的指导作用。光合细菌代谢碳源底物产氢的基本方程式为:.?/一研究表明光合细菌光产氢的总代谢路径为:,?啼 光合细菌细胞内葡萄糖的代谢示意图见图.。葡萄糖的光酵解途径中,葡萄糖在一系列酶的催化下,经步反应降解为分子丙酮酸,同时产生分子旷和分子。主要步骤:葡萄糖磷酸化形成二磷酸果糖:二磷酸果糖分解成为磷酸甘油醛和磷酸二羟丙酮,二者可以互变

55、:磷酸甘油醛脱去及磷酸变成丙酮酸,脱去的被所接受,形成?。绪论分子图. 葡萄糖酵解过程示意刚】 .内酮馥一一囊纛?乐卜。,暖辅砖图.三羧酸循环示意刚叫.在细胞质中,磷酸葡萄糖经氧化阶段和非氧化阶段被氧化分解为,同时产生旷。其主要过程是.脱氧生成.磷酸葡萄糖酸,再脱氢,脱羧生成核酮糖.磷酸。分子核酮糖.磷酸经转酮反应和转醛反应生成分子.磷酸葡萄糖。中间产物甘油醛.磷酸,果糖.磷酸与糖酵解相衔接;核糖.磷酸是重庆大学博士学位论文合成核酸的原料,.磷酸赤藓糖参与芳香族氨基酸的合成;旷提供各种合成代谢所需要的还原力【眇】。在厌氧条件下,丙酮酸氧化脱羧生成的乙酰辅酶,再与草酰乙酸缩合成柠檬酸,进入三羧酸

56、循环。柠檬酸经脱水加水转变成异柠檬酸,异柠檬酸经连续两次脱羧和脱羧生成琥珀酰;琥珀酰发生底物水平磷酸化产生分子和琥珀酸;琥珀酸再脱氢,加水及再脱氢作用依次变成延胡索酸,苹果酸及循环开始的草酰乙酸。三羧酸循环每循环一次放出分子,产生分子旷,和一分子【,。丙酮酸代谢可生成乳酸、乙酸和乙醇等,同时得到再生,使糖酵解过程持续进行。.超声波技术在微生物中的应用在微生物的生长代谢过程中将超声波技术引入,可借助于外界物理环境的刺激,来缩短微生物生长适应期的时间和提高有益次生代谢产物的产量,从而提高工业生产效率,降低生产成本。研究结果表明: 超声波可以促进底物分子与微生物之间的相互作用,强化底物分子进入以及代谢产物离开代谢酶中心的过程,提高酶反应的活性; 超声波可以改变细胞膜的渗透性,强化碳源底物的跨膜传输,促进有益产物的生成; 超声波可以加快细胞的新陈代谢速率,促进细胞的生长繁殖; 增加细胞膜的通透性,有利于细胞吸收生命活动所需要的物质【孓引。因此,超声波技术应用于微生物领域,建立了以生物科学为中心的交叉学科,声学向生物科学领域的积极渗透,使两个研究领域得以交叉融合。超声波是一种物理能,其频率高于 ,方向性好,穿透能力强,易于获得较集中的能量。超声波在物质介质中进行传播时一般会形成介质粒子的机械振动,这种超声粒子的振动可以在亚微观尺度上产生加热作用、机械传