生物化学考研课件

《生物化学考研课件》由会员分享，可在线阅读，更多相关《生物化学考研课件（106页珍藏版）》请在装配图网上搜索。

1、第三章第三章 酶学酶学 主要内容主要内容：介绍酶的概念、作用特点介绍酶的概念、作用特点和分类、命名，讨论酶的结构特征和催化和分类、命名，讨论酶的结构特征和催化功能以及酶专一性及高效催化的策略，进功能以及酶专一性及高效催化的策略，进而讨论影响酶作用的主要因素而讨论影响酶作用的主要因素。对酶工程对酶工程和酶的应用作一般介绍。和酶的应用作一般介绍。思考思考目目 录录第一节第一节 酶的概念及作用特点酶的概念及作用特点第二节第二节 酶的命名和分类酶的命名和分类第三节第三节 酶催化作用的结构基础和酶催化作用的结构基础和 高效催化的策略高效催化的策略第四节第四节 酶促反应的动力学酶促反应的动力学第五节第五节

2、 重要的酶类及酶活性的调控重要的酶类及酶活性的调控第六节第六节 酶工程简介酶工程简介第一节第一节 酶的概念及作用特点酶的概念及作用特点一 、酶及生物催化剂概念的发展、酶及生物催化剂概念的发展 极高的催化效率极高的催化效率 高度的专一性高度的专一性 易失活易失活 活性可调控活性可调控 有些酶需辅助因子有些酶需辅助因子四、四、 酶专一性类型酶专一性类型 二、二、 酶作用的特点酶作用的特点三、三、 酶的化学本质酶的化学本质酶及生物催化剂概念的发展酶及生物催化剂概念的发展克隆酶、遗传修饰酶克隆酶、遗传修饰酶蛋白质工程新酶蛋白质工程新酶生物催化剂生物催化剂（Biocatalyst）蛋白质类：蛋白质类：

3、Enzyme (天然酶、生物工程酶天然酶、生物工程酶)核酸类：核酸类：Ribozyme ; Deoxyribozyme模拟生物催化剂模拟生物催化剂 酶专一性类型酶专一性类型1 结构专一性结构专一性 概念概念：酶对所催化的分子（底物，酶对所催化的分子（底物，Substrate）化化学结构的特殊要求和选择学结构的特殊要求和选择 类别类别：绝对专一性绝对专一性和相对专一性和相对专一性2 立体异构专一性立体异构专一性 概念概念：酶除了对底物分子的化学结构有要求外，：酶除了对底物分子的化学结构有要求外，对其立体异构也有一定的要求对其立体异构也有一定的要求 类别类别：旋光异构专一性旋光异构专一性和和几何异

4、构专一性几何异构专一性绝对专一性和相对专一性绝对专一性和相对专一性 绝对专一性绝对专一性 有的酶对底物的化学结构要求非常严格，有的酶对底物的化学结构要求非常严格，只作用于一种底物，不作用于其它任何物质。只作用于一种底物，不作用于其它任何物质。 相对专一性相对专一性 有的酶对底物的化学结构要求比上述有的酶对底物的化学结构要求比上述绝对专一性略低一些，它们能作用于一类化合物或一种绝对专一性略低一些，它们能作用于一类化合物或一种化学键。化学键。 1） 键专一性键专一性 有的酶只作用于一定的键，而对键有的酶只作用于一定的键，而对键 两端的基团并无严格要求。两端的基团并无严格要求。 2）基团专一性基团专

5、一性 另一些酶，除要求作用于一定的键另一些酶，除要求作用于一定的键以外，对键两端的基团还有一定要求，往往是对其中一以外，对键两端的基团还有一定要求，往往是对其中一个基团要求严格，对另一个基团则要求不严格个基团要求严格，对另一个基团则要求不严格。消化道内几种蛋白酶的专一性消化道内几种蛋白酶的专一性（芳香）（芳香）（硷性）（硷性）（丙）（丙）胰凝乳胰凝乳蛋白酶蛋白酶胃蛋白酶胃蛋白酶弹性蛋白酶弹性蛋白酶羧肽酶羧肽酶胰蛋白酶胰蛋白酶氨肽酶氨肽酶羧肽酶羧肽酶消化道蛋白酶作用的专一性消化道蛋白酶作用的专一性据酶分子据酶分子组成分类组成分类单纯蛋白质酶类单纯蛋白质酶类结合蛋白质酶类结合蛋白质酶类酶蛋白质酶蛋

6、白质辅助因子辅助因子金属离子金属离子金属有机物金属有机物小分子有机物小分子有机物据酶蛋白据酶蛋白特征分类特征分类单体酶单体酶寡聚酶寡聚酶多酶复合体多酶复合体酶的化学本质及类别酶的化学本质及类别第二节第二节 酶的命名和分类（略讲）酶的命名和分类（略讲）一、一、 命名命名：习惯命名；系统命名习惯命名；系统命名二、二、 国际系统分类法及编号国际系统分类法及编号 *国际生物化学会酶学委员会（国际生物化学会酶学委员会（Enzyme Commsion）将酶将酶分成六大类：分成六大类：1.氧还原酶类氧还原酶类，2.移换酶类移换酶类，3.水解酶类水解酶类，4.裂合裂合酶类酶类，5.异构酶类异构酶类，6.合成酶

7、类合成酶类 * 每一种酶有一个编号每一种酶有一个编号,如乙醇脱氢酶如乙醇脱氢酶 EC 1. 1. 1. 27 大类大类 亚类亚类 亚亚类亚亚类 序号序号第三节第三节 酶催化作用的结构基础和酶催化作用的结构基础和 高效催化的策略高效催化的策略一、一、 酶催化的中间产物理论酶催化的中间产物理论二、二、 酶的活性中心酶的活性中心三、三、 酶作用专一性机理酶作用专一性机理四、四、 酶高效催化有关的策略酶高效催化有关的策略酶催化的中间产物理论酶催化的中间产物理论1kSE 1kES 2kEP E+SP+ EES能能量量水水平平反应过程反应过程 G E1 E2 酶（酶（E）与底物（与底物（S）结合生成不稳定

8、的中间结合生成不稳定的中间物（物（ES），），再分解成产再分解成产物（物（P）并释放出酶，使并释放出酶，使反应沿一个低活化能的反应沿一个低活化能的途径进行，降低反应所途径进行，降低反应所需活化能，所以能加快需活化能，所以能加快反应速度。反应速度。二、酶的活性中心二、酶的活性中心1、酶的活性中心和必需基团、酶的活性中心和必需基团 酶分子中直接与底物结合，并和酶催化作用直接有关的区酶分子中直接与底物结合，并和酶催化作用直接有关的区域叫酶的活性中心（域叫酶的活性中心（active center）或活性部位（或活性部位（active site），），参与构成酶的活性中心和维持酶的特定构象所必需的基参与

9、构成酶的活性中心和维持酶的特定构象所必需的基团为酶分子的必需基团。团为酶分子的必需基团。实例；胰凝乳蛋白酶（实例；胰凝乳蛋白酶（chymotrypsin） 羧肽酶（羧肽酶（ribonuclease）2、酶的活性的研究、酶的活性的研究 活酶的专一性研究活酶的专一性研究 酶分子的化学修饰：差示标记法，亲和标记法酶分子的化学修饰：差示标记法，亲和标记法 X-射线衍射法射线衍射法AspHisSer胰胰凝凝乳乳蛋蛋白白酶酶的的活活性性中中心心活性中心重要基团活性中心重要基团: His57 , Asp102 , Ser195为为Tyr 248为为Arg 145为为Glu 270为底物为底物Zn羧肽酶活性中

10、心示意图羧肽酶活性中心示意图差差示示标标记记法法图图解解RRRRR*A.非差非差示标记示标记B. 差示差示标记标记RRR*R(底物底物)亲和标记法亲和标记法 根据酶与底物特异结合的性质，设计或合成一根据酶与底物特异结合的性质，设计或合成一种含有反应基团的底物类似物作为活性部位基团的种含有反应基团的底物类似物作为活性部位基团的标记试剂。这种试剂象底物一样进入活性部位，接标记试剂。这种试剂象底物一样进入活性部位，接近结合位点，并以其活泼的化学基团与活性部位的近结合位点，并以其活泼的化学基团与活性部位的某一基团共价结合，而指示出酶活性部位的特征某一基团共价结合，而指示出酶活性部位的特征。+ X-Y

11、三、酶作用专一性机理三、酶作用专一性机理 锁钥学说锁钥学说(lock and key th0ery)：将酶的活性中心将酶的活性中心比喻作锁孔，底物分子象钥匙，底物能专一性地插入比喻作锁孔，底物分子象钥匙，底物能专一性地插入到酶的活性中心。到酶的活性中心。 诱导契合学说诱导契合学说(induced-fit hypothesis)：酶的活性中酶的活性中心在结构上具柔性，底物接近活性中心时，可诱导酶心在结构上具柔性，底物接近活性中心时，可诱导酶蛋白构象发生变化，这样就使使酶活性中心有关基团蛋白构象发生变化，这样就使使酶活性中心有关基团正确排列和定向，使之与底物成互补形状有机的结合正确排列和定向，使之

12、与底物成互补形状有机的结合而催化反应进行。而催化反应进行。酶专一性的酶专一性的“锁钥学说锁钥学说”酶专一性的酶专一性的“诱导契合学说诱导契合学说”四、酶高效催化的策略四、酶高效催化的策略 1、 邻近与定向效应邻近与定向效应 2、 诱导契合与底物扭曲变形诱导契合与底物扭曲变形 3、 共价催化共价催化 4、 酸硷催化酸硷催化 5、微环境影响、微环境影响实例实例: lysozyme chymotrypsin carboxypeptidase RNase酶分子中可作为亲核基团和酸硷催化的功能基团酶分子中可作为亲核基团和酸硷催化的功能基团ZnZnGlu270Tyr248Arg145底物底物 羧羧肽肽酶酶

13、结结合合底底物物前前后后构构象象变变化化差差示示标标记记法法图图解解RRRRR*A.非差非差示标记示标记B. 差示差示标记标记RRR*R(底物底物)溶菌酶催化的反应溶菌酶催化的反应NAG:N-乙酰氨基葡萄糖乙酰氨基葡萄糖NAM:N-乙酰氨基葡萄糖乳酸乙酰氨基葡萄糖乳酸 溶菌酶溶菌酶-底物复合物底物复合物ABCDEF酶切位点酶切位点溶菌酶活性中心与底物结合示意图溶菌酶活性中心与底物结合示意图AsP52Glu35（极性区）（极性区）（非极性区）（非极性区）溶菌酶底物溶菌酶底物D环变形模型环变形模型 溶菌酶催化反应机理溶菌酶催化反应机理C1+非极性区非极性区极性区极性区HO - E环环HH2O（广义

14、酸碱催化）（广义酸碱催化） 羧肽酶活性中心羧肽酶活性中心Zn2+的中心作用的中心作用羧肽酶活性中心必需基团与羧肽酶活性中心必需基团与底物间的结合底物间的结合ZnZn羧羧肽肽酶酶结结合合底底物物前前后后构构象象变变化化羧肽酶活性中心的共价催化机理羧肽酶活性中心的共价催化机理 145羧肽酶活性中心的共价催化机理羧肽酶活性中心的共价催化机理 145 RNase-底物复合物底物复合物RNase活性中心的酸硷催化机理活性中心的酸硷催化机理核糖核酸链受核糖核酸链受Rnase水解的位点水解的位点Py为嘧啶，为嘧啶，B为嘌呤为嘌呤胰凝乳蛋白酶分子胰凝乳蛋白酶分子中催化三联体构象中催化三联体构象His57Asp

15、102Ser195Asp102His57Ser195His57102AspSer195A.酶分子中的电荷中继网酶分子中的电荷中继网B.加上底物后，从加上底物后，从Ser转移一个质子给转移一个质子给His，带正电荷的咪唑基通过带负电荷的带正电荷的咪唑基通过带负电荷的Asp静电静电相互作用被稳定相互作用被稳定Ser195102AspHis57底物底物胰凝乳蛋白酶反应的详细机制（胰凝乳蛋白酶反应的详细机制（1）结合底物结合底物His57 质子供体质子供体形成共价形成共价ES复合物复合物C-N键断裂键断裂底物底物胰凝乳蛋白酶反应的详细机制（胰凝乳蛋白酶反应的详细机制（2） 氨基产物释放氨基产物释放四面

16、体中间物四面体中间物的瓦解的瓦解水亲核攻击水亲核攻击羧基产物释放羧基产物释放H2OR-NH2第四节第四节 酶促反应的动力学酶促反应的动力学二、影响酶作用的因素二、影响酶作用的因素 1、酶浓度、酶浓度 2、底物浓度、底物浓度 3、pH 4、 温度温度 5、激活剂、激活剂 6、抑制剂、抑制剂一、酶的活力与测定一、酶的活力与测定酶促反应速度的测定与酶的活力单位酶促反应速度的测定与酶的活力单位1、酶促反应速度的测定、酶促反应速度的测定 初速度的概念初速度的概念2、酶活力、酶活力3、酶活力的表示方法酶活力的表示方法4、酶活力测定方法酶活力测定方法：终点法终点法 动力学法动力学法 检测酶含量及存在，很难直

17、接用酶的检测酶含量及存在，很难直接用酶的“量量”（质量、体积、（质量、体积、浓度）来表示，而常用酶催化某一特定反应的能力来表示浓度）来表示，而常用酶催化某一特定反应的能力来表示酶量酶量，即用酶的活力表示。，即用酶的活力表示。 酶催化一定化学反应的能力称酶活力，酶活力通常以最适条酶催化一定化学反应的能力称酶活力，酶活力通常以最适条件下酶所催化的化学反应的速度来确定。件下酶所催化的化学反应的速度来确定。酶促反应初速度的概念酶促反应初速度的概念斜率斜率=P/ t = V（初速度初速度）Pt酶活力测定方法酶活力测定方法 终点法终点法: 酶反应进行到一定时间后终止其反应，酶反应进行到一定时间后终止其反应

18、，再用化学或物理方法测定产物或反应物量的变化。再用化学或物理方法测定产物或反应物量的变化。 动力学法动力学法:连续测定反应过程中产物连续测定反应过程中产物底物或辅酶底物或辅酶的变化量，直接测定出酶反应的初速度。的变化量，直接测定出酶反应的初速度。 酶活力的表示方法酶活力的表示方法活力单位活力单位（active unit） 习惯单位（习惯单位（U）: 底物底物(或产物或产物)变化量变化量 / 单位时间单位时间 国际单位（国际单位（IU）: 1moL变化量变化量 / 分钟分钟 Katal（Kat）：）：1moL变化量变化量 / 秒秒比活力比活力=总活力单位总活力单位总蛋白总蛋白mg数数= U(或或

19、IU) mg蛋白蛋白量度酶催化能力大小量度酶催化能力大小转换系数转换系数（Kcat） 底物（底物（ moL）/ 秒秒每个酶分子每个酶分子量度酶纯度量度酶纯度比活力比活力（specific activity）量度转换效率量度转换效率2、底物浓度对酶反应速度的影响、底物浓度对酶反应速度的影响 酶反应速度与底物浓度的关系曲线酶反应速度与底物浓度的关系曲线 （MichaelisMenten曲线）曲线） 米氏方程的提出及推导米氏方程的提出及推导 米氏常数的意义米氏常数的意义 米氏常数的测定米氏常数的测定单分子酶促反应的米氏方程及单分子酶促反应的米氏方程及Km推导推导原则原则：从酶被底物饱和的现象出发，按

20、照从酶被底物饱和的现象出发，按照 “稳态平稳态平 衡衡”假说的设想进行推导。假说的设想进行推导。1kSE 2kES3kEP SKSVvmmax132kkkKm米氏方程米氏方程:米氏常数米氏常数:酶反应速度与底物浓度的关系曲线酶反应速度与底物浓度的关系曲线米米氏氏方方程程的的推推导导 132kkkESSESSEt令令：Kmkkk132将将（4）代入代入（3），则，则： SKSVvmmax1kES 2kES3kEP ESEt SESES生成速度生成速度： SESEkvt11，ES分解速度分解速度：ESkESkv322即即： ESkESkSESEkt321则则： SSESESKmtE(1)经整理得经

21、整理得： SKSEmtES由于酶促反应速度由由于酶促反应速度由ES决定，即决定，即ESkv22kvES，所以所以(2)将将（2）代入代入（1）得得： SKSEkvmt2 SKSEkmt2v(3)当酶反应体系处于当酶反应体系处于恒态恒态时时：21vv 当当Et=ES时时，mVv tmEkV2(4)所以所以 米氏常数的意义米氏常数的意义* 当当v=Vmax/2时，时，Km=S（ Km的单位为浓度单位）的单位为浓度单位）* 是酶在一定条件下的是酶在一定条件下的特征物理常数特征物理常数，通过测定，通过测定Km的的数值，可鉴别酶。数值，可鉴别酶。* 可近似表示酶和底物亲合力，可近似表示酶和底物亲合力，K

22、m愈小，愈小，E对对S的亲合的亲合力愈大，力愈大，Km愈大，愈大，E对对S的亲合力愈小的亲合力愈小。在已知在已知Km的情况下，应用米氏方程可计算任意的情况下，应用米氏方程可计算任意s时的时的v，或任何或任何v下的下的s。（。（用用Km的倍数表示）的倍数表示） 练习题：已知某酶的练习题：已知某酶的Km值为值为0.05mol.L-1，要使此酶所催化的反要使此酶所催化的反应速度达到最大反应速度的应速度达到最大反应速度的80时底物的浓度应为多少？时底物的浓度应为多少？ 米氏常数的测定米氏常数的测定 基 本 原 则基 本 原 则 ： 将 米 氏 方 程 变 化 成 相 当 于将 米 氏 方 程 变 化

23、成 相 当 于y=ax+b的直线方程，再用作图法求出的直线方程，再用作图法求出Km。 例：例：双倒数作图法双倒数作图法（Lineweaver-Burk法）法） 米氏方程的双倒数形式：米氏方程的双倒数形式： 1 KmKm 1 1 = . + v Vmax S Vmax 酶动力学的双倒数图线酶动力学的双倒数图线3、pH对酶反应速度的影响对酶反应速度的影响 过酸过硷过酸过硷导致酶蛋白变性导致酶蛋白变性 影响底物分子解离状态影响底物分子解离状态 影响酶分子解离状态影响酶分子解离状态 影响酶的活性中心构象影响酶的活性中心构象pH最适最适 pHv4、温度与酶反应速度的关系、温度与酶反应速度的关系 在达到最

24、适温度以前，反在达到最适温度以前，反应速度随温度升高而加快应速度随温度升高而加快 酶是蛋白质，其变性速度酶是蛋白质，其变性速度亦随温度上升而加快亦随温度上升而加快 酶的最适温度不是一个固酶的最适温度不是一个固定不变的常数定不变的常数v温度温度5、激活剂、激活剂对酶作用的影响对酶作用的影响类别类别 金属离子：金属离子：K+、Na+、 Mg2+、Cu2+、Mn2+、Zn2+、Se3+ 、 Co2+、Fe2+ 阴离子：阴离子： Cl-、Br- 有机分子有机分子 还原剂：抗坏血酸、半胱氨酸、谷胱甘肽还原剂：抗坏血酸、半胱氨酸、谷胱甘肽 金属螯合剂：金属螯合剂：EDTA凡是能提高酶活性的物质，称为酶的激

25、活剂（凡是能提高酶活性的物质，称为酶的激活剂（activator） 6、抑制剂对酶作用的影响抑制剂对酶作用的影响 凡是使酶的必需基因或酶的活性部位中的基团凡是使酶的必需基因或酶的活性部位中的基团的化学性质改变而降低酶活力甚至使酶完全丧失的化学性质改变而降低酶活力甚至使酶完全丧失活性的物质，叫酶的抑制剂（活性的物质，叫酶的抑制剂（inhibitor） 。 类型类型：可逆抑制剂可逆抑制剂 不可逆抑制剂不可逆抑制剂 应用应用：研制杀虫剂、药物研制杀虫剂、药物 研究酶的作用机理，确定代谢途径研究酶的作用机理，确定代谢途径抑制剂类型和特点抑制剂类型和特点 竞争性抑制剂竞争性抑制剂可逆抑制剂可逆抑制剂 非

26、竞争性抑制剂非竞争性抑制剂 反竞争性抑制剂反竞争性抑制剂 非专一性不可逆抑制剂非专一性不可逆抑制剂不可逆抑制剂不可逆抑制剂 专一性不可逆抑制剂专一性不可逆抑制剂+IEIESP+ EE+S竞争性抑制作用竞争性抑制作用 实例：磺胺药物的药用机理实例：磺胺药物的药用机理H2N- -SO2NH2对氨基苯磺酰胺对氨基苯磺酰胺H2N- -COOH对氨基苯甲酸对氨基苯甲酸对氨基苯甲酸对氨基苯甲酸谷氨酸谷氨酸蝶呤蝶呤叶酸叶酸非竞争性抑制作用非竞争性抑制作用+IEI+SESIESP+ EE+S+I实例：重金属离子（实例：重金属离子（Cu2+、Hg2+、Ag+、Pb2+） 金属络合剂（金属络合剂（EDTA、F-、

27、CN-、N3-）反竞争性抑制作用反竞争性抑制作用ESIESP+ EE+S+I竞争性抑制作用竞争性抑制作用非竞争性抑制作用非竞争性抑制作用竞竞争争性性非非竞竞争争性性抑抑制制作作用用机机理理示示意意图图底物与酶专一性结合底物与酶专一性结合竞争性抑制曲线竞争性抑制曲线非竞争性抑制曲线非竞争性抑制曲线反竞争性抑制曲线反竞争性抑制曲线有无抑制剂存在时酶促反应的动力学方程有无抑制剂存在时酶促反应的动力学方程 非专一性不可逆抑制剂非专一性不可逆抑制剂 抑制剂作用于酶分子中的一类或几类基团，这些抑制剂作用于酶分子中的一类或几类基团，这些基团中包含了必需基团，因而引起酶失活。基团中包含了必需基团，因而引起酶失

28、活。类型类型：专一性不可逆抑制剂专一性不可逆抑制剂 这类抑制剂选择性很强，它只能专一性地与这类抑制剂选择性很强，它只能专一性地与酶活性中心的某些基团不可逆结合，引起酶的活酶活性中心的某些基团不可逆结合，引起酶的活性丧失。性丧失。 实例：实例：有机磷杀虫剂有机磷杀虫剂-Ser-OH-Ser-OPO-RO-ROPO-RO-ROX第五节第五节 重要的酶类及酶活性的调节控制重要的酶类及酶活性的调节控制一、多酶体系一、多酶体系(multienzyme system)二、别构酶二、别构酶(allosteric enzyme)三、共价调节酶三、共价调节酶(covalent regulatory enzyme

29、)四、酶原四、酶原(enzymogen或或proenzyme)的激活的激活五、同工酶五、同工酶(isoenzyme)六、抗体酶六、抗体酶(abzyme)一、多酶体系和多酶复合体一、多酶体系和多酶复合体 细胞中的许多酶常常是细胞中的许多酶常常是在一个连续的反应链中起在一个连续的反应链中起作用，即前一个反应的产作用，即前一个反应的产物是后一个反应的底物，物是后一个反应的底物，在完整细胞内的某一代谢在完整细胞内的某一代谢过程中，由几个酶形成的过程中，由几个酶形成的反应体系，称为多酶体系反应体系，称为多酶体系（multienzyme system）。）。 如果如果体系中几种酶彼此体系中几种酶彼此有机地

30、组合在一起。精巧有机地组合在一起。精巧地镶嵌成一定的结构，即地镶嵌成一定的结构，即形成形成多酶复合体多酶复合体。这种结。这种结构即能提高反应途径的效构即能提高反应途径的效率，又能增强调控的准确率，又能增强调控的准确性。性。分散多酶体系与中分散多酶体系与中间物示意图间物示意图多酶复合体示意图多酶复合体示意图二、酶的别构（变构）效应和别构酶二、酶的别构（变构）效应和别构酶 概念概念：酶分子的非催化部位与某些化合物可逆地非共价结合后导致酶分子酶分子的非催化部位与某些化合物可逆地非共价结合后导致酶分子发生构象改变，进而改变酶的活性状态，称为酶的别构调节发生构象改变，进而改变酶的活性状态，称为酶的别构调

31、节(allosteric regulation)，具有这种调节作用的酶称别构酶具有这种调节作用的酶称别构酶(allosteric enzyme)。别构酶促别构酶促反应底物浓度和反应速度的关系不符合米氏方程，呈反应底物浓度和反应速度的关系不符合米氏方程，呈S型曲线型曲线。 凡能使酶分子发生别构作用的物质称为效应物凡能使酶分子发生别构作用的物质称为效应物(effector)，通常为小分子代通常为小分子代谢物或辅因子。如因别构导致酶活性增加的物质称为正效应物谢物或辅因子。如因别构导致酶活性增加的物质称为正效应物(positive effector)或别构激活剂，反之称负效应物或别构激活剂，反之称负效

32、应物(negative effector)或别构抑制剂。或别构抑制剂。 别构调节普遍存在于生物界，许多代谢途径的关键酶利用别构调节来控别构调节普遍存在于生物界，许多代谢途径的关键酶利用别构调节来控制代谢途径之间的平衡，研究别构调控有重要的生物学意义。制代谢途径之间的平衡，研究别构调控有重要的生物学意义。 实例实例：天冬氨酸转氨甲酰酶：天冬氨酸转氨甲酰酶 （anspartate transcarbamoylase，ATCase） 别构酶活性调节机理别构酶活性调节机理：序变模型和齐变模型：序变模型和齐变模型酶的别构（变构）效应示意图酶的别构（变构）效应示意图效应剂效应剂别别构构中中心心活性活性中心

33、中心别构酶的反馈调控机理别构酶的反馈调控机理A （产物或中间产物）产物或中间产物）EDCB关键酶关键酶 a-非调节酶非调节酶 b-正协同别构酶正协同别构酶 的的S形曲线形曲线 别构酶与米氏酶的动力学曲线比较别构酶与米氏酶的动力学曲线比较1-非调节酶非调节酶2-正协同别构酶正协同别构酶3-负协同别构酶负协同别构酶 正、负协同别构酶与非调节酶的动力学曲线比较正、负协同别构酶与非调节酶的动力学曲线比较ATCaseATP+ATCase所催化的反应所催化的反应氨甲酰磷酸氨甲酰磷酸天冬氨酸天冬氨酸CTP-UTPUMP氨甲酰天冬氨酸氨甲酰天冬氨酸E.coli的的ATCase的亚基排列的亚基排列催化催化(C)

34、亚基（亚基（catalytic subunit）调节调节(R)亚基（亚基（ regulative subunit）ATCase的半分子结构ATCase半分子半分子（C3R3)的结构的结构CTP sitecatalytic siteATCase aloneATCase -PALA complex ATCase的的别构过度作用别构过度作用低催化活性构象低催化活性构象T(tense) - 态态CCCCCC R R R R R RCCCCCC高催化活性构象高催化活性构象R(relax) -态态R RR RR RPALAPALAPALA(N-磷乙酰磷乙酰-L-天冬氨酸天冬氨酸)结合到结合到ATCase活

35、性中心的模型活性中心的模型ATCase变构效应的动力学特征变构效应的动力学特征ATP（正效应剂）正效应剂）CTP（负效应剂）负效应剂）低催化活性构象低催化活性构象T(tense) - 态态CCCCCC R R R R R RCCCCCC高催化活性构象高催化活性构象R(relax) -态态R RR RR RVmax1/2VmaxKm别构酶的序变模型别构酶的序变模型SS SS SSSSSSSSSS亚基全部亚基全部处于处于R型型亚基全部亚基全部处于处于T型型依次序变化依次序变化别构酶的齐变模型别构酶的齐变模型S SSSS SSS SST状态（对称亚基）状态（对称亚基）T状态（对称亚基）状态（对称亚基

36、）SSSS对称亚基对称亚基对称亚基对称亚基齐步变化齐步变化三、酶的共价修饰三、酶的共价修饰 某些酶可以通过其它酶对其多肽链上某些基团进行可逆的共某些酶可以通过其它酶对其多肽链上某些基团进行可逆的共价修饰，使其处于活性与非活性的互变状态，从而调节酶活性价修饰，使其处于活性与非活性的互变状态，从而调节酶活性。这类酶称为。这类酶称为共价修饰酶共价修饰酶。目前发现有数百种酶被翻译后都要。目前发现有数百种酶被翻译后都要进行共价修饰，其中一部分处于分支代谢途径，成为对代谢流进行共价修饰，其中一部分处于分支代谢途径，成为对代谢流量起调节作用的量起调节作用的关键酶或限速酶关键酶或限速酶。 由于这种调节的生理意

37、义广泛，反应灵敏，节约能量，机制多样，在体由于这种调节的生理意义广泛，反应灵敏，节约能量，机制多样，在体内显得十分灵活，加之它们常受激素甚至神经的指令，导致级联放大反应，内显得十分灵活，加之它们常受激素甚至神经的指令，导致级联放大反应，所以日益引人注目。所以日益引人注目。 AP1GEDCBHEa-bEc-dEc-g关键酶（限速酶）关键酶（限速酶）P2蛋白激酶蛋白激酶ATPADP蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质Pn蛋白磷酸酶蛋白磷酸酶nPiH2O反应类型反应类型 共价修饰共价修饰 被修饰的氨基酸残基被修饰的氨基酸残基共共价价修修饰饰反反应应的的例例子子磷酸化磷酸化腺苷酰化腺苷酰化尿苷酰化尿苷酰化Tyr,

38、Ser,Thr.HisTyrTyr甲基化甲基化GluS-腺苷腺苷-MetS-腺苷腺苷-同型同型 Cys 级联系统调控级联系统调控糖原分解示意图糖原分解示意图意义意义：由于由于酶的共价修饰酶的共价修饰反应是酶促反反应是酶促反应，只要有少应，只要有少量信号分子量信号分子（如激素）存（如激素）存在，即可通过在，即可通过加速这种酶促加速这种酶促反应，而使大反应，而使大量的另一种酶量的另一种酶发生化学修饰，发生化学修饰，从而获得放大从而获得放大效应。这种调效应。这种调节方式快速、节方式快速、效率极高。效率极高。肾上腺素或肾上腺素或胰高血糖素胰高血糖素1、腺苷酸环化酶、腺苷酸环化酶（无活性）（无活性）腺苷

39、酸环化酶（活性）腺苷酸环化酶（活性）2、ATPcAMPR、cAMP3、蛋白激酶、蛋白激酶（无活性）（无活性）蛋白激酶（活性）蛋白激酶（活性）4、磷酸化酶激酶、磷酸化酶激酶（无活性）（无活性）磷酸化酶激酶（活性）磷酸化酶激酶（活性）5、磷酸化酶、磷酸化酶 b（无活性）无活性）磷酸化酶磷酸化酶 a（活性）活性）6、糖原、糖原6-磷酸葡萄糖磷酸葡萄糖1-磷酸葡萄糖磷酸葡萄糖葡萄糖葡萄糖血液血液ATP ADPATP ADP肾上腺素或肾上腺素或胰高血糖素胰高血糖素132 102 104 106 108葡萄糖葡萄糖456（极微量）（极微量）（大量）（大量） 四、酶四、酶 原原 的的 激激 活活 体内合成出

40、来的酶，有时不具有生物活性，经过体内合成出来的酶，有时不具有生物活性，经过蛋白水解酶专一作用后，构象发生变化，形成活性中蛋白水解酶专一作用后，构象发生变化，形成活性中心，变成有活性的酶。这个不具活性的蛋白质称为酶心，变成有活性的酶。这个不具活性的蛋白质称为酶原（原（zymogen或或proenzyme），），这个过程称为酶原的这个过程称为酶原的激活。激活。 该变化过程，是生物体的一种调控机制该变化过程，是生物体的一种调控机制 。这种调控。这种调控作用的特点是，蛋白质由作用的特点是，蛋白质由 无活性状态转变成活性状态无活性状态转变成活性状态是不可逆的。是不可逆的。实例实例：消化系统蛋白酶原的激活

41、：消化系统蛋白酶原的激活 凝血机制（自学）凝血机制（自学）胰蛋白酶原胰蛋白酶原胰蛋白酶胰蛋白酶六肽六肽肠肠激激酶酶活性中心活性中心胰蛋白酶原的激活示意图胰蛋白酶原的激活示意图胰蛋白酶原胰蛋白酶原胰蛋白酶胰蛋白酶六肽六肽肠肠激激酶酶胰蛋白酶对各种胰脏蛋白酶的激活作用胰蛋白酶对各种胰脏蛋白酶的激活作用胰凝乳蛋白酶原胰凝乳蛋白酶原胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶弹性蛋白酶原弹性蛋白酶原弹性蛋白酶弹性蛋白酶羧肽酶原羧肽酶原羧肽酶羧肽酶五、酶的多种分子形式五、酶的多种分子形式同工酶同工酶 概念概念：存在于同一种属或不同种属，同一个体的不同组织或同存在于同一种属或不同种属，同一个体的不同组织或同一组织、同一细胞，

42、具有不同分子形式但却能催化相同的化学反一组织、同一细胞，具有不同分子形式但却能催化相同的化学反应的一组酶，称之为同工酶应的一组酶，称之为同工酶（isoenzymeisoenzyme）。）。乳酸脱氢酶是研究的乳酸脱氢酶是研究的最多的同工酶。最多的同工酶。 生物学功能：生物学功能： 遗传的标志遗传的标志 和个体发育及组织分化密切相关和个体发育及组织分化密切相关 适应不同组织或不同细胞器在代谢上的不同需要适应不同组织或不同细胞器在代谢上的不同需要 在各学科中的在各学科中的应用应用乳酸脱氢酶同工酶形成示意图乳酸脱氢酶同工酶形成示意图多肽多肽亚基亚基mRNA四聚体四聚体结构基因结构基因a b乳酸脱氢酶同

43、乳酸脱氢酶同工酶电泳图谱工酶电泳图谱+H4MH3M2H2M3HM4点样线点样线不同组织中不同组织中LDH同工酶的电泳图谱同工酶的电泳图谱LDH1(H4)LDH2(H3M)LDH3(H2M2)LDH4(HM3)LDH5(M4)心肌心肌 肾肾 肝肝 骨骼肌骨骼肌 血清血清-+原点原点胰蛋白酶原胰蛋白酶原胰蛋白酶胰蛋白酶六肽六肽肠肠激激酶酶胰蛋白酶对各种胰脏蛋白酶的激活作用胰蛋白酶对各种胰脏蛋白酶的激活作用胰凝乳蛋白酶原胰凝乳蛋白酶原胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶弹性蛋白酶原弹性蛋白酶原弹性蛋白酶弹性蛋白酶羧肽酶原羧肽酶原羧肽酶羧肽酶同工酶在各学科中的应用同工酶在各学科中的应用 (1) 遗传学和分类学遗传

44、学和分类学：提供了一种精良的判别遗传标志的工具。：提供了一种精良的判别遗传标志的工具。(2) 发育学发育学：有效地标志细胞类型及细胞在不同条件下的分化情：有效地标志细胞类型及细胞在不同条件下的分化情况，以及个体发育和系统发育的关系。况，以及个体发育和系统发育的关系。(3) 生物化学和生理学生物化学和生理学：根据不同器官组织中同工酶的动力学、：根据不同器官组织中同工酶的动力学、底物专一性、辅助因子专一性、酶的变构性等性质的差异，从而底物专一性、辅助因子专一性、酶的变构性等性质的差异，从而解释它们代谢功能的差别。解释它们代谢功能的差别。（4）医学和临床诊断医学和临床诊断：体内同工酶的变化，可看作机

45、体组织损：体内同工酶的变化，可看作机体组织损伤，或遗传缺陷，或肿瘤分化的的分子标志。伤，或遗传缺陷，或肿瘤分化的的分子标志。六、六、抗体酶抗体酶 抗体酶（抗体酶（abzyme）又称催化抗体（又称催化抗体（catalytic antibody）,是指通过一是指通过一系列化学与生物技术方法制备出的具有催化活性的抗体，它除了具有相应系列化学与生物技术方法制备出的具有催化活性的抗体，它除了具有相应免疫学性质，还类似于酶，能催化某种活化反应。免疫学性质，还类似于酶，能催化某种活化反应。 抗体与酶相似，都是蛋白质分子，酶与底物的结合及抗体与抗原的结抗体与酶相似，都是蛋白质分子，酶与底物的结合及抗体与抗原的

46、结合都是高度专一性的，但这两种结合的基本区别在于酶与高能的过度态分合都是高度专一性的，但这两种结合的基本区别在于酶与高能的过度态分子向结合，而抗体则与抗原（基态分子）相结合。利用抗体能与抗原特异子向结合，而抗体则与抗原（基态分子）相结合。利用抗体能与抗原特异结合的原理可用过度态类似物作为半抗原来诱发抗体，这样产生的抗体便结合的原理可用过度态类似物作为半抗原来诱发抗体，这样产生的抗体便能特异地识别反应过程中真正的过渡分子，从而降低反应的活化能。达到能特异地识别反应过程中真正的过渡分子，从而降低反应的活化能。达到催化反应的目的，这种具有催化功能的抗体就被称为催化抗体或抗体酶。催化反应的目的，这种具

47、有催化功能的抗体就被称为催化抗体或抗体酶。 O C A. 酯酶的底酯酶的底物物酯酯B.酯的羧基碳酯的羧基碳原子受到亲核原子受到亲核攻击形成四面攻击形成四面体过渡态体过渡态C.设计的磷酸设计的磷酸酯类似物酯类似物,作作为抗原去免疫为抗原去免疫实验动物实验动物磷酸酯类似物磷酸酯类似物(半抗原半抗原)对酯水解反应有催化对酯水解反应有催化作用的单克隆作用的单克隆抗体抗体免疫免疫免疫反应免疫反应诱导法制备具有酯酶活性的抗体诱导法制备具有酯酶活性的抗体基因工程抗体酶的制备基因工程抗体酶的制备 对已产生的单抗，分析氨基酸的组成或相应基因的对已产生的单抗，分析氨基酸的组成或相应基因的碱基序列，对抗体结合的部位

48、的基因进行定位突变，在碱基序列，对抗体结合的部位的基因进行定位突变，在抗体结合部位换上有催化活性的氨基酸，基因工程的技抗体结合部位换上有催化活性的氨基酸，基因工程的技术使得建立抗体基因的组合文库，并根据需要构建适当术使得建立抗体基因的组合文库，并根据需要构建适当程序的基因片段成为可能。程序的基因片段成为可能。抗体酶的筛选抗体酶的筛选 在抗体酶研究中，一个不可少的步骤是在细在抗体酶研究中，一个不可少的步骤是在细胞融合后筛选到能分泌催化抗体的细胞克隆。胞融合后筛选到能分泌催化抗体的细胞克隆。一般的方法是先筛选其抗体能结合特异抗原的一般的方法是先筛选其抗体能结合特异抗原的细胞克隆，再从纯化的抗体中筛

49、选出有催化能细胞克隆，再从纯化的抗体中筛选出有催化能力的单抗。主要筛选方法有力的单抗。主要筛选方法有生物学筛选法生物学筛选法和和纯纯化学筛选法化学筛选法。抗体酶的研究和应用前景抗体酶的研究和应用前景 催化抗体的出现不仅为人们开创了一条人工设计酶的新催化抗体的出现不仅为人们开创了一条人工设计酶的新方法，也使人们对催化过程中催化剂的作用机理和催化剂方法，也使人们对催化过程中催化剂的作用机理和催化剂和底物的相互识别有了进一步认识。和底物的相互识别有了进一步认识。 目前已经发现具有催化作用的自身抗体在生物体内的存目前已经发现具有催化作用的自身抗体在生物体内的存在，其不仅和疾病相关，可能还参与了生物体内

50、的某些或在，其不仅和疾病相关，可能还参与了生物体内的某些或基本的生物学反应。有可能成为抗体酶研究的新热点。基本的生物学反应。有可能成为抗体酶研究的新热点。 充分利用抗体的种类繁多以及抗体酶的可诱导、可改造充分利用抗体的种类繁多以及抗体酶的可诱导、可改造的特点，可望制备出具有治疗和辅助治疗某些疾病或催化的特点，可望制备出具有治疗和辅助治疗某些疾病或催化某类具有特殊意义反应的抗体酶。某类具有特殊意义反应的抗体酶。 抗体酶的研究无疑会对化学、生物学、医学等领域产生抗体酶的研究无疑会对化学、生物学、医学等领域产生深远影响。深远影响。第六节第六节 酶工程简介酶工程简介一、化学酶工程一、化学酶工程 天然酶

51、天然酶 固定化酶固定化酶 化学修饰酶化学修饰酶 人工模拟酶人工模拟酶二、生物酶工程二、生物酶工程 克隆酶克隆酶 突变酶突变酶 新酶新酶 将酶学和工程学相结将酶学和工程学相结合，产生了酶工程合，产生了酶工程(enzyme engineering)这这样一个新的领域。酶工样一个新的领域。酶工程主要研究酶的生产、程主要研究酶的生产、纯化、固定化技术、酶纯化、固定化技术、酶分子结构的修饰和改造分子结构的修饰和改造以及在工农业、医药卫以及在工农业、医药卫生和理论研究等方面的生和理论研究等方面的应用应用。固定化酶固定化酶 将水溶性酶用物理或化学方法处理，固定于高分子支持物将水溶性酶用物理或化学方法处理，固

52、定于高分子支持物(或载体或载体)上而成为不溶于水，但仍有酶活性的一种酶制剂形上而成为不溶于水，但仍有酶活性的一种酶制剂形式，称固定化酶式，称固定化酶(immobilized enzyme)。包埋法包埋法 吸附法吸附法共价偶联法共价偶联法交联法交联法溴溴化化氰氰亚亚氨氨碳碳酸酸基基偶偶联联法法OHOHBrCNH2OOOC=N-EO-CO-NH-EOHO-C-NH-E NHOHH2N-E（多羟基载体）（多羟基载体）O-CONH2OH（惰性）（惰性）OOC=NH（活泼）（活泼）OC NOH戊二醛交联法戊二醛交联法 OHC(CH2)3CHO戊二醛戊二醛H2N-EN -HC=N-E-N=CH（CH2）3

53、-CH=N- E-NCHCH酶的改造和模拟酶的改造和模拟 酶的改造酶的改造：功能基团的化学修饰酶功能基团的化学修饰酶 酶蛋白侧链的化学修饰酶蛋白侧链的化学修饰 酶分子内或间的交联反应酶分子内或间的交联反应酶的模拟酶的模拟：根据酶作用的原理摸拟酶的活性中：根据酶作用的原理摸拟酶的活性中心和催化机理，用化学方法制备结构较简单心和催化机理，用化学方法制备结构较简单,高高效、高选择性、稳定性能好的新型催化剂效、高选择性、稳定性能好的新型催化剂,可以可以是无机化合物、有机化合物或小肽。是无机化合物、有机化合物或小肽。人工模拟酶人工模拟酶 -benzyme环糊精环糊精催催化化侧侧链链催化侧链连接到环糊精上

54、，催化侧链连接到环糊精上，可模拟胰凝乳蛋白酶可模拟胰凝乳蛋白酶环糊精分子环糊精分子结构结构环糊精结构环糊精结构模型模型生物酶工程示意图生物酶工程示意图酶的蛋白质结构功能酶的蛋白质结构功能新酶分子蓝图新酶分子蓝图选择性修饰方案选择性修饰方案突变酶突变酶 新酶新酶克隆酶克隆酶产品产品效用效用发发展展酶基因酶基因遗传设计遗传设计遗传修饰遗传修饰DNA重组重组技术技术DNA重组重组技术技术问答题问答题1、影响酶促反应的因素有哪些？它们是如何影响的？、影响酶促反应的因素有哪些？它们是如何影响的？2、试比较酶的竞争性抑制作用与非竞争性抑制作用的异同。、试比较酶的竞争性抑制作用与非竞争性抑制作用的异同。3、

55、什么是米氏方程，米氏常数、什么是米氏方程，米氏常数Km的意义是什么？试求酶反应速度达到最的意义是什么？试求酶反应速度达到最大反应速度的大反应速度的99时，所需求的底物浓度（用时，所需求的底物浓度（用Km表示）表示）4、什麽是同工酶？为什麽可以用电泳法对同工酶进行分离？同工酶在科学、什麽是同工酶？为什麽可以用电泳法对同工酶进行分离？同工酶在科学研究和实践中有何应用？研究和实践中有何应用？5、举例说明酶的结构和功能之间的相互关系。、举例说明酶的结构和功能之间的相互关系。6、称取、称取25毫克某蛋白酶制剂配成毫克某蛋白酶制剂配成25毫升溶液，取出毫升溶液，取出1毫升该酶液以酪蛋白毫升该酶液以酪蛋白为

56、底物为底物,用用Folin-酚比色法测定酶活力酚比色法测定酶活力,得知每小时产生得知每小时产生1500微克酪氨酸。另微克酪氨酸。另取取2毫升酶液，用凯式定氮法测得蛋白氮为毫升酶液，用凯式定氮法测得蛋白氮为0.2毫克。若以每分钟产生毫克。若以每分钟产生1微克微克酪氨酸的酶量为一个活力单位计算，根据以上数据，求出（酪氨酸的酶量为一个活力单位计算，根据以上数据，求出（1）1毫升酶液毫升酶液中含有的蛋白质和酶活力单位数；（中含有的蛋白质和酶活力单位数；（2）该酶制剂的比活力；（）该酶制剂的比活力；（3）1克酶制克酶制剂的总蛋白含量和酶活力单位数。剂的总蛋白含量和酶活力单位数。名词解释名词解释活性中心活性中心 全酶全酶 酶原酶原 活力单位活力单位 比活力比活力 米氏方程米氏方程 Km 诱导契合变构效应诱导契合变构效应 ribozyme 辅酶和辅基辅酶和辅基 固定化酶固定化酶