毕业设计蒙脱石共固定化淀粉酶和糖化酶的研究

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1、山东科技大学本科毕业设计（论文）蒙脱石共固定化淀粉酶和糖化酶的研究摘要自20世纪60年代以来,固定化酶技术在食品与发酵工业、有机合成等领域得到了广泛的应用。而近年来酶的共固定化技术,既有固定化酶的高稳定性和连续操作能力,又具有酶之间的协同作用，显示出很强的优越性。本研究选择目前工业上应用比较广泛的蒙脱石为载体,采用吸附法共固定了-淀粉酶和糖化酶双酶。实验所用的蒙脱石经提纯钠化后，用KH570对其进行偶联，然后用经以上处理的蒙脱石对双酶同时固定。并通过测定其活性和酶的吸附率分析实验结果，确定了共固定化的最适条件,研究了共固定化酶的性质,为工业应用提供了一定的理论依据。经本实验所确定的共固定最佳条

2、件为淀粉酶（U）：糖化酶（U）：蒙脱石（g）为15：7.5：0.2，pH为5.5，温度为20。在最佳固定条件下共固定化酶的性质为：最适反应温度为55左右;最适反应pH为5.5；稳定性在低温下较好，而在高温下不甚理想；共固定化酶在在0下保存10天后其相对酶活仍在50%以上，使用四次后其相对酶活仍有50%以上，故储藏性能和操作性能较好。关键词：共固定化，-淀粉酶，糖化酶。Studies on co-immobilization of -amylaseand glucoamylase on montmorilloniteAbstractSince the advent of the immobili

3、zed enzymes in the 60s of last century, the immobilized enzymes has been widely used in the areas of food and fermentation industry and organic synthesis. The co-immobilized enzymes has both high stability and continuous operation capability and shows a strong advantage. This study has chosen the mo

4、ntmorillonite which was widely used in todays industrial production as the carrier , and fixed -amylase and glucoamylase dual enzyme system by adsorption . Determined the optimal conditions of co-immobilization and studied the nature of the co-immobilized enzyme, providing a theoretical basis for in

5、dustrial applications .The montmorillonite used in this experiment has been purified and Na-treated , and then conjugated by one coupling agent which named KH570 in order to improve its adsorption capacity of the enzymes. Then using the montmorillonite to fix two-enzyme. Determined the optimal condi

6、tions of co-immobilization and studied the nature of the co-immobilized enzyme, providing a theoretical basis for industrial applications . The present study identified a total of constant optimal conditions for amylase (U): glucoamylase (U): montmorillonite (g) as 15:7.5:0.2, pH 5.5, temperature 20

7、 . In the best condition of the fixed nature of immobilized enzyme: optimal temperature was around 55 ; optimal reaction pH 5.5; stability at low temperatures well, but not ideal at high temperatures; The co-immobilized enzyme was stored at 0 ,after 10 days the relativity was still above 50%, after

8、using four times the relative activity was still more than 50% ,so the co-immobilized enzyme,s storage and operation performance was well. Key words: co-immobilization, -amylase, glucoamylase.目录1 文献综述11.1酶综述11.1.1 酶概述11.1.2淀粉酶11.1.3糖化酶31.1.4酶的活力31.1.5酶活测定41.1.6影响酶活力的因素61.2固定化酶81.2.1 固定化酶概述81.2.2固定化酶

9、的制备方法91.2.3固定化酶的性质101.2.4食品工业中的应用111.2.5固定化酶的展望121.3共固定化酶121.3.1共固定化酶概述121.3.2共固定化酶的优点131.3.3共固定化技术的研究与应用131.3.4-淀粉酶与糖化酶的共固定方法141.4蒙脱石151.4.1蒙脱石概述151.4.2蒙脱石有机化改性162 实验方法182.1 实验材料与仪器182.1.1 实验材料182.1.2 主要试剂182.1.3 仪器设备182.1.4 主要试剂的配制方法192.2 实验方法202.2.1蒙脱石的预处理202.2.2-淀粉酶和糖化酶的固定化和处理212.2.3还原糖含量的测定212.

10、2.4蛋白质含量的测定222.2.5-淀粉酶和糖化酶酶活的测定232.2.6共固定化酶固定率的计算242.2.7最佳固定化条件的研究242.2.8共固定化酶性质的研究263 结果与分析283.1淀粉酶和糖化酶酶活的测定283.1.1葡萄糖标准曲线的制作283.1.2酶活的测定293.2淀粉酶和糖化酶酶液蛋白质含量的测定293.2.1蛋白质标准曲线的制作293.2.2-淀粉酶和糖化酶酶液蛋白质含量的测定303.3最佳固定化条件的研究303.3.1双酶最佳比例的研究303.3.2酶与蒙脱石之间比例研究313.3.3最佳固定pH的研究333.3.4最佳固定温度的研究343.3.5小结353.4共固定

11、化酶性质的研究353.4.1共固定化酶的最适反应温度353.4.2共固定化酶的最适pH363.4.3共固定化酶的热稳定性373.4.4共固定化酶的储藏稳定性383.4.5共固定化酶的操作稳定性393.4.6小结404 总结与建议414.1 总结414.2 注意事项41参考文献43致谢辞45附录46附录1 英文文献原文46附录2 英文文献译文60山东科技大学本科毕业设计（论文）1 文献综述1.1酶综述1.1.1 酶概述酶是一类生物催化剂，其本质为蛋白质，少数为核糖核酸。构成新陈代谢的许多复杂而有规律的物质变化和能量变化都是在酶的催化下完成的。与一般的化学催化剂相比，酶具有很高的催化效率和高度的专

12、一性。但是由于酶是蛋白质分子，也容易变性和失活1。1.1.2淀粉酶淀粉酶(amylase，AMY,AMS)是一种可作用于可溶性淀粉、直链淀粉、糖元等多糖的酶。根据作用的方式可分为-淀粉酶（EC3211）与-淀粉酶（EC3212）。-淀粉酶广泛分布于动物（唾液、胰脏等）、植物（麦芽、山萮菜）及微生物。微生物的酶几乎都是分泌性的。此酶以Ca2+为必需因子并作为稳定因子，既作用于直链淀粉，亦作用于支链淀粉，无差别地切断-1，4-链。因此，其特征是引起底物溶液粘度的急剧下降和碘反应的消失，最终产物在分解直链淀粉时以麦芽糖为主，此外，还有麦芽三糖及少量葡萄糖。另一方面在分解支链淀粉时，除麦芽糖、葡萄糖外

13、，还生成分支部分具有-1，6-键的-极限糊精。一般分解限度以葡萄糖为准是35-50，但在细菌的淀粉酶中，亦有呈现高达70分解限度（最终游离出葡萄糖）。图1.1-淀粉酶的空间结构-淀粉酶与-淀粉酶的不同点在于从非还原性末端逐次以麦芽糖为单位切断-1，4-葡聚糖链。主要见于高等植物中（大麦、小麦、甘薯、大豆等），但也有报告在细菌、牛乳、霉菌中存在。对于象直链淀粉那样没有分支的底物能完全分解得到麦芽糖和少量的葡萄糖。作用于支链淀粉或葡聚糖的时候，切断至-1，6-键的前面反应就停止了，因此生成分子量比较大的极限糊精。从上述的-淀粉酶和-淀粉酶的作用方式，分别提出-1，4-葡聚糖-4-葡萄糖水解酶（-1

14、，4-glucan4-glucanohydrolase）和-1，4-葡聚糖-麦芽糖水解酶（-1，4-glucanmaltohydrolase）的名称等而被使用。淀粉酶是水解淀粉和糖原的酶类总称，通常通过淀粉酶催化水解织物上的淀粉浆料，由于淀粉酶的高效性及专一性，酶退浆的退浆率高，退浆快，污染少，产品比酸法、碱法更柔软，且不损伤纤维。淀粉酶的种类很多，根据织物不同，设备组合不同，工艺流程也不同，目前所用的退浆方法有浸渍法、堆置法、卷染法、连续法等。由于淀粉酶退浆机械作用小，水的用量少，可以在低温条件下达到退浆效果，具有鲜明的环保特色。1.1.3糖化酶糖化酶又称葡萄糖淀粉酶，糖化酶是一种习惯上的名

15、称，学名为-1，4-葡萄糖水解酶(-1，4-Glucanglucohydrolace)。本品应用于酒精、淀粉糖、味精、柠檬酸、啤酒等工业以及白酒、黄酒2。糖化酶是由曲霉优良菌种（Aspergilusniger）经深层发酵提炼而成。糖化酶，又称葡萄糖淀粉酶Glucoamylase,(EC.3.2.1.3.)。它能把淀粉从非还原性末端水解-1.4葡萄糖苷键产生葡萄糖，也能缓慢水解-1.6葡萄糖苷键，转化为葡萄糖。本产品广泛用于生产白酒、黄酒、酒精、啤酒；用于以葡萄糖作发酵培养基的各种抗生素、有机酸、氨基酸、维生素的发酵；本品还大量用于生产各种规格的葡萄糖。总之，凡对淀粉、糊精必需进行酶水解的工业上

16、，都可适用。产品特性：作用方式：糖化酶的底物专一性较低，它除了能从淀粉链的非还原性末端切开-1.4键，也能缓慢切开-1.6键。因此，它能很快的把直链淀粉从非还原性末端依次切下葡萄糖单位。作用条件：本品随作用的温度升高活力增大，超过65又随温度升高而活力急剧下降，本品最适作用温度是60-62。最适作用pH值在4.0-4.5左右。1.1.4酶的活力酶活力单位（U,active unit）：酶活力单位的量度。1961年国际酶学会议规定：1个酶活力单位是指在特定条件（25，其它为最适条件）下，在1min内能转化1mol底物的酶量，或是转化底物中1mol的有关基团的酶量。比活（specific acti

17、vity）：每分钟每毫克酶蛋白在25下转化的底物的微摩尔数。比活是酶纯度的测量。活化能（activation energy）：将1mol反应底物中所有分子由基态转化为过度态所需要的能量。活性部位（active site）：酶中含有底物结合部位和参与催化底物转化为产物的氨基酸残基部分。活性部位通常位于蛋白质的结构域或亚基之间的裂隙或是蛋白质表面的凹陷部位，通常都是由在三维空间上靠得很紧的一些氨基酸残基组成3。1.1.5酶活测定初速度(initial velocity)：酶促反应最初阶段底物转化为产物的速度，这一阶段产物的浓度非常低，其逆反应可以忽略不计。米氏方程（Michaelis-Menten

18、t equation）：表示一个酶促反应的起始速度（）与底物浓度(s)关系的速度方程：=maxs/(Km+s)米氏常数（Michaelis constant）：对于一个给定的反应，使酶促反应的起始速度（0）达到最大反应速度（max）一半时的底物浓度。催化常数（catalytic number）(Kcat)：也称为转换数。是一个动力学常数，是在底物处于饱和状态下一个酶（或一个酶活性部位）催化一个反应有多快的测量。催化常数等于最大反应速度除以总的酶浓度（max/Etotal）。或是每摩酶活性部位每秒钟转化为产物的底物的量（摩尔）。双倒数作图（double-reciprocal plot）：那称为L

19、ineweaver_Burk作图。一个酶促反应的速度的倒数（1/V）对底物度的倒数（1/LSF）的作图。x和y轴上的截距分别代表米氏常数和最大反应速度的倒数。酶活测定方法：1按反应时间分类法：上世纪50年代以前大都使用固定时间法。这种方法是以酶催化反应的平均速度来计算酶的活性，现多已不用。50年代中期开始采用连续监测法。这种方法用自动生化分析仪上完成，可以测酶反应的初速度，其结果远比固定时间法准确，在高浓度标本尤为明显，但本法也受到反应时间，反应温度，试剂等的影响，应加以注意。（1）定时法（两点法）：通过测定酶反应开始后某一时间段内（t1到t2）产物或底物浓度的总变化量来求取酶反应初速度的方法

20、。其中t1往往取反应开始的时间。酶与底物在一定温度下作用一段固定的时间，通过加入强酸、强碱、蛋白医学教育网整理沉淀剂等，使反应完全停止（也叫中止反应法）。加入试剂进入化学反应呈色测出底物和产物的变化。该法最基本的一点是停止反应后才测定底物或物的变化。优点：简单易行，对试剂要求不高。缺点：难保证测定结果的真实性。难以确定反应时间段酶促反应是否处于线性期。随着保温时间的延续，酶变性失活加速。（2）连续监测法：又称为动力学法或速率法、连续反应法。在酶反应过程中，用仪器监测某一反应产物或底物浓度随时间的变化所发生的改变，通过计算求出酶反应初速度。连续监测法根据连续测得的数据，可选择线性期的底物或产物变

21、化速率用于计算酶活力。因此连续监测法测定酶活性比定时法更准确。实际工作中，采用工具酶的酶偶联法已经成为医学、研究等方面应用最广、最频繁测酶活性的方法。 （3）平衡法：通过测定酶反应开始至反应达到平衡时产物或底物浓度总变化量来求出酶活力的方法，又叫终点法。 2按检测方法分类法：分光光度法；旋光法；荧光法；电化学方法；化学反应法；核素测定法；量热法。 1.1.6影响酶活力的因素米契里斯（Michaelis）和门坦（Menten）根据中间产物学说推导出酶促反应速度方程式，即米-门公式（具体参考环境工程微生物学第四章微生物的生理）。由米门公式可知：酶促反应速度受酶浓度和底物浓度的影响，也受温度、pH、

22、激活剂和抑制剂的影响。 a酶浓度对酶促反应速度的影响从米-门公式和酶浓度与酶促反应速度的关系图解可以看出：酶促反应速度与酶分子的浓度成正比。当底物分子浓度足够时，酶分子越多，底物转化的速度越快。但事实上，当酶浓度很高时，并不保持这种关系，曲线逐渐趋向平缓。根据分析，这可能是高浓度的底物夹带夹带有许多的抑制剂所致。b底物浓度对酶促反应速度的影响在生化反应中，若酶的浓度为定值，底物的起始浓度较低时，酶促反应速度与底物浓度成正比，即随底物浓度的增加而增加。当所有的酶与底物结合生成中间产物后，即使在增加底物浓度，中间产物浓度也不会增加，酶促反应速度也不增加。还可以得出，在底物浓度相同条件下，酶促反应速

23、度与酶的初始浓度成正比。酶的初始浓度大，其酶促反应速度就大。在实际测定中，即使酶浓度足够高，随底物浓度的升高，酶促反应速度并没有因此增加，甚至受到抑制。其原因是：高浓度底物降低了水的有效浓度，降低了分子扩散性，从而降低了酶促反应速度。过量的底物聚集在酶分子上，生成无活性的中间产物，不能释放出酶分子，从而也会降低反应速度。c温度对酶促反应速度的影响各种酶在最适温度范围内，酶活性最强，酶促反应速度最大。在适宜的温度范围内，温度每升高10，酶促反应速度可以相应提高12倍。不同生物体内酶的最适温度不同。如，动物组织中各种酶的最适温度为3740；微生物体内各种酶的最适温度为2560，但也有例外，如黑曲糖

24、化酶的最适温度为6264；巨大芽孢杆菌、短乳酸杆菌、产气杆菌等体内的葡萄糖异构酶的最适温度为80；枯草杆菌的液化型淀粉酶的最适温度为8594。可见，一些芽孢杆菌的酶的热稳定性较高。过高或过低的温度都会降低酶的催化效率，即降低酶促反应速度。最适温度在60以下的酶，当温度达到6080时，大部分酶被破坏，发生不可逆变性；当温度接近100时，酶的催化作用完全丧失。dpH对酶促反应速度的影响酶在最适pH范围内表现出活性，大于或小于最适pH，都会降低酶活性。主要表现在两个方面：改变底物分子和酶分子的带电状态，从而影响酶和底物的结合；过高或过低的pH都会影响酶的稳定性，进而使酶遭受不可逆破坏。e激活剂对酶促

25、反应速度的影响能激活酶的物质称为酶的激活剂。激活剂种类很多，有无机阳离子，如钠离子、钾离子、铜离子、钙离子等；无机阴离子，如氯离子、溴离子、碘离子、硫酸盐离子磷酸盐离子等；有机化合物，如维生素C、半胱氨酸、还原性谷胱甘肽等。许多酶只有当某一种适当的激活剂存在时，才表现出催化活性或强化其催化活性，这称为对酶的激活作用。而有些酶被合成后呈现无活性状态，这种酶称为酶原。它必须经过适当的激活剂激活后才具活性。f抑制剂对酶促反应速度的影响能减弱、抑制甚至破坏酶活性的物质称为酶的抑制剂。它可降低酶促反应速度。酶的抑制剂有重金属离子、一氧化碳、硫化氢、氢氰酸、氟化物、碘化乙酸、生物碱、染料、对-氯汞苯甲酸、

26、二异丙基氟磷酸、乙二胺四乙酸、表面活性剂等。对酶促反应的抑制可分为竞争性抑制和非竞争性抑制。与底物结构类似的物质争先与酶的活性中心结合，从而降低酶促反应速度，这种作用称为竞争性抑制。竞争性抑制是可逆性抑制，通过增加底物浓度最终可解除抑制，恢复酶的活性。与底物结构类似的物质称为竞争性抑制剂。抑制剂与酶活性中心以外的位点结合后，底物仍可与酶活性中心结合，但酶不显示活性，这种作用称为非竞争性抑制。非竞争性抑制是不可逆的，增加底物浓度并不能解除对酶活性的抑制。与酶活性中心以外的位点结合的抑制剂，称为非竞争性抑制剂。有的物质既可作为一种酶的抑制剂，又可作为另一种酶的激活剂。1.2固定化酶1.2.1 固定

27、化酶概述酶的固定化技术是用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内，酶仍能进行其特有的催化反应、并可回收及重复利用的一类技术。酶的固定化技术已经成为酶应用领域中的一个主要研究方向。经固定化的酶与游离酶相比具有稳定性高、回收方便、易于控制、可反复使用、成本低廉等优点，在生物工业、医学及临床诊断、化学分析、环境保护、能源开发以及基础研究等方面发挥了重要作用。因此酶的固定化技术研究已成为十分引人注目的领域4。1.2.2固定化酶的制备方法制备固定化酶的方法很多，有包埋法、吸附法、共价偶联法，以及交联法等。a包埋法：将酶或含酶菌体包埋在多孔载体中，使酶固定化的方法称为包埋法。包埋法根据载体材料和方法的不同，可

28、以分为凝胶包埋法和微胶囊包埋法。凝胶包埋法是将酶和含酶菌体包埋在各种凝胶内部的微孔中，制成一定形状的固定化酶的方法。最常用的凝胶有琼脂、琼脂糖、海藻酸钙、卡拉胶、聚丙烯酰胺等。微胶囊包埋法是将酶包埋在高分子半透膜中，制成微胶囊固定化酶的方法。常用的半透膜有尼龙膜、醋酸纤维膜等。b吸附法：利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面而使酶固定化的方法称为吸附法。吸附法常用的吸附剂有活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、羧基磷灰石等。吸附法制备固定化酶，操作简便、条件温和，不会引起酶的变性失活，载体价廉易得，而且可反复使用。但由于是靠物理吸附作用，结合力较弱，酶与载体结合不太牢固而易脱

29、落。c共价键结合法法：利用酶活性中心外的非必需基团与固相载体上的基团共价结合而制成固定化酶的方法叫共价偶联法，也叫共价结合法。这种方法的优点是酶与载体牢固，制得的固定化酶稳定性好。缺点是制备过程中反应条件较为强烈，难以控制，易使酶变性失活。共价偶联法常用的载体有纤维素、葡聚糖、琼脂糖、甲壳素等。d交联法：交联法是采用双功能试剂使酶分子之间或酶分子与固相载体之间发生交联作用而制成固定化酶的方法。常用的双功能试剂有戊二醛、己二胺、顺丁烯二酸酐、双偶氮苯等。其中应用最广泛的是戊二醛。用交联法制备的固定化酶结合牢固，可长时使用。但由于交联反应较激烈，酶分子的多个基团被交联，酶活力损失较大。实际使用时，

30、往往与其他固定化方法联用，如将酶先经凝胶包埋后，再经交联等。这种采用两个或多个方法进行固定化的技术，称为双重或多重固定化法，用此法可制备出酶活性高、机械强度好的固定化酶。表1.1 各种固定化方法比较51.2.3固定化酶的性质酶经固定化以后，由于受到载体等因素的影响，其特征可能会发生某些改变。为此，在固定化酶的应用过程中，必须了解固定化酶的性质与游离酶之间的差别，并对操作条件加以适当调整。a稳定性：固定化酶的稳定性一般比游离酶的稳定性好，主要表现在对热、蛋白酶、各种变性剂的耐受性增强，使用和保存的稳定性提高。b最适温度：固定化酶的最适作用温度一般与游离酶差不多，活化能也变化不大。但也有些固定化酶

31、的最适温度与游离酶比较有明显的差别。例如，氨基酸酰化酶最适温度一般在60 左右，用DEAE-纤维素固定化后，其最适温度高达72 。c最适pH：酶经固定化后，其最适pH往往会发生变化，这一点在使用时必须引起注意。影响固定化酶最适pH因素主要有两个：一个是载体的带电性质；另一个是酶催化反应的产物性质。载体的带电性质对固定化酶的最适pH也有明显的影响。一般说来，带负电的载体制备固定化酶，其最适pH比游离酶高；而带正电的载体制备的固定化酶其最适pH比游离酶低；而用电中性的载体制备的固定化酶，其最适pH一般不改变。酶催化反应的产物性质对固定化酶的最适pH也有一定的影响。一般来说，产物为酸性时固定化酶的最

32、适pH比游离酶高一些；产物为碱性时，固定化酶的最适pH比游离酶低一些，产物为中性时，最适pH一般不改变。d底物特异性：固定化酶的底物特异性与游离酶比较有所不同。比如对一些可作用于大分子底物，也可作用于小分子底物的酶而言，经固定化后，由于受到载体空间位阻作用的影响，大分子底物难于接近酶分子，而使其催化反应速度大大降低，而小分子底物的反应速度则不受影响5。1.2.4食品工业中的应用自1953年NGrubhofer用共价偶联法，在载体聚氨基聚苯乙烯树脂上连接了淀粉酶、羧肽酶、胃蛋白酶与核糖核酸酶，获得首批固定化酶之后，经多年实线，运用各种各样的方法，现已制备出数百种固定化酶。如生产中使用规模最大的固

33、定化酶是在DEAE-葡聚糖凝胶上固定的氨基酸酰化酶。该酶水解N-酰基-L-氨基酸中的酰胺键，对于N-酰基-D-氨基酸无作用，故可用来拆分DL-氨基酸，制备L-氨基酸。在食品工业中，可把固定化的a-淀粉酶与葡萄糖淀粉酶混合装柱，糊化的淀粉溶液流经此柱后，淀粉便水解为葡萄糖，这是近几年提出的酶法制葡萄糖的一条新途径。近几年来，不少地方采用过氧化氢对牛奶灭菌，为了除去牛奶中过量的过氧化氢，可用固定化的过氧化氢酶使之分解。此外，还有人介绍固定化的葡萄糖氧化酶清除蛋清中微量的葡萄糖，以防制成的蛋白干片在贮存中发生褐变6。固定化酶在食品工业上还有以下几方面的应用：如用固定化果胶酶澄清果汁；用固定化木瓜蛋白

34、酶澄清啤酒；用固定化葡萄糖异构酶将葡萄糖转变为果糖等。一旦固定化酶大规模用于食品工业，必将有助于更经济更有效地生产高质量的食品。1.2.5固定化酶的展望目前，酶技术已成为酶工程研究的重点和热点之一。研究探索新的酶固定化技术、提高固定化酶活性收率、延长半衰期、降低成本将成为固定化酶研究领域的主要研究内容。随着固定化酶研究的深入，必将在微生物发酵、酶工程、精细化工、环境保护、制药、生物传感器等领域，尤其是在大规模生物转化、手性化合物的合成以及其他传统酶和蛋白质等方面得到更广泛的应用7。1.3共固定化酶1.3.1共固定化酶概述自20世纪60年代固定化酶技术问世以来，在食品与发酵工业、有机合成等领域得

35、到了广泛的应用，并显示出很强的优越性。近年来在单一酶固定化技术逐渐成熟的基础上又建立了多酶共固定化技术，从而实现了固定化多酶体系的共固定和共反应。这种系统稳定，可将几种不同功能的酶，细胞和细胞器在同一系统内进行协同作用。共固定化的优点共固定化能使各组分之间互补催化活性，可以平衡两个不同细胞或酶之间相应的酶活性获得高产率或用该系统处理某种成分，或得到某种有效成分。多酶共固定化技术的研究始于1970年Mos-bach建立的固定化多酶体系，既拥有固定化酶的高稳定性和连续操作能力，具有双酶的协同作用。1985年日本学者在研究中指出：混合的可溶性-淀粉酶与糖化酶作用于淀粉糊，解过程中具有协同效应8。1.

36、3.2共固定化酶的优点共固定化的优点共固定化能使各组分之间互补催化活性,可以平衡两个不同细胞或酶之间相应的酶活性获得高产率或用该系统处理某种成分,或得到某种有效成分。混合发酵往往采用生长条件相近的菌种,差异性较大则很难实现同步生长，共固定化技术可以避开这一矛盾,先将菌种各自培养,然后再进行共固定。1.3.3共固定化技术的研究与应用多酶系统的共固定化是一个引人注目的研究动向，它是将二种或多种有联系的酶同时进行固定化，以形成多功能的生物催化剂，达到比单一酶更复杂的转化。淀粉酶与糖化酶共固定化，葡萄糖氧化酶与过氧化氢酶共固定化，黄素氧化酶与过氧化氢酶及超氧化物歧化酶共固定化，腺营酸激酶与乙酸激酶共固

37、定化等都是人们进行多酶共固定化的例子。在20世纪八十年代初至九十年代初，多酶的共固定化研究仅仅处于初始探索阶段。1982年Ku将工业应用的两种催化淀粉水解的酶，即普鲁兰酶和糖化酶共固定在胶原蛋白膜上。在单独固定普鲁兰酶后稳定性并不增加，但与糖化酶共固定之后稳定性增加一倍，并且反应体系内的DE值增加了5%-10%。Srerez等人将苹果酸脱氢酶、柠檬酸合成酶和乳酸脱氢酶共固定在载体聚丙稀酞胺凝胶上，发现其产生柠檬酸的速度可达溶液中三酶系统的400%。1983年Alxeander将-淀粉酶和糖化酶共固定在微孔塑料膜上，催化淀粉产生麦芽糖。Mattasiosnz把三种酶半乳糖昔酶、己糖激酶和葡萄糖-

38、6-磷酸脱氢酶共固定在载体上，发现三酶共反应比双酶共反应的协同优势更加明显。1990年，Storye等人共固定纤维素酶、葡萄糖淀粉酶和葡萄糖异构酶，由纤维一步生产果糖。在反应达到平衡时，葡萄糖和果糖的比例为70:30。1992年Schahfuaesr和Storye把糖化酶、普鲁兰酶和葡萄糖异构酶共固定在骨头上，用一部法由糖元生产果糖，结果得到20%的果葡糖浆。而进入二十一世纪，多酶共固定技术已逐渐引起了国内外酶工程专家的极大兴趣，并处于迅速发展阶段，其研究报道也是络绎不绝9。1.3.4-淀粉酶与糖化酶的共固定方法目前关于-淀粉酶与糖化酶的固定方法研究目前比较成熟。已发表论文中对其固定方法主要有

39、：（1）吸附法：目前为止最为常用的方法。常用的载体有活性炭，黏土硅藻土，离子交换海绵，多空玻璃等。该方法操作简单，对酶活力影响较小，但吸附效率较低。郭桥等以纤维素为载体用重氮化法共固定-淀粉酶与糖化酶10。该载体的制备操作如下：将滤纸纤维素用3mol/LNaOH浸泡过夜，然后水洗，打浆，得到较均一的纤维素。将10鲍湿纤维素悬浮于150mLlmol/LNa0H溶液中，加入60mL环氧氯丙烷，于60反应30min，过滤，水洗后，再加入209对苯二胺水溶液，于45反应3Omin，抽干，水洗后即得胺化纤维素。共固定化酶的制备：载体的活化方法采用重氮法。将载体加入水3.0mL，然后再加入lmol/LHC

40、l 5:OmL搅拌均匀。在O-5度下慢慢滴加5.0mL5%的NaNO2溶液。20min后抽干。先用冷的0.O05mol/LHCl洗三次，再用水洗三次后抽干。在一定条件下，加入适量比例的a-淀粉酶与糖化酶，在0-5度条件下反应0.5-4h后依次用水、3mol/LNaCl、水各洗三次，即得共固定化酶。（2）包埋法：常用的包埋法载体有天然高分子凝胶和有机合成高分子凝胶，如聚乙烯醇，聚丙烯酰胺，壳聚糖，海藻酸钠等。顾旭炯等在海藻酸钠包埋法共固定-淀粉酶和糖化酶的研究中对此方法做了比较详细的研究11。该研究的具体方法为，双酶体系的共固定化：称取一定量的海藻酸钠固体在沸水浴中搅拌溶解，待冷却到一定温度后，

41、加入到一定比例一定pH值的双酶混合液中，使海藻酸钠最终达到一定的浓度，待充分搅拌均匀后，滴入至一定浓度的CaCl2溶液中，形成直径为2-3 mm的海藻酸钙凝胶珠，于5下静置固化10 h左右，取出用真空泵抽干，测其反应速率。改变海藻酸钠、氯化钙和酶的浓度使固定化效果达到最佳。酶反应速率的测定：取20 mL质量体积比为2%的可溶性淀粉溶液放入试管中，加入缓冲液5 mL，放入水浴中预热5 min，然后取一定量的固定化酶加入溶液中，反应5 min后，加入1 molL-1的NaOH 5 mL，再在沸水浴中加热5min灭活。取一定量离心后用DNS比色定糖法测定还原糖含量，进而计算反应速率。蛋白质含量的测定

42、：采用考马斯亮蓝G-250染色法，以牛血清白蛋白为标准蛋白进行测定。1.4蒙脱石1.4.1蒙脱石概述蒙脱石是由颗粒极细的含水铝硅酸盐构成的矿物，它们一般为块状或土状。蒙脱石晶体属单斜晶系的含水层状结构硅酸盐矿物。名称来源于首先发现的产地法国的Montmorillon。蒙脱石颗粒细小，约0.21微米，具胶体分散特性，通常都呈块状或土状集合体产出。蒙脱石在电子显微镜下可见到片状的晶体，颜色或白灰，或浅蓝或浅红色。当温度达到100200时，蒙脱石中的水分子会逐渐跑掉。失水后的蒙脱石还可以重新吸收水分子或其他极性分子。当它们吸收水分后还可以膨胀并超过原体积的几倍。蒙脱石的用途多种多样，人们将它的特性运

43、用到化学反应中以产生吸附作用和净化作用。它还可以作为造纸、橡胶、化妆品的填充剂，石油脱色和石油裂化催化剂的原料等，还可作为地质钻探用泥浆，冶金用粘合剂及医药等等方面。1.4.2蒙脱石有机化改性由于蒙脱石晶层内部为双电层结构，表面层所带的负电荷更易吸附截面积大的有机阳离子到晶层附近，最终取代层间原有阳离子，形成新的更加稳定的复合层状结构，改性为有机蒙脱石。从所用有机阳离子结构看，可分为非反应型和反应型两大类14。 非反应型有机蒙脱石非反应型有机蒙脱石是应用较早的蒙脱石有机化改性产品，已广泛应用于油漆、油墨和润滑脂等产品中。凡自身在溶液中能电离出有机阳离子(如季胺盐)或通过质子化加H+能生成有机阳

44、离子(如伯胺RNH2、仲胺R2NH、叔胺R3N)等均可作为非反应型有机蒙脱石改性剂,所用有机物中的R基主要为饱和烷基,本身仅起离子交换、偶联和撑大层间距的作用。非反应型有机蒙脱石由于有机物结构上的局限，主要利用其在有机相中的分散和偶联作用，当蒙脱石层间有机阳离子交换达到一定程度后，使片层边沿端带正电,端电荷能同片层表面的负电荷形成以“Z”字型搭接相连的结构，从而使有机蒙脱石在有机相中表现出较好的凝胶和触变性能，可用于涂料增稠剂、流平剂和聚合物增强剂等许多领域。反应型有机蒙脱石反应型有机蒙脱石所用有机物除要求能生成阳离子外，还要求阳离子本身带有活性基团或不饱和键，通过引发剂或体系热作用时，活性基

45、团间能反应脱水缩聚或同基体混合反应缩聚，或不饱和键打开相连形成稳定的交联高分子。此类蒙脱石改性剂常用的有烷基氨基酸、烷基内酰胺、烷基二胺、烷基醇胺及含有不饱和双键(或三键)等的有机化合物。改性加工后的反应型有机蒙脱石常用于不同基体树脂的复合材料合成中。蒙脱石所带的有机基团由于反应时的热作用和生成大分子产物的结构效应,使蒙脱石的片层更易分散，甚至解离成以单元片层为主的完全剥离型分散的有机蒙脱石。 1.5本课题的目的和意义本课题的目的是在为工业上淀粉一步水解为葡萄糖的生产提供一个可靠的技术支持和理论依据。选取现在工业上比较常用，价格相对较低廉蒙脱石为载体共固定化一淀粉酶和糖化酶，并确定其最佳固定化

46、条件，研究固定化后的理化性质。同时本实验通过对蒙脱石共固定化酶的研究，建立共固定化双酶体系的催化反应动力学模型，对共固定化双酶体系以及实际生产应用提供一个可靠的理论参考依据，对双酶共固定化在实际生产中的应用起到一定的推动作用，实现高效生产。2 实验方法2.1 实验材料与仪器2.1.1 实验材料-淀粉酶（北京双旋微生物培养基制品厂）糖化酶（上海蓝季科技发展有限公司）蒙脱石（采购于山东省莱西市）2.1.2 主要试剂可溶性淀粉汕头市西陇化工厂有限公司磷酸氢二钠天津市津北精细化工有限公司柠檬酸天津市凯通化学试剂有限公司氢氧化钠天津市北方天医化学试剂厂葡萄糖天津市广成试剂有限公司3,5二硝基水杨酸上海展

47、云化工有限公司酒石酸钾钠天津市广成试剂有限公司苯酚烟台三和化学试剂有限公司无水乙醇汕头市西陇化工厂有限公司NaOH天津市凯通化学试剂有限公司-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷（KH570）宝生物工程（大连）有限公司牛血清蛋白（BSA）北京中生利康科技有限公司2.1.3 仪器设备 离心机上海安亭科学仪器厂电热恒温鼓风干燥箱龙口市电炉制作厂电子天平上海民桥精密科学仪器有限公司玻璃仪器气流烘干器上海豫康科教仪器气流烘干器冷冻式离心机上海安亭科学仪器厂WFJ 7200型可见分光光度计尤尼柯（上海）仪器有限公司PHS-3E型pH计江苏江分电分析仪器有限公司电热恒温水浴锅北京长源实验设备厂电子天平（万分之一

48、）梅特勒-托利多仪器（上海）公司可调万用电炉龙口市电炉制作厂2.1.4 主要试剂的配制方法 a2%可溶性淀粉溶液配制方法:称取可溶性淀粉2.00g，边加热边用蒸馏水或不同PH的缓冲液调成浆状物，煮沸溶解，冷却，定容至10Oml，现配现用。bDNS试剂配制方法：取3，5-二硝基水杨酸10g，加入2mol/L氢氧化钠溶液200mL。.将3，5-二硝基水杨酸溶解，然后加入酒石酸钾钠300g。待其完全溶解，用蒸馏水稀释至2000mL，棕色瓶保存，710日后使用。c0.2mol/L磷酸-柠檬酸缓冲液配制方法：母液A（0.2mol/L的Na2HPO4溶液）：称取Na2HPO412H2O143.256g，用

49、去离子水定容至2L。母液B（0.1mol/L的柠檬酸溶液）：称取一水柠檬酸42.028g用去离子水溶解定容至2L。d Folin试剂甲配制方法：试剂 1，称取10g氢氧化钠溶于400mL蒸馏水中， 加入50g无水碳酸钠，溶解，待用。试剂2，称取0.5g酒石酸钾钠，溶于80mL蒸馏水中，加入0.25g五水硫酸铜，溶解。 将试剂1：试剂2：蒸馏水按20：4：1的比例混合即可。然后 4保存。 eFolin试剂乙配制方法：在500mL的磨口回流装置内加入二水钨酸钠25.0359g，二水钼酸钠6.2526g，蒸馏水175mL，85磷酸12.5mL浓盐酸25mL，充分混合。回流10小时，再加硫酸锂37.5

50、g，蒸馏水12.5mL及数滴溴。然后开口沸腾15min，以驱除过量溴，冷却后定容到250mL。 于棕色瓶中保存。flmol/L NaOH溶液配制方法：40gNaOH溶于水，定容至1000ml。g2.0mg/ml葡萄糖标准液的配制方法：2g葡萄糖溶于水，定容至1000ml。h牛血清蛋白标准溶液制备方法：0.05g牛血清蛋白溶于水，定容至100ml。i6%-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷（KH570）偶联剂的制备方法：将无水乙醇与蒸馏水按体积比78：22混合后的得到乙醇溶液，再将KH570与乙醇溶液按体积比6：94混合均匀。 2.2 实验方法2.2.1蒙脱石的预处理a蒙脱石的提纯：利用静沉降法提纯

51、蒙脱石原土,提纯后加入10%H2O2煮2h去除有机物。去有机物的蒙脱石经过200目筛筛选，取一定量加入到去离子水中，超声分散至无明显颗粒沉淀，再向悬浮液中加入碳酸钠，搅拌至完全溶解，超声30min，离心，下层沉淀重复以上步骤3次得钠化处理的蒙脱石。烘干后过200目筛筛选。b蒙脱石的偶联处理：将5g经上部处理过的蒙脱石加入到100ml6%-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷（KH570）偶联剂中，搅拌混匀。隔夜静置后离心，离心后用78%乙醇溶液洗涤后再离心，重复三次。烘干后过200目筛筛选。2.2.2-淀粉酶和糖化酶的固定化和处理a单酶的固定化取一定量的预先配制好的-淀粉酶或糖化酶酶液，然后将定量的

52、预处理过的蒙脱石加入到酶液中，恒温搅拌。然后使其固定一段时间后，以7000-8000转速（每分钟）离心10分钟，收集上清液，然后以缓冲液洗涤沉淀物，再在同样条件下离心，重复三次。然后将固定化酶取出，加入到缓冲液中，震荡使其混匀，低温保存。根据不同的实验要求改变载体活化温度、活化时间、载体pH、加酶量、酶与载体的比例及固定化温度、pH重新固定，以达到最佳固定化条件。b双酶的共固定化取一定量的两种酶液按一定比例混合均匀。然后将定量的预处理过的蒙脱石加入到酶液中，恒温搅拌。然后使其固定一段时间后，以7000-8000转速（每分钟）离心10分钟后，收集上清液，然后以缓冲液洗涤沉淀物，再在同样条件下离心

53、，重复三次。然后将固定化酶取出，加入到缓冲液中，震荡使其混匀，低温保存。根据不同的实验要求改变载体活化温度、活化时间、载体pH、加酶量、双酶与载体的比例及固定化温度、pH重新固定，以达到最佳固定化条件。2.2.3还原糖含量的测定还原糖含量的测定采用DNS比色法。a葡萄糖标准曲线的制作：取5支15mm180mm试管，分别编号为0，1，2，3，4，5，6。分别加入2.0mg/ml葡萄糖标准液0ml，0.2ml，0.4ml，0.6ml，0.8ml，1.0ml和蒸馏水1ml，0.8ml，0.6ml，0.4ml，0.2ml，0ml。然后在上述试管中分别加入DNS试剂2.0ml，于沸水浴中加热2min进行

54、显色，取出后用流动水迅速冷却，各加入蒸馏水27.0ml，摇匀，在540nm波长处测定光吸收值。以1.0ml蒸馏水代替葡萄糖标准液按同样显色操作为空白调零点。以葡萄糖浓度（mgml）为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。b样品中含还原糖量的测定在15mm180mm试管加1ml待测溶液，再加入DNS试剂2.0ml。加完试剂后，于沸水浴中加热2min进行显色，取出后用流动水迅速冷却，各加入蒸馏水27.0ml，摇匀，在540nm波长处测定光吸收值。测定后，取样品的光吸收平均值在标准曲线上查出相应的糖量。2.2.4蛋白质含量的测定蛋白质含量的测定采用Folin酚试剂法。a牛血清白蛋白标准曲线的制作取

55、6 支普通试管，加入标准浓度的牛血清白蛋白溶液和蒸馏水，配成一系列不同浓度的牛血清白蛋白溶液。然后各加试剂甲4.5mL，混合后在室温下放置10min，再各加0.5ml 试剂乙，立即混合均匀（这一步速度要快，否则会使显色程度减弱）。30min 后，以不含蛋白质的0 号试管为对照，用722 型分光光度计于650nm 波长下测定各试管中溶液的光密度并记录结果。以蛋白质浓度（mgml）为横坐标，光密度值为纵坐标，绘制标准曲线。b样品中含蛋白质含量的测定取普通试管4支，前三支为平行样，各加入待测溶液0.5mL。第四只为参比样，加入0.5ml蒸馏水。分别加入试剂甲4.5mL，混匀后放置10min，再各加试

56、剂乙0.5mL，迅速混匀，室温放置30min。以第四支试管溶液为参比，于650nm 波长下测定光密度，并记录结果。2.2.5-淀粉酶和糖化酶酶活的测定取四支15mm180mm试管，前三支做平行样，各加入10ml提前用缓冲液配制好的2%淀粉溶液10ml。第四支做参比样，加入10ml蒸馏水。然后再用四支试管各取5ml稀释的酶液，将淀粉溶液与酶液在60下预热5min后将酶液各加入到淀粉溶液中反应3min，然后迅速各加入5ml浓度为1mol每L的NaOH溶液5ml，然后将试管在沸水浴中放置5min。冷却后各取1ml，与DNS反应后，各加入27ml蒸馏水。以第四支试管溶液为参比测出在540nm下的OD值

57、，由葡萄糖标准曲线中读取相应的葡萄糖含量，进而根据的酶活定义计算出其酶活。酶活力单位的定义：-淀粉酶活力单位（U）: 将-淀粉酶酶液于60及pH6.0条件下，每分钟分解可溶性淀粉产生lmg还原糖的酶量为一个酶活单位。糖化酶活力单位（U）: 将糖化酶酶液60及pH4.5条件，每分钟分解可溶性淀粉产生1mg还原糖的酶量为一个酶活力单位。计算公式： （公式2-1）式中： 取样品的光吸收值在标准曲线上查出相应的糖量的密度（mg/ml）V糖经酶作用的淀粉溶液的总体积（ml）m酶液中酶的质量（g）V酶液酶稀释后的体积（ml）t反应时间（min）本公式同样适用于固定化酶。2.2.6共固定化酶固定率的计算计算

58、公式共固定化酶上清液蛋白质浓度的计算：（公式2-2）式中：清：上清液蛋白质浓度（gml）：-淀粉酶酶液蛋白质浓度（gml）糖：糖化酶酶液蛋白质浓度（gml）V：所取-淀粉酶酶液体积（ml）V糖：所取糖化酶酶液体积（ml）V定：混合酶液定容后的体积，本实验一律定容至5ml固定率的计算：（公式2-3）式中：固定率，其他同上。2.2.7最佳固定化条件的研究a双酶最佳比例的研究取8支10ml离心管，按表2.3制作固定化酶。表2.1 不同酶活比例的固定化酶的制备试管号12345678-淀粉酶量酶活单位（U）1515151515151515酶液体积（ml）22222222糖化酶量酶活单位（U）37.518

59、.7512.59.387.56.255.364.69酶液体积（ml）251.250.830.630.50.420.360.31酶活力单位比值0.40.81.21.62.02.42.83.2使用缓冲液分别定容至5ml，各加入0.2g蒙脱石，混匀，静置b酶与蒙脱石之间比例研究取8支10ml离心管，按表2.4制作固定化酶。表2.2 不同酶与蒙脱石之间比例的固定化酶的制备试管号12345678-淀粉酶量酶活单位（U）15酶液体积（ml）2糖化酶量酶活单位（U）7.5酶液体积（ml）0.5使用缓冲液分别定容至5ml加入蒙脱石的量（g）0.050.10.150.20.250.30.350.4混匀，静置c最

60、佳固定pH的研究取5支10ml离心管，分别取2ml-淀粉酶酶液，0.5ml糖化酶酶液，蒙脱石0.2g，按以上步骤制作固定化酶。以上五支试管制作固定化酶时，管内各组分pH，包括酶液pH，缓冲液pH必须严格控制。五支离心管内PH分别为3.5，4.5，5.5，6.5，7.5。d最佳固定温度的研究取4支10ml离心管，分别取2ml-淀粉酶酶液，0.5ml糖化酶酶液，蒙脱石0.2g，按以上步骤制作固定化酶。然后分别放置于0，室温（约为20），40，60温度下保存。共固定化酶制作完成后，分别测其酶活力和离心后上清液的蛋白质浓度，利用这些数值分析得双酶的最佳比例、酶与蒙脱石的最佳比例、固定时的最佳PH和固定

61、时的最佳温度（使用分光光度计时，测还原糖含量参比样为未加入淀粉反应后的的溶液，测蛋白质含量时参比样同标准曲线制作时参比样，以下均以此为参比）。2.2.8共固定化酶性质的研究以下实验均为在共固定化最佳条件下完成的固定。所使用的共固定化酶均为酶液，酶液的制作方法为：双酶经固定化后，取上清液经离心并经缓冲液洗涤后，用缓冲液将其溶解并定容。a共固定化酶的最适反应温度：分别在20，30，40，50，60，70，80的温度下测定共固定化酶的催化反应速率。b共固定化酶的最适PH：分别在PH分别为2.5，3.5，4.5，5.5，6.5，7.5下测定共固定化酶的催化反应速率。c共固定化酶的热稳定性：将共固定化酶

62、固定后分别放在0，20，40，60，80下放置2小时后测其催化反应速率。d共固定化酶的储藏稳定性：将共固定化酶固定后分别在0放置010天后测其每隔两天天的催化反应速率。e共固定化酶的操作稳定性：将固定化酶催化反应后，离心取其沉淀，然后用缓冲液洗涤，再离心。重复三次后再次催化反应。这样反应7次，计算每次的反应速率。273 结果与分析3.1淀粉酶和糖化酶酶活的测定3.1.1葡萄糖标准曲线的制作按2.2.2制作葡萄糖标准曲线，得到结果见下表表3.1 葡萄糖标准曲线的测定管号葡萄糖浓度（mgml）OD540000.00010.40.18020.80.37931.20.55141.60.73752.00.908标准曲线如下图3.1 葡萄糖标准曲线标