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1、大肠杆菌R基因克隆载体的构建与鉴定摘要DNA的重组与转化是分子生物学的根本实验操作。本实验可分为质粒 DNAIS取与鉴定，目的片段扩增与鉴定，DNA1组与转化三局部。本次实验可以 全面提高学生的实验技能与逻辑思维，对于分子实验技能的培养具有重要意义。关键词DNA重组；转化；分子实验根本操作大肠埃希氏菌是常用的实验菌种，其质粒R-pGEX-4T-1为人工设计，已参加 R目的基因片段。现需要将 R基因转到pMD18-T Simple Vector载体质粒上，并 将目标质粒转化入大肠杆菌感受态细胞，并检验转化效率。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 菌株与质粒 E. coli DH5 a; R-p
2、GEX-4T-1 质粒；pMD 18-T载体。1.1.2 主要试剂和仪器 溶液I ,溶液H ,溶液田，TE缓冲液，0.5M EDTA 5*TBE,氯仿:异戊醇V:V, 24:1，70叱酉享,50mg/mLCarb, 10*loading-buffer , 2.5mmol/L dNTP 混合物，Taq酶,DNAg板，引物对，10*PCR buffer , 50*TAE, 0.1M CaCL 溶液，LB 固体/液体培养基，5 mg/ml Tet, 34 mg/ml Cam 3 M NaAC 10 mg/mL X - gal , 200 mg/mL IPTG以上常规试剂全部按照分子生物学实验 指导要
3、求配制；恒温摇床，台式离心机，高压灭菌锅，凝胶成像仪，琼脂糖 凝胶电泳系统，PCFB循环仪，低温离心机，超净工作台。1.2 方法1.2.1 质粒 DNA提取 向含 Carb100pg/mL白LB液体培养基中接入含 R-pGEX-4T-1质粒的大肠杆菌，37c振荡培养过夜。质粒 DNAffl碱裂解法制备， 具体步骤参照分子生物学实验指南。用1 %琼脂糖凝胶电泳验证质粒提取结 果。1.2.2 质粒DNA酶切与鉴定 运用Xhol酶与EcoRI酶对上述步骤中提取的 质粒R-pGEX-4T-1进展双酶切，酶切反响体系参见表1如下，37c反响1.5小时。并用1 %琼脂糖凝胶电泳验证酶切结果。1.2.3 目
4、的DNAt段的扩增与纯化根据质粒R-pGEX-4T-1的序列，设计一对R基因引物表2用于R基因的扩增。PCRK响体系以质粒DNM模板，用25pL反响体系进展扩增表3，反响条件：94 C预变性5min, 94 C变性40sec, 55 C退火50sec, 72 C延伸50sec,重复30个循环，72 C延伸8min。PC* 物经琼脂凝胶电泳图像分析鉴定，并按照胶回收试剂盒步骤，割胶纯化，回收PCR 产物，-20 C低温保存。L10X PCR缓冲液2.525mmol/L MgCl21.52.5mmol/LdNTP2引物11.5引物21.5Taq DN朦合酶0.2模板 DNA(1ng/ L)2力口
5、ddH2O 至25 d L13.8EcoR1 LXhol1科L10X H Buffer2dL质粒DNA8科LW1科g表2元由水8dL总体积20 dL （无菌水补至总体积）.扩增表1酶切反响体系 表3 PCR反响体系R基因所用引物5 -CGGAATTCATGGACGGTCAGA-3 ,600bp25 -GCGTCGACTCATTCAGATTTGCG-3 1.2.4 DNA重组与转化 用CaCb处理大肠杆菌，制备感受态细胞，具体步骤参 照分子生物学实验指南。按照表4构建连接重组体系，16c连接反响30min, 制备重组质粒。将5仙L连接产物参加至200仙L DH&感受态细胞中,冰中放置 30min
6、；热激，恢复性培养后去上清涂布于含有X-gal、IPTG、Ampl勺LB琼脂平板培养基，倒置平皿 37c培养过夜1216h，形成单菌落，计数白色、蓝色 菌落。表4质粒连接重组体系pMD18-T Simple Vector 50ng/ 仙 L仙 LInsert DNA 0.1pmol 0.3pmol3pLddH2O up to 5 L Ligation Mix5 仙 L总体积10卜L2结果2.1 质粒DNAE取结果鉴定2.1.1 质粒提取后，1%琼脂糖凝胶电泳。实验结果图缺失2.1.2 质粒双酶切二次鉴定，1%琼脂糖凝胶电泳如图一显示出特异性条带 说明质粒中确含有R基因，质粒提取成功。M 1M
7、1M : DL2000 maker； 1 ：双酶切结果产物M: DL2000 maker； 1 ： R基因 PCR2哪!图一 质粒R-pGEX-4T-1双酶切鉴定结果图2 R基因PC既定结果2.2 目的DN*段的扩增鉴定 用所设计的引物对目的片段 R基因进展克隆， 得到R基因600bp如图二条带清晰、亮度高，证明 PCR吉果较为理想。2.3 DNA转化结果鉴定 本局部实验结果不成功，培养基外表涂花，无单菌落 长出。3讨论细菌质粒的获取，与DNAt组与转化，是分子生物学的根本实验操作。在本 次实验中。成功实现了质粒DNA勺提取与鉴定，目的基因的克隆与鉴定，细菌感 受态细胞制备与质粒DNA1组与转化。在实验中，也有操作不理想之处。分析DNA专化鉴定没有结果的原因，有以 下几点：Amp可能参加过早，未待平板冷却，导致参加的Amp失活，故没有Amp抗性的培养基上长满了菌，而不出现白色的单菌落；烧热的涂棒未冷却便进展菌液涂布，导致培养基外表融化；菌液未充分混匀，平板菌落分布不均等。参考文献962高小焕，邵世和，段秀杰，谢立苹，2011.幽门螺杆菌IV型分泌系统cagX基因缺失株的构建与鉴定.某某大学学报医学版，212： 117-121
大肠杆菌R基因克隆载体地构建与鉴定
