课题3　血红蛋白的提取和分离

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1、课题3血红蛋白的提取和分离课程目标1尝试对血液中血红蛋白的提取和分离。2体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法。3了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的原理。基础知识蛋白质的各种特性的差异如分子的_和_、所带_、溶解度、_和对其他分子的亲和力，等等，可以用来分离不同种类的蛋白质。一、凝胶色谱法1概念：凝胶色谱法也称做_，是根据_的大小分离蛋白质的有效方法。2原理：大多数凝胶是由_化合物构成的小球体，内部有许多贯穿的通道，当不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量_的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程_，移动速度_；而相对分子质量_的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在_移动，路程_，移动速度

2、_。相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。3凝胶材料：_性，_类化合物，如葡聚糖或_。4具体过程：（1）_混合物上柱。（2）洗脱开始，_的蛋白质_进入凝胶颗粒内；相对分子质量_的蛋白质则被排阻于凝胶颗粒之外。（3）_的蛋白质被滞留；_的蛋白质向下移动。（4）相对分子质量不同的分子完全分开。（5）_的蛋白质行程较短，已从_中洗脱出来，_的蛋白质还在行进中。提示：洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。二、缓冲溶液1作用：在_内，能够抵制外界的_对溶液_的影响，维持_基本不变。2配制：通常由_溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的_就可以制得在不同_使用的缓冲液。三、电泳1概念：带电

3、粒子在_的作用下发生_的过程。2原理：许多重要的生物大分子，如_、_等都具有_的基团，在一定pH下，这些基团会带上_或_。在电场的作用下，这些带电分子会向着与所带电荷_移动。电泳利用了分离样品中各种分子_以及分子本身的_、_不同，使带电分子产生不同的_，从而实现样品中各种分子的分离。3分类：_凝胶电泳、_凝胶电泳。在测定蛋白质相对分子质量时通常使用_凝胶电泳。蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带_的多少以及_等因素。而在SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳中，SDS能使蛋白质发生_，由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会_成单条肽链，因此测定的结果只是_的相对分子质量。同时SDS所带的大量

4、负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于_。四、蛋白质的提取和分离蛋白质的提取和分离一般分为四步：_、粗分离、_和_。1样品处理及粗分离血液由_和_组成，其中红细胞最多。红细胞的组成中，除水分以外，约90%是_。血红蛋白由_条肽链组成，包括两条_和两条_。其中每条肽链环绕一个_基团，此基团可携带一分子氧或一分子_。血红蛋白因含有_而呈现_色。（1）红细胞的洗涤目的：去除_。方法：采用_离心，如500 rmin1离心2 min，然后用胶头吸管吸出上层透明的黄色_，将下层_的红细胞液体倒入_，再加入五倍体积的_，缓慢搅拌_，低速短时间离心，

5、如此重复洗涤三次，直至上清液中没有_，表明红细胞已洗涤干净。（2）血红蛋白的释放将洗涤好的红细胞倒入烧杯中，加_到_体积，再加40%体积的_，置于磁力搅拌器上充分搅拌10 min。在_和_的作用下，红细胞_，释放出血红蛋白。（3）分离血红蛋白溶液：将搅拌好的混合液离心后可观察到试管中溶液分为4层（从上往下）：第1层：_的甲苯层。第2层：脂溶性物质的沉淀层_薄层固体。第3层：_的水溶液红色透明液体。第4层：其他杂质的_沉淀物。将液体用_过滤，除去_，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的_液体。（4）透析：取1 mL的_溶液装入_中，将其放入盛有300 mL的物质的量浓度为20 mmolL1的_中（

6、pH为_），透析12 h。透析袋一般是用硝酸纤维素（又称玻璃纸）制成的，能使_自由进出，而将_保留在袋内。透析可以去除样品中相对分子量较_的杂质，或用于更换样品的_。2纯化凝胶色谱操作处理后的样品还含有其他种类的蛋白质分子（如呼吸酶等），因此要将杂蛋白与血红蛋白进行分离。第一步要制作_。第二步要_，因为_的凝胶和用_平衡好的凝胶的体积差别很大，所以装柱前需要根据色谱柱的内体积计算所需要的凝胶量。在装填凝胶柱时，不能有_存在。第三步是样品的_和_。3纯度鉴定SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳判断_的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质纯度的鉴定。鉴定方法中使用最多的是SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。五、注意事项1

7、红细胞的洗涤洗涤次数、离心速度与离心时间十分重要。洗涤次数过少，无法除去_；离心速度过高和时间过长会使_等一同沉淀，达不到分离的效果，影响后续血红蛋白的提取纯度。2色谱柱填料的处理商品凝胶是干燥的颗粒，使用前需直接放在_中膨胀。为了加速膨胀，可以将加入_的湿凝胶用_加热，逐渐升温至接近沸腾。这种方法不仅时间_，还能除去凝胶中可能带有的_，排除胶粒内的_。3凝胶色谱柱的装填装填凝胶时要尽量_，从而降低颗粒之间的空隙。不能有_存在，因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的_，降低分离效果。洗脱液不能_，露出凝胶颗粒，否则需重新装填。4蛋白质的分离分离过程中，仔细观察_在洗脱过程中的移动情况。如果色谱柱装填成

8、功、分离操作正确，能清楚地看到红色区带狭窄、平整、均匀一致地随着洗脱液缓慢移动；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离效果不好，与凝胶色谱柱的装填有关。答案：形状大小电荷的性质和多少吸附性质一、1.分配色谱法相对分子质量2多糖类较小较长较慢较大凝胶外部较短较快3多孔多糖琼脂糖4（1）蛋白质（2）相对分子质量较小扩散较大（3）相对分子质量较小相对分子质量较大（5）相对分子质量较大层析柱相对分子质量较小二、1.一定范围酸和碱pHpH212种缓冲剂使用比例pH范围内三、1.电场迁移2多肽核酸可解离正电负电相反的电极带电性质不同大小形状迁移速度3琼脂糖聚丙烯酰胺SDS聚丙烯酰胺净电荷分子的大小完全变性

9、解聚单条肽链分子的大小四、样品处理纯化纯度鉴定1血浆血细胞血红蛋白四肽链肽链亚铁血红素二氧化碳血红素红（1）杂蛋白低速短时血浆暗红色烧杯生理盐水10 min黄色（2）蒸馏水原血液甲苯蒸馏水甲苯破裂（3）无色透明白色血红蛋白暗红色滤纸脂溶性沉淀层红色透明（4）血红蛋白透析袋磷酸缓冲液7.0小分子大分子小缓冲液2凝胶色谱柱装填凝胶色谱柱干缓冲液气泡加入洗脱3纯化五、1.血浆蛋白白细胞2洗脱液洗脱液沸水浴短微生物空气3紧密气泡洗脱次序流干4红色区带重点难点1血红蛋白分离的完整过程血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，分别是样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操

10、作收集到血红蛋白溶液，即样品的处理；再经过透析去除相对分子质量较小的杂质，即样品的粗分离；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去，即样品的纯化；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。特别提醒不是所有种类的蛋白质的提取和分离都是这样的，蛋白质的来源和性质不同，分离方法差别很大。规律总结提取血红蛋白的实验材料要选择哺乳动物血液，因为其红细胞中无细胞核，结构简单，血红蛋白含量高。而提取DNA的实验材料要选择鸡的红细胞，因为其具有细胞核，含有DNA。2缓冲溶液在一定范围内，能对抗少量外来强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液pH发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。缓冲溶液

11、通常是由一种或两种化合物（缓冲剂）溶解于水中制得的，调节缓冲剂的配比就可制得不同pH范围的缓冲液。缓冲溶液的作用是维持反应体系的pH不变。在生物体内进行的各种生物化学过程都是在精确的pH下进行的，受到氢离子浓度的严格调控。为了在实验室条件下准确地模拟生物体内的天然环境，就必须保持体外生物化学反应过程有与体内过程完全相同的pH。特别提醒实验中缓冲液用量要远多于血红蛋白溶液量，有利于杂质分子充分地向外扩散。3用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的相对分子质量使用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的相对分子质量时，可选用一组已知相对分子质量的标准蛋白同时进行电泳，根据已知相对分子质量的标准蛋白的电泳

12、区带位置，用电泳迁移率和相对分子质量的对数作标准曲线，可以测定未知蛋白质的相对分子质量。具体步骤如下：（1）根据厂家说明书安装电泳用的玻璃板；（2）SDS聚丙烯酰胺凝胶制备；（3）样品处理；（4）把凝胶固定于电泳装置上；（5）加样：按顺序加样，加样量通常为1025 L，样品可以多加几个；（6）电泳；（7）剥胶；（8）染色；（9）脱色；（10）观察结果。特别提醒SDS电泳的成功关键之一是电泳过程中，特别是样品制备过程中蛋白质与SDS的结合程度。由于制备凝胶的丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有很强的神经毒性，并且容易被皮肤吸收，因此操作必须在通风橱内或通风处进行。TEMED和过硫酸铵对黏膜和上呼吸道组织、眼

13、睛、皮肤等有很大的破坏作用，吞服可致命。因此在进行电泳操作时一定按照实验要求和步骤，在老师的指导下完成。操作时要戴好一次性手套。4凝胶色谱操作中凝胶的装填凝胶色谱操作中凝胶的装填要紧密、均匀。凝胶实际上是一些微小的多孔球体，小球体内部有许多贯穿的通道。相对分子质量较大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部，只能分布在颗粒之间，通过的路程较短，移动速度较快；相对分子质量较小的蛋白质分子比较容易进入凝胶内的通道，通过的路程较长，移动速度较慢。因此，样品中相对分子质量较大的蛋白质先流出，相对分子质量中等的分子后流出，相对分子质量最小的分子最后流出，从而使各种相对分子质量不同的分子得以分离。如果凝胶装填得不

14、够紧密、均匀，就会在色谱柱内形成无效的空隙，使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过，搅乱洗脱液的流动次序，影响分离的效果。典型例题题型一 凝胶色谱法的原理与操作【例题1】 利用凝胶色谱法什么样的蛋白质先洗脱出来？（）A相对分子质量较大的B溶解度高的C相对分子质量较小的D所带电荷多的解析：相对分子质量较小的蛋白质能进入凝胶内部通道，路程较长，移动速度较慢；相对分子质量较大的蛋白质，路程较短，移动速度较快，首先洗脱出来。答案：A反思领悟：凝胶色谱法是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。题型二 电泳技术的原理与操作【例题2】 关于电泳的说法不正确的是（）。A电泳是指带电粒子在电场的作用

15、下发生迁移的过程B带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动C蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少D用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，蛋白质的电泳迁移率完全取决于分子的大小解析：蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素，SDS能与各种蛋白质形成蛋白质SDS复合物，SDS 所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差异，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。答案：C反思领悟：电泳利用了分离样品中各种分子带电性质不同以及分子本身的大小、形状不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。题型三 蛋白质

16、的提取和分离【例题3】 （2011广东理综）以下关于猪血红蛋白提纯的描述，不正确的是（）。A洗涤红细胞时，使用生理盐水可防止红细胞破裂B猪成熟红细胞中缺少细胞器和细胞核，提纯时杂蛋白较少C血红蛋白的颜色可用于凝胶色谱法分离过程的监测D在凝胶色谱法分离过程中，血红蛋白比相对分子质量较小的杂蛋白移动慢解析：大分子物质由于分子直径较大，不易进入凝胶颗粒的微孔，而只能分布颗粒之间，所以在洗脱时向下移动的速度较快，相反，相对分子质量较小的物质向下移动速度较慢。答案：D随堂练习1凝胶色谱法是分离蛋白质分子的一种常用方法。但并非所有的蛋白质都可用此方法进行分离。能分离的蛋白质分子之间必须（）。A具有相同的相

17、对分子质量B相对分子质量不同，但都是相对分子质量较大的分子C相对分子质量不同，但都是相对分子质量较小的分子D相对分子质量不同2电泳过程中，什么样的分子迁移速度最快？（）A纤维状、大分子B纤维状、小分子C球状、大分子D球状、小分子3蛋白质提取和分离分为哪几步？（）A样品处理、凝胶色谱操作、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳B样品处理、凝胶色谱操作、纯化C样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定D样品处理、纯化、粗分离、纯度鉴定4在蛋白质的提取和分离中，关于对样品处理过程的分析无误的是（）。A洗涤红细胞的目的是去除血浆中的葡萄糖、无机盐B洗涤时离心速度过小，时间过短，白细胞等会沉淀，达不到分离的效果C洗涤过程选用0

18、.1%的NaCl溶液D透析的目的是去除样品中相对分子质量较小的杂质答案：1D若在每种凝胶分离范围之外的分子，在不改变凝胶种类的情况下是很难分离的。对于分子大小不同，但同属于凝胶分离范围内的各种分子，在凝胶床中的分布情况是不同的：分子较大的只能进入孔径较大的那一部分凝胶孔隙内，而分子较小的可进入较多的凝胶颗粒内，这样分子较大的在凝胶床内移动距离较短，分子较小的移动距离较长。这样利用分子筛可将相对分子质量不同的物质分离。相对分子质量大小不同的多种成分在通过凝胶床时，按照相对分子质量大小“排队”，即形成凝胶表面分子筛效应。2D电泳就是利用了连续分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同。一般来说，球状分子比纤维状分子易移动，小分子比大分子易移动。3CA中凝胶色谱操作及SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳为实验操作过程中的技术。4D洗涤红细胞的目的是去除血浆中除血红蛋白以外的杂蛋白；洗涤时离心速度过大，时间过长，白细胞等会沉淀，达不到分离的效果；洗涤过程选用0.9%的NaCl溶液。