常用分子生物学技术的原理及应用

《常用分子生物学技术的原理及应用》由会员分享，可在线阅读，更多相关《常用分子生物学技术的原理及应用（112页珍藏版）》请在装配图网上搜索。

1、常用分子生物学技术的原理及应用常用分子生物学技术的原理及应用常用分子生物学技术的常用分子生物学技术的原理及应用原理及应用The popular technology in molecular biology: principle and application常用分子生物学技术的原理及应用常用分子生物学技术的原理及应用第一节 分子生物学发展概述分子生物学发展概述常用分子生物学技术的原理及应用常用分子生物学技术的原理及应用l分子生物学分子生物学molecular biology是在分子水平上是在分子水平上研究生物的结构、组织和功能的科学。研究生物的结构、组织和功能的科学。l1950年，年，Ast

2、bury在一次学术报告中，首在一次学术报告中，首次提出并使用了分子生物学这一名词术语。次提出并使用了分子生物学这一名词术语。l医学分子生物学医学分子生物学是应用分子生物学技术和是应用分子生物学技术和理论来阐明人体正常生理活动和病理过程理论来阐明人体正常生理活动和病理过程及其调控的分子机理的一门科学。及其调控的分子机理的一门科学。概概 述述常用分子生物学技术的原理及应用常用分子生物学技术的原理及应用一、分子生物学一些重要的理论知识一、分子生物学一些重要的理论知识1.分子生物学发展史上一些重要的事件分子生物学发展史上一些重要的事件（1）1865年，年，“遗传学之父遗传学之父”G.Mendel根据根

3、据豌豆杂交试验结果，豌豆杂交试验结果，创立了遗传因子学说创立了遗传因子学说，即，即遗传的分离律和自由组合律。遗传的分离律和自由组合律。（2）1903年年W.Sutton提出提出染色体染色体是是Mendel遗遗传单位的载体的概念。传单位的载体的概念。（3）1909年，年，W.Johannsen将这种在染色体将这种在染色体上的遗传单位上的遗传单位定名为基因定名为基因（gene）。）。常用分子生物学技术的原理及应用常用分子生物学技术的原理及应用（4）1910年，现代实验遗传学奠基人年，现代实验遗传学奠基人TH.Morgan和他的研究生在研究果蝇的遗和他的研究生在研究果蝇的遗传规律时发现了传规律时发现

4、了基因的连锁律和交换律基因的连锁律和交换律。（5）1944年，年，OT.Avery等人（等人（3人）分离人）分离出细菌出细菌 DNA，并发现，并发现DNA是携带生命遗传是携带生命遗传物质的分子。物质的分子。（6）1950年，年，Astbury在一次演讲中，首在一次演讲中，首次使用了次使用了 “分子生物学分子生物学” 术语术语。常用分子生物学技术的原理及应用常用分子生物学技术的原理及应用（7）1953年，Watson和Crick提出了DNA结构的双螺旋模型，揭示了遗传物质自我复制的机制。 （8）1961年至年至1966年，年，Nirenberg和和Crick 等人等人破译了破译了DNA遗传密码遗

5、传密码，1966年年 破译了破译了64个遗传个遗传密码。密码。 提出了遗传信息由提出了遗传信息由DNA RNA蛋白质传递蛋白质传递的的中心法则中心法则。 （9）1969年，年，Jonathan Beckwith及其同事在哈及其同事在哈佛大学成功佛大学成功分离出第一个基因分离出第一个基因。常用分子生物学技术的原理及应用常用分子生物学技术的原理及应用（10） 1961年，年，F.Jacob和和J.Monod提出了提出了乳糖乳糖操纵子学说操纵子学说。 （11）1970年，发现了年，发现了逆转录酶逆转录酶。（12）自）自1946年起的年起的20年当中，陆续发现了许年当中，陆续发现了许多多质粒质粒；19

6、68年至年至1970年又发现了许多年又发现了许多限制性限制性内切酶内切酶，为，为DNA体外重组提供了有利工具。体外重组提供了有利工具。（13）1973年，年，重组重组DNA技术问世技术问世。（14）1986年，年，K.Mullis等建立了等建立了PCR技术技术（15）1990年，年，人类基因组计划。人类基因组计划。常用分子生物学技术的原理及应用常用分子生物学技术的原理及应用DNADNA的结构、复制、中心法则的结构、复制、中心法则基本构成单位是基本构成单位是核苷酸核苷酸核苷酸由核苷酸由脱氧核糖、碱基和磷酸脱氧核糖、碱基和磷酸构成。构成。碱基分别是碱基分别是腺嘌呤腺嘌呤 (A)(A)、鸟嘌呤、鸟嘌

7、呤 (G)(G)、胸腺嘧啶胸腺嘧啶 (T)(T)和胞嘧啶和胞嘧啶(C)(C)。相邻的两个核苷酸以相邻的两个核苷酸以磷酸二酯键磷酸二酯键相连相连进一步盘旋、折叠，形成进一步盘旋、折叠，形成三级或四级结三级或四级结构构 2.一些重要理论一些重要理论important theory常用分子生物学技术的原理及应用常用分子生物学技术的原理及应用u五碳糖为五碳糖为核糖核糖( (不是脱氧核糖不是脱氧核糖) )；u碱基中有碱基中有尿嘧啶尿嘧啶U(uracil)U(uracil)而没有胸腺嘧而没有胸腺嘧啶啶uRNARNA为为单链单链，不是双链，但，不是双链，但RNARNA单链之间单链之间相邻的碱基可由氢键作用形

8、成局部双链。相邻的碱基可由氢键作用形成局部双链。 uDNADNA存在于细胞核的染色体、线粒体存在于细胞核的染色体、线粒体以及以及染色体以外的质粒中染色体以外的质粒中( (质粒是一些双链，闭质粒是一些双链，闭环的环的DNADNA分子分子) )。RNA与与DNA有如下不同点有如下不同点：常用分子生物学技术的原理及应用常用分子生物学技术的原理及应用 DNA(DNA(或或RNA) RNA) 结构给我们的启示结构给我们的启示DNA(DNA(或或RNA)RNA)是是水溶性的水溶性的。这是由于含有。这是由于含有磷酸基因、羟基和氨基。在核酸提取过程磷酸基因、羟基和氨基。在核酸提取过程中，我们中，我们保留的是水

9、相、而不是有机相保留的是水相、而不是有机相。核酸是核酸是两性电离两性电离，既带正电荷，又带负，既带正电荷，又带负电荷。它的等电点电荷。它的等电点(PI)(PI)为为2 22.52.5。在中性。在中性溶液中带负电荷。对核酸进行溶液中带负电荷。对核酸进行电泳时，点电泳时，点样时应点在负极样时应点在负极；杂交时选择尼龙膜时，；杂交时选择尼龙膜时，最好最好选择带正电荷的尼龙膜选择带正电荷的尼龙膜。( (核酸带负电荷，核酸带负电荷，容易吸附到带正电荷的膜上，牢固，不掉容易吸附到带正电荷的膜上，牢固，不掉) ) 常用分子生物学技术的原理及应用常用分子生物学技术的原理及应用DNADNA在细胞中存在部位不同在

10、细胞中存在部位不同( (细胞核、线粒细胞核、线粒体、质粒体、质粒) )，所以应注意提取方法的不同，所以应注意提取方法的不同 由于由于DNADNA空间构象不同空间构象不同，在电泳时迁移率，在电泳时迁移率不同。不同。根据根据碱基互补配对原则碱基互补配对原则，可设计引物和探，可设计引物和探针杂交。针杂交。由于由于DNADNA的双螺旋结构和的双螺旋结构和RNARNA易由于分子内易由于分子内氢链作用形成二级结构，所以在进行杂交等氢链作用形成二级结构，所以在进行杂交等反应时，首先反应时，首先应加热变性，破坏二级结构。应加热变性，破坏二级结构。常用分子生物学技术的原理及应用常用分子生物学技术的原理及应用l

11、在在解旋酶解旋酶的作用下，打开的作用下，打开DNADNA双链双链 l 在特定的在特定的复制起始点复制起始点l 以每条以每条DNADNA链为链为模板模板l 在在DNADNA聚合酶聚合酶的催化下的催化下l 以以4 4种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸为前体物，合成为前体物，合成一条互补一条互补DNADNA链。链。DNADNA的复制称为半保留复制。的复制称为半保留复制。DNA的复制的复制常用分子生物学技术的原理及应用常用分子生物学技术的原理及应用DNA 半半 不不 连连 续续 复复 制制常用分子生物学技术的原理及应用常用分子生物学技术的原理及应用 PCR PCR技术的原理：在体外要靠温度技术的原理：在体外要靠

12、温度(90(90以上以上) )打双链，而不是解旋酶，也是以打双链，而不是解旋酶，也是以DNADNA为为模板，需要引物，需模板，需要引物，需DNADNA聚合酶，需要聚合酶，需要dNTPdNTP为前体。为前体。PCRPCR与体内与体内( (细胞内细胞内)DNA)DNA复制的最大复制的最大差异是温度差异是温度。检测核分裂指数：在细胞培养中，检测核分裂指数：在细胞培养中，加入加入3 3H H标记的标记的dNTPdNTP前体物前体物，被细胞摄取后，参与，被细胞摄取后，参与DNADNA复制，复制速度越快，参入的复制，复制速度越快，参入的3 3H H标记的标记的dNTPdNTP越多，可用液闪计数仪检测放射性

13、强度，越多，可用液闪计数仪检测放射性强度，据此判断。据此判断。DNA的复制给了我们一些启示的复制给了我们一些启示常用分子生物学技术的原理及应用常用分子生物学技术的原理及应用p遗传信息的传递是：遗传信息的传递是： DNARNADNARNA多肽多肽( (蛋白质蛋白质) )p在逆转录酶的作用下，在逆转录酶的作用下，RNARNA可形成可形成cDNAcDNA，然后再由然后再由RNARNA蛋白质蛋白质以上就是完整的中心法则理论，亦可称以上就是完整的中心法则理论，亦可称为基因的表达为基因的表达(expression)(expression)。中心法则中心法则常用分子生物学技术的原理及应用常用分子生物学技术的

14、原理及应用中中 心心 法法 则则常用分子生物学技术的原理及应用常用分子生物学技术的原理及应用反义链反义链转录转录(transcription)反义链反义链有意义链有意义链常用分子生物学技术的原理及应用常用分子生物学技术的原理及应用 转录转录(transcription)(transcription) 以以DNADNA为模板，合成为模板，合成RNARNA的过程。的过程。 非模板链称为有意义链，而模板常称为反义链非模板链称为有意义链，而模板常称为反义链。 转录的过程大致是这样的：转录的过程大致是这样的：u 以以DNADNA一条链为一条链为模板模板，u 诱导诱导RNARNA聚合酶活性、聚合酶活性、R

15、NARNA聚合酶识别聚合酶识别并结合在并结合在转录起始位点转录起始位点u 以以ATPATP、GTPGTP、CTPCTP和和UTPUTP为前体，为前体，合成合成( (转录转录)RNA)RNAu 当遇到转录当遇到转录终止信号时，转录即停止终止信号时，转录即停止。常用分子生物学技术的原理及应用常用分子生物学技术的原理及应用由由RNA RNA 蛋白质的过程，又叫翻译蛋白质的过程，又叫翻译。只有聚合。只有聚合酶酶IIII催化的反应产物是催化的反应产物是mRNAmRNA，而只有，而只有mRNAmRNA才翻译才翻译成蛋白质。成蛋白质。基因基因(DNA)(DNA)上三个相邻的碱基组成一个密码子上三个相邻的碱基

16、组成一个密码子，一个密码子决定一种特定的氨基酸，共有一个密码子决定一种特定的氨基酸，共有4 43 3=64=64个个密码子。密码子。在转录过程中，基因上的三联密码子转录成在转录过程中，基因上的三联密码子转录成mRNAmRNA上的三联密码子。上的三联密码子。mRNAmRNA由核内转移至细胞浆中的核糖体上，以由核内转移至细胞浆中的核糖体上，以三三联密码子指导合成蛋白质联密码子指导合成蛋白质。翻译后的翻译后的蛋白质需要加工修饰蛋白质需要加工修饰。 常用分子生物学技术的原理及应用常用分子生物学技术的原理及应用中心法则给了我们一些启示：中心法则给了我们一些启示：遗传信息由遗传信息由DNADNA上的基因决

17、定。上的基因决定。一旦基一旦基因发生突变因发生突变，将最终导致所翻译的蛋白质，将最终导致所翻译的蛋白质发生改变，从而导致生理功能改变，甚至发生改变，从而导致生理功能改变，甚至出现疾病，如癌症、肥胖等。出现疾病，如癌症、肥胖等。 mRNAmRNA更能准确简便地反映更能准确简便地反映DNADNA上基因所上基因所携带的遗传信息携带的遗传信息。因此对基因序列的分析，。因此对基因序列的分析，常分析常分析mRNAmRNA的序列即可。的序列即可。常用分子生物学技术的原理及应用常用分子生物学技术的原理及应用 基因的表达有组织特异性基因的表达有组织特异性，且受许多因，且受许多因素的影响，使素的影响，使mRNAm

18、RNA的表达增强、降低甚至的表达增强、降低甚至关闭，从而影响机体正常生理功能，甚至关闭，从而影响机体正常生理功能，甚至出现疾病。出现疾病。因此因此常需要检测常需要检测mRNAmRNA的表达的丰度的表达的丰度( (含量含量) )，常用方法有常用方法有NorthernblotNorthernblot、RT-PCRRT-PCR。定量。定量(Real time)PCR(Real time)PCR等。等。这里需要特别强调：在检测这里需要特别强调：在检测mRNA(mRNA(或蛋白或蛋白) )表达时，表达时，一定要先弄清该基因在某种组织一定要先弄清该基因在某种组织中是否有表达中是否有表达。常用分子生物学技术

19、的原理及应用常用分子生物学技术的原理及应用 根据中心法则，可以根据中心法则，可以RNARNA为模板，在逆为模板，在逆转录酶作用下形成转录酶作用下形成cDNAcDNA，于是建立了，于是建立了RT-RT-PCRPCR的方法的方法。 根据根据mRNAmRNA的的3 3端有端有poly(A)poly(A)的特点，在的特点，在进行进行反转录时反转录时，就以，就以poly(A)poly(A)为模板设计为模板设计了引物。并且了引物。并且纯化纯化mRNAmRNA的方法的方法，也是根据，也是根据poly(A)poly(A)的原理设计的。的原理设计的。根据最后的翻译蛋白质去向的不同，建根据最后的翻译蛋白质去向的不

20、同，建立立不同的蛋白质提取方法不同的蛋白质提取方法，如在线粒体，如在线粒体，在细胞核、在细胞浆、分泌到血液中在细胞核、在细胞浆、分泌到血液中。 常用分子生物学技术的原理及应用常用分子生物学技术的原理及应用第二节 常用分子生物学技术常用分子生物学技术的原理及应用常用分子生物学技术的原理及应用Molecular CloningVectorsplasmidphagecDNAgenomic libraries cDNA libraries DNA ligationRecombinant DNA moleculesTransformationSelectionchromosome walking mol

21、ecular hybridizationDNA sequencingThe polymerase chain reaction (PCR) inverse PCRreverse transcriptase PCR Quantitative PCR asymmetric PCRRNAiMultiplex PCRSouthern Blotting DNA fingerprintingWestern blottingNorthern blottingArbitrary primer PCRfluorescence in situ hybridization (FISH)Gene chip or DN

22、A chip常用分子生物学技术的原理及应用常用分子生物学技术的原理及应用一一 基因工程与分子克隆基因工程与分子克隆(genetic engineering and molecular cloning)常用分子生物学技术的原理及应用常用分子生物学技术的原理及应用 Research content: genomic library, cDNA library, gene cloning, gene expression, gene regulation, gene knockout 一、用于基因克隆的工具酶一、用于基因克隆的工具酶 (enzymes for gene cloning) 在生物技术中

23、常在生物技术中常用用的的各各种工种工具酶系具酶系指指能用于能用于DNADNA和和RNARNA分子分子的切割、连接的切割、连接、聚合聚合、反转录等有关的各种酶反转录等有关的各种酶系系统称为工具酶。统称为工具酶。常用分子生物学技术的原理及应用常用分子生物学技术的原理及应用常用分子生物学技术的原理及应用常用分子生物学技术的原理及应用常用分子生物学技术的原理及应用常用分子生物学技术的原理及应用由宿主控制的限制与修饰作用使得细菌避免噬菌体感染，如果噬菌体DNA没有被修饰过，进入宿主就会被限制性酶切断。如果被修饰过，其侵染细菌的效率就提高。限制性内切酶及由宿主控制的限制与修饰作用限制性内切酶及由宿主控制的

24、限制与修饰作用常用分子生物学技术的原理及应用常用分子生物学技术的原理及应用 (Molecular Cloning)常用分子生物学技术的原理及应用常用分子生物学技术的原理及应用1. VectorsVectors: A DNA (a plasmid or a phage DNA) that serves as a carrier in gene cloning experiments. 常用分子生物学技术的原理及应用常用分子生物学技术的原理及应用质粒载体必须具备的基本条件(i)具有复制起点具有复制起点 (ii)具有可选择的标记具有可选择的标记 (iii)具有若干限制酶单一识别位点具有若干限制酶单一

25、识别位点 (iv)具有较小的分子量和较高的拷贝数具有较小的分子量和较高的拷贝数 (v)作为表达载体还有启动子，转录、翻译信号，作为表达载体还有启动子，转录、翻译信号，终止子序列等片段。终止子序列等片段。 常用分子生物学技术的原理及应用常用分子生物学技术的原理及应用lacZThe struction of plasmid常用分子生物学技术的原理及应用常用分子生物学技术的原理及应用screen cloning常用分子生物学技术的原理及应用常用分子生物学技术的原理及应用常用分子生物学技术的原理及应用常用分子生物学技术的原理及应用噬菌体载体：Charon系列，分为取代型和插入型：取代型可接受20kb左

26、右的外源DNA，适合于构建基因组文库。插入型只可接受10kb以内的外源DNA，适合于构建cDNA文库。常用分子生物学技术的原理及应用常用分子生物学技术的原理及应用常用分子生物学技术的原理及应用常用分子生物学技术的原理及应用常用分子生物学技术的原理及应用常用分子生物学技术的原理及应用（1）人工合成（一般限于数十个核苷酸的片段） 其原理是在测定肽链或蛋白顺序的基础上，根据遗传密码推测mRNA序列和DNA序列，经严格设计、以化学法合成DNA。生长激素释放抑制因子、胰岛素、干扰素表皮生长因子等基因都曾以这样的方法合成，这种合成还可分段进行，继后再连接。但这类方法很难考虑遗传密码简并以及内含子的存在等问

27、题。2、目标基因的获得常用分子生物学技术的原理及应用常用分子生物学技术的原理及应用(2)逆转录法合成cDNA第一、二条链常用分子生物学技术的原理及应用常用分子生物学技术的原理及应用三、基因组DNA文库目 录常用分子生物学技术的原理及应用常用分子生物学技术的原理及应用四、 染色体步移常用分子生物学技术的原理及应用常用分子生物学技术的原理及应用 是以不同个体或不同细胞来源的基因组片段（包括mRNA-cDNA、cDNA-cDNA、DNA-DNA）之间，在一定条件下变性、复性。一旦某一个体细胞缺失了某一DNA片段或某mRNA不正常表达，在与正常来源的DNA片段或正常表达mRNA的cDNA进行DNA-D

28、NA，cDNA-mRNA或 cDNA-DNA杂交时，未缺失的特定DNA片段或正常表达的mRNA逆转录而合成的cDNA片段就会因没有与其同源的互补顺序而不形成杂交体，从而出现部分单链。通过某种方法，将形成杂交双链的片段排除（消减），未形成完整杂交体的DNA或cDNA片段分离出来，即可得到相应的片段或探针。五、五、 消减杂交常用分子生物学技术的原理及应用常用分子生物学技术的原理及应用常用分子生物学技术的原理及应用常用分子生物学技术的原理及应用一个标准的克隆外源片段过程常用分子生物学技术的原理及应用常用分子生物学技术的原理及应用植物转基因抗虫棉常用分子生物学技术的原理及应用常用分子生物学技术的原理及

29、应用动物转基因生物反应器常用分子生物学技术的原理及应用常用分子生物学技术的原理及应用二二 分子杂交与印迹技术分子杂交与印迹技术Molecular hybridization & blotting technology常用分子生物学技术的原理及应用常用分子生物学技术的原理及应用核酸分子杂交核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization ) 在在DNA复性过程中，把不同复性过程中，把不同DNA单链分单链分子放在同一溶液中，或把子放在同一溶液中，或把DNA与与RNA放在一放在一起，只要在起，只要在DNA或或RNA的单链分子之间有一的单链分子之间有一定的定的碱基配对碱基配对关系，

30、就可在不同的分子之间关系，就可在不同的分子之间形成形成杂化双链杂化双链的这种现象的这种现象。一、分子杂交与印迹技术的原理一、分子杂交与印迹技术的原理杂交的原理实质杂交的原理实质是核酸分子的是核酸分子的变性与复性变性与复性过程过程常用分子生物学技术的原理及应用常用分子生物学技术的原理及应用复性复性RNADNA（一）印迹技术（一）印迹技术1. 具体步骤具体步骤 Southern E 1975年首次应用年首次应用 Southern EM. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophore

31、sis. J Mol Biol，1975, 98(3):503-517. 原始文献出处：原始文献出处：（一）印迹技术（一）印迹技术1. 具体步骤具体步骤 Southern E 1975年首次应用年首次应用 琼脂糖分离的琼脂糖分离的DNA片段片段 变性为单链变性为单链 将一张将一张NC膜放在胶上，上面放吸水纸巾膜放在胶上，上面放吸水纸巾 利用利用毛细作用毛细作用使胶中的使胶中的DNA片段转移到片段转移到NC膜上，使之成为膜上，使之成为固相化分子固相化分子。 载有载有DNA单链分子的单链分子的NC膜可在杂交液与膜可在杂交液与另一种另一种DNA或或RNA分子（探针）分子（探针）杂交杂交，具有，具有互

32、补序列的互补序列的RNA或或DNA结合结合到存在于到存在于NC膜的膜的DNA分子上，经检测分析可分子上，经检测分析可显现显现出杂交分子出杂交分子的的区带区带。2. 印迹印迹(blotting)定义定义将存在于凝胶中的生物大分子转移（印将存在于凝胶中的生物大分子转移（印迹）或直接放在固相化介质上并加以检测分迹）或直接放在固相化介质上并加以检测分析的技术。析的技术。3. 应用应用 广泛用于广泛用于DNA、RNA、蛋白质的检测、蛋白质的检测4. 发展发展 电转移印迹技术、电转移印迹技术、真空吸引转移印迹等真空吸引转移印迹等常用分子生物学技术的原理及应用常用分子生物学技术的原理及应用（二）探针技术（二

33、）探针技术探针探针(probe)的概念的概念 用来检测某一特定核苷酸序列或基用来检测某一特定核苷酸序列或基因序列的因序列的DNA片段或片段或RNA片段片段探针的种类探针的种类n寡核苷酸探针寡核苷酸探针n基因组基因组DNA探针探针ncDNA探针探针nRNA探针探针常用分子生物学技术的原理及应用常用分子生物学技术的原理及应用 将探针与固定在将探针与固定在NC膜上的膜上的DNA或或RNA进进行行结合结合反应，探针的序列如与反应，探针的序列如与NC膜上的核酸序膜上的核酸序列相互补，就可结合到膜上的相应区带，经列相互补，就可结合到膜上的相应区带，经放放射自显影射自显影或或其他检测手段其他检测手段就可判断

34、膜上是否有就可判断膜上是否有同源的核酸分子存在。同源的核酸分子存在。探针技术的概念探针技术的概念常用分子生物学技术的原理及应用常用分子生物学技术的原理及应用二、印迹技术的类别及应用二、印迹技术的类别及应用（一）（一）DNA印迹技术印迹技术 (Southern blotting) （二）（二）RNA印迹技术印迹技术 (Northern blotting) （三）蛋白质的印迹分析（三）蛋白质的印迹分析 (Western blotting) （一）（一）Southern blottingM1 210SSC 转移缓冲液转移缓冲液Whatman滤纸滤纸凝胶凝胶Whatman滤纸滤纸纸巾纸巾玻璃板玻璃板重

35、物重物支持物支持物500g1 2与探针同源杂交的与探针同源杂交的基因基因DNA片段片段基因组基因组DNADNA酶切片段酶切片段内切酶内切酶NC或尼龙膜或尼龙膜NC膜或尼龙膜膜或尼龙膜常用分子生物学技术的原理及应用常用分子生物学技术的原理及应用 基因组基因组DNA的定性与定量分析。的定性与定量分析。 如对在基因组中特异基因的定位及检测等。如对在基因组中特异基因的定位及检测等。重组质粒和噬菌体的分析。重组质粒和噬菌体的分析。Southert blotting用途用途放放射射自自显显影影照照片片（二）（二）RNA印迹技术印迹技术(Northern blotting)相同点：相同点：Alwine JC

36、, et al. Method for detection of specific RNAs in agarose gels by transfer to diazobenzyloxymethyl-paper and hybridization with DNA probes.Proc Natl Acad Sci USA, 1977, 74(12):5350-5354原始文献出处原始文献出处名称相对于名称相对于Southern blotting转移的是转移的是RNA转移前无需酶切转移前无需酶切转移效率较高转移效率较高变性方法变性方法不同点不同点原理均为毛细作用。原理均为毛细作用。 常用分子生物

37、学技术的原理及应用常用分子生物学技术的原理及应用（二）（二）RNA印迹技术印迹技术Northern blotting 用途用途 检测某一组织或细胞中已知的特异检测某一组织或细胞中已知的特异mRNA 的表达水平。的表达水平。 比较不同组织和细胞的同一基因的表达情况。比较不同组织和细胞的同一基因的表达情况。Northern blotting结果结果常用分子生物学技术的原理及应用常用分子生物学技术的原理及应用由于基因组测序的完成由于基因组测序的完成及基因芯片技术的成熟及基因芯片技术的成熟以上两种技术应用的越以上两种技术应用的越来越少来越少常用分子生物学技术的原理及应用常用分子生物学技术的原理及应用（

38、三）蛋白质的印迹技术（三）蛋白质的印迹技术(免疫印迹免疫印迹) 首先将混合蛋白质用首先将混合蛋白质用PAGE按分子大小按分子大小分开，再将蛋白质转移到分开，再将蛋白质转移到NC膜上，蛋白质膜上，蛋白质的位置可保持在胶中的原位上。的位置可保持在胶中的原位上。与与DNA和和RNA印迹相似之处印迹相似之处常用分子生物学技术的原理及应用常用分子生物学技术的原理及应用n蛋白质的转移只有靠电转移。蛋白质的转移只有靠电转移。n蛋白质的检测以蛋白质的检测以抗体抗体作探针。作探针。n用碱性用碱性磷酸酶（磷酸酶（ALP）、辣根过氧化酶）、辣根过氧化酶（HRP）标记第二抗体，）标记第二抗体，底物显底物显色色来检测来

39、检测蛋白区带的信号，底物亦可与蛋白区带的信号，底物亦可与化学发光剂化学发光剂结合以提高敏感度。结合以提高敏感度。n或用同位素标记第二抗体，或用同位素标记第二抗体，放射自显影法放射自显影法检测蛋白区带的信号。检测蛋白区带的信号。与与DNA和和RNA印迹不同之处印迹不同之处常用分子生物学技术的原理及应用常用分子生物学技术的原理及应用Western blotting应用应用 检测样品中的特异蛋白质的存在。检测样品中的特异蛋白质的存在。 细胞中特异蛋白质的定量分析。细胞中特异蛋白质的定量分析。 蛋白质分子的相互作用研究。蛋白质分子的相互作用研究。常用分子生物学技术的原理及应用常用分子生物学技术的原理及

40、应用Western blotting应用应用SDS-PAGE purified recombinant human CK2 subunit and its Western blotting用已知的特异用已知的特异抗体检测目的抗体检测目的基因蛋白基因蛋白三种印迹技术的比较三种印迹技术的比较Western blotting垂直槽垂直槽Northern blotting水平槽水平槽Southern blotting水平槽水平槽常用分子生物学技术的原理及应用常用分子生物学技术的原理及应用 斑点或狭线印迹斑点或狭线印迹 (dot or slot blotting) 原位杂交原位杂交 (in situ h

41、ybridization) DNA芯片技术芯片技术 (DNA chip) 其他印迹技术其他印迹技术常用分子生物学技术的原理及应用常用分子生物学技术的原理及应用三三 PCR技术的原理与应用技术的原理与应用（Polymerase Chain Reaction，PCR）聚合酶链反应聚合酶链反应 PCR技术是技术是1985年由美国科学家年由美国科学家Kary B Mullis建立的建立的体外体外扩增基因片段的方法，它扩增基因片段的方法，它具有特异、敏感、产率高、简便、重复性好、具有特异、敏感、产率高、简便、重复性好、易自动化等易自动化等突出优点突出优点，是分子生物学技术中，是分子生物学技术中一项具有一

42、项具有革命性的创举革命性的创举。 PCR方法被美国方法被美国Science杂志评为杂志评为1989年年的十大科技成就之一，而的十大科技成就之一，而Taq DNA聚合酶聚合酶被被评选为象征评选为象征1989年的年的“年分子年分子”(the molecule of year)。The Nobel Prize in Chemistry 1993for contributions to the developments of methods within DNA-based chemistry Michael Smith1944 -1932 - 2000La Jolla, CA, USA Kary B

43、. Mullis University of British Columbia Vancouver, Canada for his invention of the polymerase chain reaction (PCR) methodfor his fundamental contributions to the establishment of oligonucleotide-based, site-directed mutagenesis and its development for protein studies常用分子生物学技术的原理及应用常用分子生物学技术的原理及应用5 P

44、rimer 15 Primer 2Cycle 2Cycle 15 5 5 5 5 5 Template DNA一、一、PCR技术的工作原理技术的工作原理5 5 5 5 5 5 5 5 常用分子生物学技术的原理及应用常用分子生物学技术的原理及应用Cycle 35 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 2530 次循环后，模板次循环后，模板DNA的含量的含量可以扩大可以扩大100万倍以上。万倍以上。常用分子生物学技术的原理及应用常用分子生物学技术的原理及应用n模板模板DNAn 特异性引物特异性引物n耐热耐热DNA聚合酶聚合酶n dNTPsn Mg2+ PCR体系基本组成成分体

45、系基本组成成分PCR反反应应循循环环变性变性95C左右左右延伸延伸适温适温退火退火Tm-5C 经过经过30个左右的循环后，个左右的循环后，PCR的扩增倍的扩增倍数为数为(1+x)n, x=75%, n为循环数为循环数.常用分子生物学技术的原理及应用常用分子生物学技术的原理及应用2. 利用特异性引物以利用特异性引物以cDNA或基因组或基因组DNA为模为模板获得已知目的基因片段。板获得已知目的基因片段。3. 利用简并引物从利用简并引物从cDNA文库或基因组文库中文库或基因组文库中获得具有一定同源性的基因片段。获得具有一定同源性的基因片段。4. 利用随机引物从利用随机引物从cDNA文库或基因组文库中

46、文库或基因组文库中随机克隆基因。随机克隆基因。1. 与反转录反应相结合，直接从组织和细胞的与反转录反应相结合，直接从组织和细胞的mRNA获得目的基因片段。获得目的基因片段。二、二、PCR技术技术的主要用途的主要用途（一）目的基因的克隆（一）目的基因的克隆常用分子生物学技术的原理及应用常用分子生物学技术的原理及应用（二）基因的体外突变（二）基因的体外突变（三）（三）DNA和和RNA的微量分析的微量分析（四）（四）DNA序列测定序列测定（五）基因突变分析（五）基因突变分析二、二、PCR技术技术的主要用途的主要用途常用分子生物学技术的原理及应用常用分子生物学技术的原理及应用三、几种重要的三、几种重要

47、的PCR衍生技术衍生技术（一）反转录（一）反转录PCR技术技术 (RT-PCR)（二）实时（二）实时PCR技术技术 (real time PCR)（三）反向（三）反向PCR（inverse PCR）（四）不对称（四）不对称PCR（asymmetric PCR）（五）复合（五）复合PCR（Multiplex PCR）（六）随机引物（六）随机引物PCR ( arbitrary primer PCR)常用分子生物学技术的原理及应用常用分子生物学技术的原理及应用RT-PCR技术技术AAnATTnT 55mRNA反转录酶mRNAcDNA3TTnTAAnA核糖核酸酶HTTnT3DNA poly IcDNA

48、核酸酶S1双链cDNA35 35 5加热变性加入特异性引物DNA聚合酶PCR扩增出大量的产物实时实时PCR技术原理技术原理常用分子生物学技术的原理及应用常用分子生物学技术的原理及应用 反向PCR的目的在于扩增一段已知序列旁侧的DNA，也就是说这一反应体系不是在一对引物之间而是在引物外侧合成DNA。反向PCR可用于研究与已知DNA区段相连接的未知染色体序列。这时选择的引物虽然与核心DNA区两末端序列互补，但两引物3端是相互反向的。扩增前先用限制性内切酶酶切样品DNA，然后用DNA连接酶连接成一个环状DNA分子，通过反向PCR扩增引物的上游片段和下游片段。反向PCR（inverse PCR）常用分

49、子生物学技术的原理及应用常用分子生物学技术的原理及应用 是一种二条DNA模板不等扩增的PCR，通过调整一对引物浓度（如100：1），使扩增出的产物大部分为浓度高引物合成的单链DNA。有利于测序或制备探针。不对称PCR（asymmetric PCR）：常用分子生物学技术的原理及应用常用分子生物学技术的原理及应用 用多对引物同时扩增几条DNA片段的方法称为复合PCR。复合PCR（Multiplex PCR）：常用分子生物学技术的原理及应用常用分子生物学技术的原理及应用RAPD（Random Amplification of Polymorphic DNA）随机引物扩增多态DNA，或随机引物扩增PC

50、R（arbitrary primer PCR, AP-PCR）。 常规PCR 通常扩增一个已知DNA片段，所设计的引物也是根据相应序列的侧翼顺序。扩增产物为一个特异片段。 RAPD包含多个PCR反应和多个引物，引物是随意设计的10bp片段，其扩增的是一组未知的片段，在事先不知道DNA序列的情况下，产生DNA指纹模式，可进行亲缘关系分析、系统发育分子水平的鉴定。如果在二个基因组的RAPD反应用同一组引物，则可以比较基因组间的差异。利用这种差异有可能追踪性状的差异。常用分子生物学技术的原理及应用常用分子生物学技术的原理及应用四四 核核 酸酸 序序 列列 分分 析析Nucleic acid sequ

51、ence analysis常用分子生物学技术的原理及应用常用分子生物学技术的原理及应用核酸序列分析的基本原理核酸序列分析的基本原理化学裂解法化学裂解法 (Maxam-Gillbert法法)-略略DNA链的末端合成终止法链的末端合成终止法 (Sanger法法) (Sanger双脱氧链终止法双脱氧链终止法)HO P O P O P O CH2OOOOHOHOHOA, C, G or T13 OH5 双脱氧核苷三磷酸双脱氧核苷三磷酸脱去脱去二、二、DNA链末端合成终止法链末端合成终止法Sanger 1958年和年和1980年两次获年两次获Nobel奖奖常用分子生物学技术的原理及应用常用分子生物学技术

52、的原理及应用The Nobel Prize in Chemistry 1980for his fundamental studies of the biochemistry of nucleic acids, with particular regard to recombinant-DNA for their contributions concerning the determination of base sequences in nucleic acids Paul BergWalter GilbertFrederick Sanger1/2 of the prize1/4 of the

53、 prize1/4 of the prizeStanford University Stanford, CA, USAHarvard University, Biological Laboratories Cambridge, MA, USAMRC Laboratory of Molecular Biology Cambridge, United Kingdom 1926-1932-1918-常用分子生物学技术的原理及应用常用分子生物学技术的原理及应用三、三、DNA自动测序自动测序用用荧光替代放射性核素荧光替代放射性核素标记是实现标记是实现DNA序列分序列分析自动化的基础。析自动化的基础。用用

54、不同荧光不同荧光分子标记分子标记4种种ddNTP，然后进行，然后进行Sanger测序反应，产物经电泳（平板电泳或毛细管测序反应，产物经电泳（平板电泳或毛细管电泳）分离。电泳）分离。通过通过4种激光激发不同大小种激光激发不同大小DNA片段上的荧光片段上的荧光分子使之发射出分子使之发射出4种不同波长荧光，检测器采集荧种不同波长荧光，检测器采集荧光信号，并依此确定光信号，并依此确定DNA碱基的排列顺序。碱基的排列顺序。 常用分子生物学技术的原理及应用常用分子生物学技术的原理及应用ABI PRISM 310型型 DNA测序仪测序仪主要用于DNA序列分析 (包括DNA测序,卫星序列、杂合子序列和三联体序

55、列分析，单链构象多态分析,长片段PCR分析)，遗传疾病诊断，亲子鉴定等PE 3700型型DNA测序仪测序仪DNA自动测序结果举例自动测序结果举例常用分子生物学技术的原理及应用常用分子生物学技术的原理及应用五、生物大分子相互五、生物大分子相互作用研究技术作用研究技术 The Method of Protein-protein and Protein-DNA Interaction Study常用分子生物学技术的原理及应用常用分子生物学技术的原理及应用一、蛋白质相互作用研究技术一、蛋白质相互作用研究技术 酵母双杂交酵母双杂交 各种亲和分析（标签蛋白沉淀、免疫共沉淀等）各种亲和分析（标签蛋白沉淀、免

56、疫共沉淀等） 荧光共振能量转换效应分析荧光共振能量转换效应分析 噬菌体显示系统筛选噬菌体显示系统筛选n常用蛋白质相互作用的研究技术常用蛋白质相互作用的研究技术常用分子生物学技术的原理及应用常用分子生物学技术的原理及应用标签融合蛋白结合实验是一个基于亲和色谱标签融合蛋白结合实验是一个基于亲和色谱原理的、分析蛋白质体外直接相互作用的方法。原理的、分析蛋白质体外直接相互作用的方法。（一）标签蛋白沉淀（一）标签蛋白沉淀标签融合蛋白结合实验主要用于证明两种蛋标签融合蛋白结合实验主要用于证明两种蛋白分子是否存在直接物理结合、分析两种分子结白分子是否存在直接物理结合、分析两种分子结合的具体结构部位及筛选细胞

57、内与融合蛋白相结合的具体结构部位及筛选细胞内与融合蛋白相结合的未知分子。合的未知分子。 常用分子生物学技术的原理及应用常用分子生物学技术的原理及应用标签融合标签融合蛋白沉淀蛋白沉淀实验流程实验流程示意图示意图常用分子生物学技术的原理及应用常用分子生物学技术的原理及应用（二）酵母双杂交技术的基本原理（二）酵母双杂交技术的基本原理和用途和用途常用分子生物学技术的原理及应用常用分子生物学技术的原理及应用n酵母双杂交系统的应用酵母双杂交系统的应用 证明两种已知基因序列的蛋白质可以相互作用证明两种已知基因序列的蛋白质可以相互作用的生物信息学推测。的生物信息学推测。 分析已知存在相互作用的两种蛋白质分子的

58、的分析已知存在相互作用的两种蛋白质分子的的相互作用功能结构域或关键的氨基酸残基。相互作用功能结构域或关键的氨基酸残基。 将拟研究的蛋白质的编码基因与将拟研究的蛋白质的编码基因与BD基因融合成基因融合成为为“诱饵诱饵”表达质粒，可以筛选表达质粒，可以筛选AD基因融合的基因融合的“猎物猎物”基因表达文库，筛选未知的相互作用基因表达文库，筛选未知的相互作用蛋白质。蛋白质。常用分子生物学技术的原理及应用常用分子生物学技术的原理及应用电泳迁移率变动测定电泳迁移率变动测定( (electrophoretic mobility shift assay，EMSA)或称凝胶迁移变动实验或称凝胶迁移变动实验( (

59、gel shift assay)最初用于研究最初用于研究DNA结合蛋白与相应结合蛋白与相应DNA序列间的相互作用，可用于定性和定量分析，序列间的相互作用，可用于定性和定量分析，已经成为转录因子研究的经典方法。目前这一技已经成为转录因子研究的经典方法。目前这一技术也被用于研究术也被用于研究RNA结合蛋白和特定结合蛋白和特定RNA序列间序列间的相互作用。的相互作用。二、二、DNA-蛋白质相互作用分子分析技术蛋白质相互作用分子分析技术（一）电泳迁移率变动测定（一）电泳迁移率变动测定常用分子生物学技术的原理及应用常用分子生物学技术的原理及应用放放射射自自显显影影未结合探针未结合探针结合有蛋白的探针结合

60、有蛋白的探针标记探针标记探针1X1X1X1X核蛋白提取物核蛋白提取物1X10X10X未标记探针未标记探针10Xn凝胶迁移实验结果示意图凝胶迁移实验结果示意图常用分子生物学技术的原理及应用常用分子生物学技术的原理及应用n凝胶迁移实验结果图凝胶迁移实验结果图常用分子生物学技术的原理及应用常用分子生物学技术的原理及应用染色质免疫沉淀技术染色质免疫沉淀技术(chromatin immunoprecipitation assay, ChIP)是目前可是目前可以研究体内以研究体内DNA与蛋白质相互作用的与蛋白质相互作用的主要方法。主要方法。（二）染色质免疫沉淀法（二）染色质免疫沉淀法常用分子生物学技术的原

61、理及应用常用分子生物学技术的原理及应用n染色质免疫沉淀实验流程及结果示意图染色质免疫沉淀实验流程及结果示意图常用分子生物学技术的原理及应用常用分子生物学技术的原理及应用六、遗传修饰动物模六、遗传修饰动物模型的建立及应用型的建立及应用The establishment and application of heredity-modified animal model 常用分子生物学技术的原理及应用常用分子生物学技术的原理及应用转基因技术转基因技术 采用基因转移技术使目的基因整合入采用基因转移技术使目的基因整合入受精卵细胞或胚胎干细胞，然后将细胞导受精卵细胞或胚胎干细胞，然后将细胞导入动物子宫，使

62、之发育成个体。入动物子宫，使之发育成个体。 转基因转基因被导入的目的基因被导入的目的基因转基因动物转基因动物( (transgenic animal)目的基因的受体动物目的基因的受体动物一、转基因技术一、转基因技术常用分子生物学技术的原理及应用常用分子生物学技术的原理及应用核转移技术核转移技术 即即动物整体克隆技术动物整体克隆技术，将动物，将动物体细胞核全部导入另一个体的去体细胞核全部导入另一个体的去胞核的卵细胞内，使之发育成个胞核的卵细胞内，使之发育成个体，即克隆体，即克隆( (clone)。 二、核转移技术二、核转移技术常用分子生物学技术的原理及应用常用分子生物学技术的原理及应用有目的去除

63、动物体内某种基因的技术有目的去除动物体内某种基因的技术, 称为称为基因剔除基因剔除（gene knock-out）或）或基因基因靶向灭活靶向灭活(gene targeting)。三、基因剔除技术三、基因剔除技术常用分子生物学技术的原理及应用常用分子生物学技术的原理及应用四、基因转移和基因剔除技术在医四、基因转移和基因剔除技术在医学中的应用学中的应用建立动物模型建立动物模型 单基因决定疾病模型单基因决定疾病模型 基因剔除基因剔除获得性突变获得性突变(gain-of-function mutation) 多基因决定疾病模型多基因决定疾病模型常用分子生物学技术的原理及应用常用分子生物学技术的原理及应用思思 考考 题题 1试述分子杂交与印迹技术的原理。试述分子杂交与印迹技术的原理。 2试述试述PCR技术的基本原理及其应用。技术的基本原理及其应用。 3试述酵母双杂交技术的基本原理。试述酵母双杂交技术的基本原理。 4. 简述基因芯片的原理简述基因芯片的原理.