丹参在全胃肠外营养致肝损害中的作用及蛋白质组学研究

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1、丹参在全胃肠外营养致肝损害中的作用及蛋白质组学研究 南方医科大学硕士学位论文丹参在全胃肠外营养致肝损害中的作用及蛋白质组学研究姓名:胡涛申请学位级别:硕士专业:中西医结合临床指导教师:吕志平;孙学刚20210603硕士学位论文丹参在全胃肠外营养致肝损害中的作用及蛋白质组学研究硕士研究生:胡涛指导老师: 吕志平教授摘要.研究背景临床上许多危重患者由于不能从胃肠道摄取充足的营养而导致营养不良,从而影响对疾病的治疗,而全胃肠外营养 ,作为现代医学的一项新成就,集治疗、营养、药理、药剂、代谢调理和内分泌学为一体,应用于危重患者和无口服功能者,对外科和内科等多种疾病给予营养支持,使这些疾病的治疗取得了进

2、展。但随着临床应用范围的扩大,并发症也日益增多,尤其是长期应用者更容易发生。肝损害就是应用常见的并发症之一?。国外报道乜长期引起的肝功能损害发生率高达%。病理生理上,肝损害在成人主要表现为脂肪变性,而在新生儿主要表现为胆汁淤积瞳。国内钔也提到了全胃肠外营养致肝损伤包括:肝功能异常、肝脂肪变性、胆汁淤积、慢性肝病等个主要的方面。期间,胆汁流动下降已为多项研究畸所证实。对于其发病机制,目前研究说法不一,但并非单一因素所致。有研究认为与禁食时间、营养成分及其比例等因素有关,如禁食导致肠液、胆汁、胰液分泌异常,缩胆素分泌减少,营养成分的高糖和高蛋白对肝脏不利等。另有研究说明阳氧化损伤及肝细胞调亡均与肝

3、损害有关。近几年来国外学者对陋儿们等从肝细胞分裂周期及肝脏此项研究又做了更深一步的探讨,如一糖蛋白的变化等方面来研究致肝损害。纵观国内外研究资料,尚无从相关蛋白质组学方面进行研究的。如何更好地发现并防止对机体的损害,到中文摘要目前为止,还有待于进一步的动物实验及临床研究。丹参作为临床常用的药物之一,含有多种药理活性成分,具有广泛而复杂的药理作用,在治疗肝脏疾病方面具有很大潜力。大量临床和药理学实验说明,丹参对肝脏具有抗肝纤维化,提高供体肝脏的保存效果,消除肝细胞氧自由基,减轻肝脏冷热缺血再灌注后的损害,减轻肝细胞脂肪变性和坏死,促进残肝再生,防治肝癌转移复发以及影响肝硬化门静脉高压血流动力学等

4、作用引。动物实验研究证实,丹参通过抗氧化和调控凋亡相关基因的表达而到达对抗所致肝损害的作用。丹参用于临床致肝损伤的防治具有重要的意义,其作用机制仍有待深入研究。蛋白质组学作为后基因时代的产物,在生命科学研究中越来越表达出其重要性和优越性。疾病的外在表现以其相应的内在物质改变为根底,而这种物质的执行者就是蛋白质。一个或者多个蛋白质,或是结构的变化,或表达量的改变,才导致疾病的发生、开展和转归。通过蛋白质组的研究,比拟不同状态的蛋白质表达图谱,从蛋白质量和结构变化两方面来观察其功能变化,从而了解机体内部复杂的生理、病理过程。现在蛋白质组学研究已经广泛运用于疾病的早期诊断、治疗;寻找疾病的特异蛋白质

5、标记物;探讨某些重大疾病的产生过程和机制等。总之,蛋白质组学研究是直接从蛋白质着手来探讨疾病发生过程中蛋白质种类及数量的变化,而蛋白质是广泛参与细胞的功能与调节并决定细胞、组织和器官的根本单位。这与丹参对肝脏作用的多靶点性是密切相联的。因此,它为肝脏疾病分子机制的研究提供了一个可行的方法,有利于说明疾病的发病机理并提供新的治疗靶点。.研究目的随着在临床上的广泛应用,在发挥它积极作用的同时,它的副作用也引起了人们的关注。在临床上导致的肝损伤主要包括:肝功能异常、肝脂肪变性、胆汁淤积、慢性肝病等个主要的方面。本研究以临床需要的急性胰腺炎患者为研究对象,研究丹参在致肝损伤中的作用,同时运用蛋白质组学

6、方法,期待能从机体功能执行者?蛋白质的角度,通过比照给予、丹硕士学位论文参治疗后血清中蛋白质,综合有表达差异的蛋白质,寻找与丹参防治致肝损害相关的蛋白质组群,并对其中某些蛋白质进行功能研究,从蛋白质组的角度探讨中药丹参发挥保护作用的机理所在。为更好的防治副作用的发生以及发挥中医中药在临床中的重要作用打下良好的理论根底。.研究方法本研究以临床需要的急性胰腺炎患者为研究对象,建立纳入标准,筛选出进行实验研究的临床病例。筛选出的例患者,随机分为对照组和治疗组各例。在常规治疗根底上,对照组给予静脉置管全胃肠外营养,治疗组在全胃肠外营养的根底上给予注射用丹参粉针哈药集团中药二厂批准文号:参加%中静脉滴注

7、,次/日。均在或丹参后采取全血。观测临床肝功、指标,研究丹参在致肝损害中的作用。收集的全血经低温别离,别离后的血清用? 蛋白定量试剂盒进行蛋白定量。定量后采用双向电泳技术别离血清蛋白,一向采用一、胶条进行水平的等电聚焦,二向进行垂直电泳。电泳结束后用采用胶体银染技术,利用 投射扫描仪采集图像。采用二维图谱分析软件.进行图像分析,软件自动给出差异表达蛋白质点的数据信息。切取局部差异明显的蛋白点送香港大学基因研究中心进行鉴定,获得肽质量指纹图谱,采用软件在数据库中进行检索,鉴定差异蛋白。考虑到临床影响因素较多,故最后加以动物实验研究对肝脏的损害作用及丹参在其中的作用。动物实验中只雄性大鼠随机分为组

8、,每组只,分别为正常组、组、丹参组。正常组自由进食饮水;组给予全胃肠外营养,禁食禁水;丹参组在根底上给予丹参注射液治疗./。三组均进行实验。实验结束时采血标本,用自动生化分析仪测肝功能。.结果中文摘要.通过对临床病例的筛选,选出了例符合入选标准的病例。.短期的治疗也会导致轻度的肝损伤,以和升高为主,而给予丹参那么会减轻肝损伤。.获得了较为满意的血清蛋白质组一凝胶电泳图像。及丹参均能干预肝损害血清蛋白质表达谱。.局部差异蛋白点的鉴定。对所获得的局部差异蛋白点进行质谱分析,分析后获得肽质量指纹图谱,再经搜索数据库成功鉴定出其中个蛋白质,它们分别为血清白蛋白前体 、接联球蛋白 、免疫球蛋白链区补体。

9、一前体 和血清铁传递蛋白前体。.动物实验说明,全胃肠外营养可对肝功造成一定的损害,而丹参对这种损害有一定的保护作用,与正常对照组比拟,组、均有显著性差异.。与组比拟,丹参组、?、有显著性差异.,而、无显著性差异。.结论本研究首次运用蛋白质组学的方法,对丹参在全胃肠外营养致肝损害中的作用进行研究。通过建立纳入标准,筛选出进行实验研究的临床病例,观测临床肝功指标,研究丹参对致肝损害的作用。采用一联合质谱鉴定技术,对别离后的血清进行分析,别离并鉴定出差异表达的蛋白质。这些蛋白质功能主要涉及营养物质代谢、免疫等方面,说明全胃肠外营养导致的肝损害和其组成成分的作用是有很大关联的。通过本次研究发现:、短期

10、的治疗也会导致轻度的肝损伤,以和升高为主,而给予丹参那么会减轻肝损伤。、及丹参均能干预肝损害血清蛋白质表达谱。丹参可能通过下调血清铁传递蛋白前体和上调免疫球蛋白链区和补体。一前体来参与防治硕士学位论文对肝脏的损害。、动物实验说明确实能导致肝功损害,而丹参对此损害有一定的保护作用。通过对肝损害蛋白质组差异表达的研究,从理论、动物实验的角度为其实质的深入研究提供了借鉴。关键词全胃肠外营养肝损害血清蛋白质组学二维凝胶电泳丹参硕士学位论文 一 一上上上: :. , ., , . ., , , , ? . . ? %., .?, , , .引., , ., ., ,., ?. , , , ?.,., ,

11、 ,. , ,硕士学位论文 ,? , , , .们,?, . ? .? . ., ? , . . , ,.,.: ? .,?,. ,?。 ,., ?, , ., .,.,. . , , ,%. ,., ,硕士学位论文? . ,? 一,? . ,? ?. . . . , , ,. .,., . ., .一. . .,: 、 、一、 . , . , ?.一, ?,.、 . :. ,. .硕士学位论文?, , .?: ; :?:硕士学位论文南方医科大学学位论文原创性声明本人郑重声明:所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外,本论文不包含任何其他个

12、人或集体己经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要奉献的个人和集体,均已在文中以明确方式标明。除与外单位合作工程将予以明确方式规定外,本研究已发表与未发表成果的知识产权均归属南方医科大学。本人承诺承当本声明的法律效果。日作者签名: 日期: 年 月学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保存、使用学位论文的规定,同意学校保存并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版,允许论文被查阅和借阅。本人授权南方医科大学可以将本学位论文的全部或局部内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本学位论文属于请在以下相应方框内打“:、保密口,在一年解密

13、后适用本授权书。、不保密口。作者签名: 日期: 日年 月导师签名: 日期: 年 月 日硕士学位论文?.日 吾全胃肠外营养是指营养要素完全由胃肠外途径直接输入到血液中,起到营养支持作用,在临床上应用广泛。营养物质主要是由氨基酸、糖、脂肪、维生素、 微量元素等组成。全胃肠外营养在临床应用已有余年,它集治疗、营养、药理、药剂、代谢调理、病理生理和内分泌学为一体,广泛应用于危重病人或者口服无功能的患者,如短肠综合征、急性胰腺炎、肾衰、晚期肿瘤和器官移植等疾病,明显改善了危重患者的营养状况和预后。但在长期的根底理论研究和应用上也发现了许多并发症问题,如置管、感染、代谢和对肝脏的损害,但随着技术的不断提高

14、,前三个并发症的发生率已明显下降,但相关肝损伤却仍是目前临床难题,国内外报道均说明长期会导致肝功损害,主要包括:肝功能异常、肝脂肪变性、胆汁淤积、慢性肝病等方面。既往实验说明致肝功损害并非单一因素,而是有多方面原因,如的组成、禁食时间长短、氧化损伤及诱导肝细胞调亡等。但对于其确切机制,尚未有统一研究结果。如何更好地发现并防治肝损害具有很大的理论和临床意义。随着人类基因组方案的完成,生命科学的研究随即进入后基因组时代。基因不是生物功能的执行体,并且基因转录和翻译有太多的复杂性,单纯从基因水平还不能对一些生理和病理现象做出全面合理的解释,因而研究生命体的蛋白质的情况更能直接反响生理和病理变化规律,

15、蛋白质组学开始成为生命科学的重点研究领域。蛋白质是机体生命表达和功能的执行者,蛋白质组学是研究基因所表达的全部蛋白质,包括表达水平、翻译后修饰、相互作用等,并由此在蛋白质水平上获得对疾病过程、细胞生理生化过程和调控网络的广泛而完整认识的方法学。它的最大特点是同时系统地分析大量的蛋白质,这恰恰是中医药研究最急需解决的问题。肝脏疾病的发生和开展涉及动态、复杂及精细的细胞内过程。蛋白质作为细胞的根本功能单位,广泛参与细胞的功能与调节并决定细胞、组织和器官的表型。蛋白质组学研究直接从蛋白质着手来探讨疾病发生过程中蛋白质种类及前言数量的变化,因此,它为肝脏疾病分子机制的研究提供了一个可行的方法,有利于说

16、明疾病的发病机理并提供新的治疗靶点。目前虽然已经开展了大量对于致肝损害的研究,并取得了一定的结果,但尚缺乏相关蛋白组的实验和临床研究,相关的肝脏损害防治仍是临床难题。丹参具有祛瘀止痛、活血通经、清心除烦之功。丹参还具有抗氧化作用,通过去除细胞内自由基而保护肝细胞引,还可能从调控调亡相关基因等多方面干预肝细胞的调亡。丹参作为临床防治肝损伤的经验用药,颇有疗效。本工程旨在运用蛋白质组学方法和技术,从致肝脏损伤的诸多生理病理机制的执行者一蛋白质入手,通过比照给予、丹参注射液治疗后血清中蛋白质,综合有表达差异的蛋白质,寻找与丹参防治致肝损害相关的蛋白质组群,并对其中某些蛋白质进行功能研究,从蛋白质组的

17、角度探讨中药丹参发挥保护作用的机理所在。为更好的防治副作用的发生以及发挥中医中药在临床中的重要作用打下良好的理论根底。对于加强和深化中医药的现代化研究具有重要意义。硕士学位论文实验一 临床研究研究对象与方法.纳入标准急性胰腺炎患者,均符合年“中国急性胰腺炎诊治指南草案中的轻型急性胰腺炎诊断标准 ,且需要治疗者。入院后测肝功能正常且肝胆超声无异常者。排除各种肝胆系疾病胆囊炎、胆结石等以及需要用具有明显肝损伤性药物的病例,排除胆源性胰腺炎需急诊内镜介入或手术治疗者;排除慢性胰腺炎急性加重者或急性重症胰腺炎患者:治疗持续至患者能进行肠内营养,在此期间,肝功血清谷丙转氨酶、门冬氨酸转氨酶、总胆红素、直

18、接胆红素、碱性磷酸酶变化者。.一般资料收集年期间住院病例共例,均符合年“中国急性胰腺炎诊治指南草案的诊断标准。对于病例全部按随机原那么分为对照组和治疗组,每组例。对照组中男例,女例;平均年龄岁,最小岁,最大岁。治疗组中男例,女例,平均年龄岁,最小岁,最大岁。两组病例在年龄、发病时间以及疾病构成方面比照,无统计学意义.,具有可比性。.治疗方法所有入选病例在入院后均予禁食、胃肠减压,以生长抑素奥曲肽、抑酸剂奥美拉唑以及抗生素治疗,并予相应的对症处理,如吸氧、止痛。入院后/、时开始经由外周静脉置管予治疗。由糖、氨基酸和脂肪乳按./?提供热量,其比例为:,氮供应量为. /?,在此根底上,辅以电解质、维

19、生素、微量元素等。血脂升高者不用脂肪乳。其实验一临床研究中治疗组在入院时后开始以注射用丹参粉针哈药集团中药二厂批准文号:参加%中静脉滴注,次/日。观察主要病症与体征包括腹痛、腹胀、大便、肛门排气情况以及肠鸣音恢复的时间。治疗持续至患者能进行肠内营养。.主要组成成分的作用葡萄糖为碳水化合物,提供能量和生物合成所需的原子,是主要热能的来源。每克葡萄糖代谢可产生热量.。静脉用脂肪乳系由注射用大豆油经注射用卵磷脂乳化并加注射用甘油制成的灭菌乳状液体,一般浓度%一%。它除提供能量和生物合成的原子外,还提供必需脂肪酸。每克可提供热量.,还可帮助脂溶性维生素的吸收,辅助治疗动脉粥样硬化、脂肪肝,防止长期输入

20、电解质、氨基酸所引起的皮炎、湿疹、生长不良等症。与氨基酸联用可提高后者在体内的利用率,节约机体蛋白质的消耗,纠正负氨平衡,对防止体重下降有显著作用。氨基酸是构成蛋白质的根本单元,也是合成机体内抗体、激素、酶类和其它组织的原料,在体内有特殊的生理功能,是维持生命的根本物质。人体所需氨基酸按生理功能分为必需氨基酸、半必需氨基酸、非必需氨基酸三类。供给氨基酸的同时还必须供应足够的非蛋白热卡即葡萄糖、脂肪乳以防止输入的氨基酸代谢供应热量,造成浪费。.观测指标治疗期间对肝功、进行监测。.数据分析。方差齐性实验结果计量资料用工表示,组间比拟用时,采用方法进行组间多重比拟;方差不齐时,采用方法进行组间多重比

21、拟。用统计软件.进行分析,以.定为差异有统计学意义。二结果硕士学位论文在所观察病例治疗、,最长为天,最短为天即出现肝功能损害期间内,两组病例治疗后根底疾病逐渐好转,对照组共发现例伴有肝损伤,其中例伴中度升高;治疗组例伴有轻度肝损;两组病例都伴有的升高,其中对照组例,治疗组例,在的升高值比拟上两组无明显差异。两组病例中均有病例伴直接胆红素轻度升高,其中对照组例,治疗组例,两者比拟没有明显的差异。两组均未发现严重的肝损伤病患。具体见表卜:表卜各实验组肝功能比拟:.术木两组比拟.总体而言,短期的治疗也会导致轻度的肝损伤,以和升高为主,予丹参的治疗组伴肝损伤的病例少且升高的程度明显较对照组轻。三讨论急

22、性胰腺炎是临床上一种常见疾病,发病后表现为上腹疼痛,伴有不同程度的腹膜炎体征,常有呕吐、腹胀、发热、心率加快、血白细胞计数上升、血或尿淀粉酶升高。体内分解代谢增加,合成代谢减弱,同时产生胰岛素拮抗,糖耐量明显下降,机体呈负氮平衡,腹腔内大量渗液,出现麻痹性肠梗阻。即使能接受肠内营养的病人,也因其脑及胃相应刺激,诱发胰腺分泌,加重病情。治疗胰腺炎的所有方法均是围绕着抑制胰腺酶的分泌和并发症的防治。首先需要禁食,但长期禁食必然会导致负氮平衡,降低机体的抗病能力,并且发病过程中,机体溶解消除坏死组织,杀死细菌,胶原合成与伤口修复均需不同物质实验一临床研究参与,特别是作为呼吸燃料的葡萄糖及谷胺酰氨,以

23、及用于蛋白质合成的氨基酸,这些能源的供应只有靠,否那么就会消耗肌蛋白。为此,需要进行治。疗。文献也证实,全胃肠外营养支持治疗可到达对胰腺最小的刺激由于胰腺和肝脏在解剖位置、生理功能和血流动力学方面存在着密切联系,极易成为急性胰腺炎全身病理损伤较早的脏器之一。肝脏作为机体代谢中心,其特殊和复杂的生理功能使之成为对急性胰腺炎病情进展影响最大的脏器。急性胰腺炎产生的炎性介质可以被肝脏降解灭活,同时也可以导致肝脏的损害。急性胰腺炎引起的肝脏损伤机理复杂,近年研究发现可能与胰酶激活、炎症介。质的活化、胰腺血液紊乱、细胞凋亡等因素密切相关可致肝功损害已成为共识,但对于其机制却仍无明确的认识,参考既往实验研

24、究,大致有以下几种观点:禁食:长期禁食是相关胆汁淤积的最主要原因 。禁食期间,胃肠液、胆汁、胰液分泌异常;胆汁酸的肠肝循环障碍;胆囊收缩素分泌减少;营养成分的高糖和高蛋白质;肠道细菌及其毒素均可对肝脏产生损伤作用。中的营养成分过量或配伍不当:长期大量的氨基酸输入,可作用于肝细胞,影响胆汁分泌,直接造成胆汁淤积。过量脂肪乳可引起胆汁中胆固醇结晶,从而增加胆汁浓度而致胆汁淤积。过分依赖葡萄糖作为热量来源,导致过剩的糖类在肝脏内转化为甘油三酯。营养液配伍不当营养液中糖类和氮比例失衡,使脂蛋白合成下降,肝脏内甘油三酯输出减少而大量在肝内堆积,从而导致肝脏脂肪变性。肠道细菌移位:长期采用期间,胃肠道的解

25、剖结构和功能那么发生改变。胃肠黏膜萎缩变薄,其屏障功能减弱,免疫功能降低,导致胃肠道内细菌过度繁殖移位,肠壁对内毒素吸收增加。内毒素作用于肝细胞,从而损害了肝功能。以上观点认为和均会对肝脏功能产生损害,但两者还是有区别的。既往临床资料调查认为,重型急性胰腺炎 ,硕士学位论文较轻型急性胰腺炎 ,肝损伤发生率高。急性胰腺炎肝损伤的程度与病情严重性呈正相关刨。对肝脏产生损害可在极短内时间发生,动物实验研究们说明, 模型术后,大鼠肝功在内呈持续上升状态。而对肝脏产生损害周期较长,有实验报告,胆汁淤积最快出现于应用后第天。而脂肪变性一般在使用周内发生。有研究乜町对例应用的患者进行比照观察,使用时间最长的

26、达,最短。其中例未采取任何保肝及预防肝损害措施,结果有例发生肝功能异常。本研究中为防止对肝脏的损害,所筛选的病例均为轻型急性胰腺炎,所制定的纳入标准以肝功正常并排除其他影响肝脏功能的疾病为主要标准,定期监测肝功指标,在进行肠内营养前有肝功异常变化者即可纳入研究对象。这在很大程度上排除了对肝功造成的损害。考虑到了临床肝穿的不可操作性,故以患者血清为蛋白质组学研究对象。在用药方面,考虑到治疗的必需性,在临床上尽量选用对肝脏损害小的抗生素及其他药物。通过本研究中的临床肝功指标观察,发现短期的治疗也会导致轻度的肝损伤,以和升高为主,予丹参的治疗组伴肝损伤的病例少且升高的程度明显较对照组轻。说明丹参是可

27、以减轻致肝功损害的,丹参含有丹参酮、丹参素等多种物质,具有活血化淤,降低血液粘度,促进和改善微循环等作用。并可作为受体操纵性钙阻滞剂在肝缺血再灌注损伤中发挥良好的肝保护作用乜。动物实验己显示丹参能抑制血清和肝组织的过量释放从而减轻肝损伤和抑制全身炎症反响,对实验性急性胰腺炎的肝损害有保护作用乜羽。可以应用于临床防治肝损害,特别是需要治疗的患者。实验一血清蛋白质组别离图像的制备和分析实验一血清蛋白质组别离图像的制备和分析一实验材料与方法.实验样本实验所用血清均来自符合纳入标准的临床患者。.仪器与试剂.主要仪器美国公司及其配件及其配件美国公司低温循环水浴箱 公司?图像扫描仪 美国公司低温高速离心机

28、美国公司超纯水纯化系统 美国公司型脱色摇床、漩涡振荡器 国产超低温冰箱 美国公司.主要试剂,? 美国通用公司? ?美国公司美国公司美国公司美国公司美国公司美国公司美国公司美国公司硕士学位论文美国公司, 美国公司矿物油、甘油、尿素 美国公司美国公司硫代硫酸钠、无水碳酸钠、甲醛、硝酸银、乙醇、冰醋酸、醋酸钠、甘氨酸均为国产分析纯。所有缓冲液均用儿?水配制。.分析软件.图谱分析软件,美国?公司。.方法.主要溶液配制,水化液:. ,. 溴酚蓝储,.液, ,. ,超纯水定容至,每分装,贮存于,和临用时参加。别离胶溶液:. ?,双蒸水,浓调至.,加超纯水定容至,用.微米的滤器过滤,保存。平衡液母液:. ,

29、别离胶溶液,. ,溴酚蓝储液,超纯水定容至,每分装,贮存于一。单体贮存液:丙稀酰胺,甲叉双丙烯酰胺,加超纯水定容至,.微米的滤纸过滤,避光保存。%.,加超纯水定容至,.微米的滤纸过滤,室温保存。%.过硫酸铵,参加超纯水,临用时配制。电泳缓冲液:. ,. ,加超纯水定容至,室温保存。琼脂糖封顶液:电泳缓冲液,.低熔点琼脂糖,溴酚实验一血清蛋白质组别离图像的制备和分析蓝储液,将所有的药品参加一烧瓶中,在微波炉中加热至琼脂糖完全溶解,注意不要让溶液暴沸,室温保存。溴酚蓝储液:.溴酚蓝,. ?,加超纯水定容至,室温保存。凝胶贮存液: 别离胶溶液,%,加超纯水定容至,保存。.血清蛋白质样品的制备将获取的

30、全血立即置冰箱,分钟后以的速度室温离心分钟;吸取上清液,置高速低温离心机,在条件下,以的速度离心分钟;再吸取上清液,分装置一冰箱保存备用,防止反复冻融。.蛋白质定量蛋白定量试剂盒定量,按照说明书依次操作。最后在采用工作表中,以吸光度为横坐标,反响蛋白量为纵坐标,求出直线回归方程。如图?。将样品测定结果的平均值用回归出的直线方程计算待测样品的反响蛋白量。图?蛋白定量标准曲线硕士学位论文.样品预处理采取同组内样品混合上样的方法。将定量后的同组内每个样品等量混合,共得到两组混合样本,即组、组。各混合样品均稀释倍,此为最终进行电泳的上样样品,。冰箱保存。.双向凝胶电泳泡涨胶条参照等电聚焦系统程序指南和

31、使用说明书进行操作。将蛋白样品与适量水化液混匀,至总体积为,参加泡涨盘中,取出干胶条,室温平衡,用镊子剥离保护膜,胶面朝下放入槽中,注意胶条下不可有气泡,假设有少量气泡,可以用镊子轻轻赶出,盖上盖子,调节水平。后,用矿物油覆盖胶条,防止样品及水化液挥发。室温泡涨。第一向固相梯度等电聚焦泡胀完毕,用镊子将胶条取出,用滤纸吸干覆盖油,转入聚焦盘中,胶面朝上,胶条的正负极与聚焦仪电极板正负极保持一致,在胶条两端放置湿润电极片,将电极压在电极片上,胶条槽内参加足量的覆盖油,盖上盖子。设定等电聚焦参数见表,在下自动进行等电聚焦。表等电聚焦参数设置? ?实验一血清蛋白质组别离图像的制备和分析胶条的平衡等电

32、聚焦结束后,取出胶条,用滤纸吸去胶条上的覆盖油,用超纯水参加平衡液母液中平衡液,将碘乙冲洗胶条。将酰胺参加平衡液母液中平衡液,溶解后分别倒入平衡管中备用。将胶条放入平衡液中,胶面朝上,盖上盖子,在脱色摇床上摇,然后将胶条取出放入平衡液中,继续摇。将胶条取出用超纯水润洗几秒钟,转移至第二向?电泳。第二向电泳配制.%聚丙烯酰胺凝胶:将洗净并晾干的玻璃板在制胶模具上装好。凝胶溶液配制如下:.单体贮存液, 别离胶溶液,.超纯水,%,. %,。各种溶液按顺序参加烧杯中并轻轻混匀,缓慢将凝胶溶液倒入制胶模具中,液面至距离短玻璃板顶端.处停止,随后在液面上铺水饱和的正丁醇,以减少凝胶与空气接触并保持胶面平齐

33、。室温至少聚合,聚合后倒掉覆盖在凝胶上的正丁醇溶液,并用凝胶储存液冲洗凝胶外表。转移胶条:将平衡的胶条浸入电泳缓冲液中润洗几秒钟,放胶条于两玻璃板之间,使胶条支持膜贴在长玻璃板上,用薄尺将胶条轻轻向下推,使胶条下部边缘与凝胶外表完全接触,防止气泡产生。用琼脂糖封顶液封顶,使胶条完全被覆盖,注意不要有气泡产生,待琼脂糖凝固后再进行其它操作。?电泳:将下槽电泳缓冲液倒入电泳槽中,翻开温控系统,调节温度为。将填充板和板胶插入电泳槽,上槽倒入上槽电泳缓冲液,加盖并接正负电极。翻开电源,设置电泳条件为:第一步,/,:第二步,/,。当溴酚蓝迁移至凝胶底部边缘即可结束电泳。电泳结束后,取出板胶,轻轻撬开玻璃

34、板,将凝胶剥离并切角做标记。凝胶染色电泳结束后,轻轻撬开两层玻璃,取出凝胶,并切角以作记号,采用新型胶体银染法,步骤如下:固定 乙酸, 甲醇, 水硕士学位论文次;敏化 甲醇,. :。,醋酸钠加水至 ;水 ;漂漂洗 次;银染. 。加水至洗 ,甲醛,加水至次;显色.约 ;终止. 乙酸,加水至 ;漂洗水 次。图像扫描与分析银染后的双向电泳凝胶,采用 图像扫描仪进行扫描,采用二维图谱分析软件 .进行图像分析,包括背景削减,去除条纹、斑点检测,匹配等分析。软件自动匹配与人工匹配相结合,设定表达量相差倍以上为差异表达范围,软件自动进行分析,给出差异表达蛋白质点的数据信息。.质谱鉴定切取差异明显的蛋白点送香

35、港大学基因研究中心进行鉴定,胶内酶切,/质谱分析,获得肽质量指纹图谱,采用软件在数据库中进行检索,鉴定蛋白。二结果.蛋白浓度定量结果根据标准蛋白浓度及其相应的吸光度值,求出线性方程如上图所示。根据所测得的稀释后样品的吸光值,计算相应蛋白样品的浓度,乘以样品的稀释倍数即得到样品的实际蛋白浓度。.图谱在相同条件下对组样品分别进行别离,银染后图像扫描如图?,可见蛋白别离清楚,蛋白分布均匀。总蛋白质的分布模式非常相似。实验一血清蛋白质蛆别离图像的制备和分析.,一哆组,、,心“图 血清双向凝胶电泳图谱硕士学位论文.差异蛋白质分析鉴定对所获得的局部差异蛋白点进行质谱分析,获得张肽质量指纹图谱,这些肽质量指

36、纹图谱经搜索数据库成功鉴定出其中个蛋白质,该个蛋白质的数据库序列号 、鉴定分值、理论分子量、理论等电点 、名称 。见表所示。表蛋白点检索结果.两组血清蛋白质组比拟情况表?两组血清蛋白质组比拟情况通过比照可发现及丹参均能干预肝损害血清蛋白质表达谱。相对于对照组,丹参可能通过下调血清铁传递蛋白前体和上调免疫球蛋白链区和补体前体来参与防治对肝脏的损害。实验一血清蛋白质组别离图像的制备和分析、,一三讨论一近年来迅速开展的蛋白质组学研究,能动态、整体、定量地考察疾病发生发展过程中全部蛋白质种类和数量的变化,对于探讨疾病机理、寻找疾病诊断的特异标志物和药物治疗的靶标来说,是一种有效的高通量的研究模式,可获

37、得一些传统手段无法得到的新蛋白标志物和新关键分子,极大地丰富了诊断标志物的选择及复杂致病机理的全面说明。目前,蛋白质组学技术己广泛应用于研究疾病发病机制,寻找疾病诊断和治疗的靶标以及揭示物理、化学或生物干扰因素的分子机制等领域乜引。本实验利用蛋白质组学技术研究全胃肠外营养对肝脏的损害及丹参的干预,寻找肝损害时丹参作用的靶标,进一步阐述肝损害中丹参的干预作用。我们利用技术对肝损害蛋白质进行别离分析,发现局部蛋白质的表达发生了质或量的变化,经丹参干预,局部变化的蛋白质近于恢复正常。我们成功鉴定出个蛋白质,它们分别是:血清白蛋白前体、免疫球蛋白链区、接联球蛋白一、补体前体 和血清铁传递蛋白前体 。本

38、次研究筛选出的个差异蛋白质,主要在肝脏中合成,功能主要涉及营养物质代谢和免疫等方面。白蛋白是血清中含量最丰富的蛋白质,占肝脏合成总蛋白质量的/,占血清蛋白总量的一半以上。白蛋白的主要功能是维持血液胶体渗透压,也是体内水、微量元素、脂肪和药物等代谢的根底等。而白蛋白前体是白蛋白合成的重要组成局部,半衰期短,仅为 ,在蛋白质和能量摄入的短期内即有明显变化,对营养支持治疗反映迅速。可作为临床营养不良的早期诊断和营养治疗的监测指标。接联球蛋白,又称为触珠蛋白、结合珠蛋白,其主要的功能是通过与游离血红蛋白结合形成?复合物,将运至肝中代谢,从而防止和铁从。肾脏丧失以及对肾脏的损伤。此外,作为一种急性期蛋白

39、,在参与宿硕士学位论文主抗感染、损伤组织的修复以及内环境稳定的过程中起着、重要作用,其血清含量在感染、创伤、炎症、肿瘤、心肌梗死等病理状态时显著升高。除以上功能外,还具有抗氧化活性、抑制前列腺素合成、抵抗细菌、促进血管生成及重要免疫作用心引。免疫学理论认为,免疫球蛋白是淋巴细胞的特异产物,分为、五大类型;各类的根本单位无为条肽链的对称结构,包括两条相同的重链和两条相同的轻链,轻链根据其化学结构和抗原性的差异分为和入两型,每类都可以有链或入链,两型轻链的功能无差异,一般同一属两型轻链的比例是稳定的,如人体轻链和入比例是:。区是分子的恒定区,它的功能主要包括激活补体,结合细胞外表的受体从而起到调理

40、作用、抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用和介导型超敏反响,以及穿过胎盘和黏膜的作用。它与补体。一前体主要涉及免疫局部。作为调节机体免区,在对照组相对于治疗组中的表达下调,意疫功能的重要局部之一的味着机体淋巴细胞介导的体液免疫功能是有所下降的,说明机体对外界的免疫应答逐步下降,此时反映的那么是“正气渐虚,在这种情况下容易受外邪的侵袭而发病。丹参可能通过下调血清铁传递蛋白前体和上调免疫球蛋白链区和补体。一前体来参与防治对肝脏的损害。引起的肝损害,成人以肝脂肪变性最为常见,儿童主要是婴儿以胆汁淤积为主乜,脂肪变性、胆汁淤积主要与营养物质代谢、免疫系统有关。这也说明从蛋白质组学角度研究致肝损害是可行的。铁

41、传递蛋白前体 ,。转铁蛋白相对分子量为?,是由肝脏合成的一种单链多糖蛋白,半衰期为天,是血浆中主要的含铁蛋白质,直接参与体内代谢,承当对铁的吸收、贮存和利用部位之间的转运。铁蛋白主要在肝脏内合成,同时又能促进肝细胞的再生。当肝脏发生病变时,肝细胞受损势必会影响铁的代谢。文献报道血清转铁蛋白含量降低程度与肝细胞坏死范围呈正相关。肝脏疾病越严重,血清转铁蛋白含量下降越明显,与血清铁和铁蛋白水平增加的趋势相反啪川。而转铁蛋白前体是转实验一血清蛋白质组别离图像的制备和分析铁蛋白合成的主要局部,半衰期较长,可作为肝细胞损害的指标。一些研究者啪根据实验结果也建议将血清前白蛋白、转铁蛋白、铜蓝蛋白、总胆汁酸

42、值均可以作为反映肝实质损害可靠的指标。蛋白质组学是后基因组时代的一门新学科,其目的是从整体的角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成成分,了解蛋白质之间的相互作用和相互联系,揭示蛋白质功能和生命活动规律。蛋白质组学的出现及其理论和技术的开展和完善为探寻疾病机理、寻找疾病诊断的特异标志物和药物治疗的靶标提供了全新的手段。从双向电泳到质谱鉴定的整个蛋白筛选、鉴定技术流程长,影响因素多,还需要对获得的差异蛋白进一步再验证。本研究由于时间的关系,对这些差异蛋白质的验证将在后续工作中进行。硕士学位论文实验二丹参在全胃肠外营养大鼠肝损害中的作用材料与方法.实验动物只级雄性大鼠,体重为,由南方医科大学实验动物中心

43、提供,许可证号为粤。.实验器材药物输液装置购于南方医科大学中西医结合门诊部。实验药品购于广州展晨生物科技。主要包括氨基酸、脂肪乳、葡萄糖、电解质、维生素及微量元素等。.实验方法.动物分组及模型建立动物随机分为组:组为对照组予正常喂养;组为组予 。组为丹参组,予天静滴。模型建立:用水合氯醛./腹腔麻醉,在大鼠颈内静脉插入外径为.肝素化的硅胶管约.,以丝线固定结扎。将硅胶管折转向背部中线脊柱旁,缝合固定于大鼠背侧皮肤,将外带弹簧套的硅胶管连接输液装置后接输液泵。术后第天开始,通过输液泵持续输注静脉营养液。持续后,将大鼠过量麻醉,下腔静脉取血作生化检测。.药物制备及溶液配制营养液采用“全合一方式,每

44、日均配制新鲜营养液。配方组成口主要包括氨基酸、脂肪乳剂、葡萄糖、电解质、维生素及微量元素等;总液量;.。具体为:% ;%氨基酸;%链/长链脂肪乳水乐维他. ;维他力匹特. ;肝素. ;%. ;丹参组予丹参注射液./。实验二丹参在全胃肠外营养大鼠肝损害中的作用.检测指标下腔静脉取血 ,离心,取上清液,冻存于一,用自动生化仪测定血清谷丙转氨酶、门冬氨酸转氨酶、总胆红素、直接胆红素、碱性磷酸酶等肝功能指标。.数据分析。实验结果计量资料用均数标准差,组问比拟用?方差齐性时,采用方法进行组间多重比拟;方差不齐时,采用方法进行组间多重比拟。用统计软件.进行分析,以.定为差异有统计学意义。二结果肝功能比拟如

45、表?与正常对照组比拟,组、?、均有显著性差异.。与组比拟,丹参组、?、有显著性差异.,而、无显著性差异。总的来说,会对大鼠肝功产生一定的损害,而丹参可对这种损害有一定的防治作用。表各组大鼠肝功能比拟组木. 正常对照组:.硕士学位论文、 ,一三讨论?一急性胰腺炎对肝脏产生损害与病情严重性呈正相关。参考既往临床及动物实验研究资料,并发肝损伤的发生率为.%.%,而并发肝损伤者高达.%刳。并发肝损伤的机率较低。考虑到会在短时间内导致肝损害,故本实验未做动物急性胰腺炎模型以验证。只对致肝损害加以证实。结合实验一的临床研究局部,通过本实验得到以下结论:容易在短时间内导致肝损害,但在筛选临床病例时,已经把有

46、肝功损害的患者排除在外,这在很大程度上排除了实验中肝损害是由所产生的。全胃肠外营养可对大鼠肝脏产生一定的损害,而丹参对这种损害有一定的保护作用。既往研究说明丹参具有抗肝纤维化,提高供体肝脏的保存效果,消除肝细胞氧自由基,减轻肝脏冷热缺血再灌注后的损害,减轻肝细胞脂肪变性和坏死,促进残肝再生,防治肝癌转移复发以及影响肝硬化门静脉高压血流动力学等作用。其作用机制包括增加毛细血管网,改善微循环,保护线粒体,改善能量代谢、抗氧化、去除自由基、调控调亡基因等方面。动物实验研究证实,丹参通过抗氧化和调控凋亡相关基因的表达而到达对抗所致肝损害的作用。丹参用于临床致肝损伤的防治具有重要的意义,其作用机制仍有待

47、深入研究。本实验仅为临床应用提供一定的理论依据。全文小结全文小结本研究以临床需要的急性胰腺炎患者为研究对象,观测临床肝功指标,研究丹参对致肝损害的作用;收集全血,别离血清,利用一联合质谱鉴定技术,对致肝损害的患者血清蛋白质组进行分析,别离并鉴定出相关差异表达的蛋白质,并补以动物实验。取得如下结果:、短期的治疗也会导致轻度的肝损伤,以和升高为主,而给予丹参那么会减轻肝损伤。、全胃肠外营养及丹参均会影响血清蛋白质的表达谱。丹参可能通过下调血清铁传递蛋白前体和上调免疫球蛋白链区和补体前体来参与防治对肝脏的损害、通过质谱鉴定和数据库检索获得的个差异蛋白质,从其功能上来看,主要涉及营养物质代谢、免疫等方

48、面。通过本次研究了解了相关蛋白质表达、修饰或功能变化规律,为建立相应数据库、深入研究提供了依据。、对大鼠肝脏有损害作用,丹参对这种损害有明显的保护作用。、本研究建立的双向电泳到质谱鉴定的技术平台相对成熟,在此根底上所做的蛋白质组学研究是可靠可信的。本研究由于各种因素限制尚存在某些缺乏之处:、目前临床研究中不可防止地存在着疾病本身、药物等多种影响因素,希望下一步可以选择更准确更深入的研究对象。、目前蛋白质组的研究技术,仍不能同时别离出全部的蛋白质,难免漏掉疾病相关的其它重要蛋白质,还有待于进一步改良。、由于科研工程本身及时间方面的制约,未对鉴定的蛋白质进行验证,这些蛋白质点中有假阳性的可能。验证

49、工作尚需进行。、本次研究参考既往临床及动物实验研究,认为急性胰腺炎可迅速对肝脏功能产生损害作用,所以未做动物急性胰腺炎模型以验证,只是辅以致肝损害动物实验。本论文中的动物实验仅是验证对肝脏的损害及丹参在其中硕士学位论文的作用结果,没有系统研究其中的具体机制,仅能推测可致肝损害及丹参可以防治导致的肝损害。研究展望:期待下一阶段能将临床与动物模型研究紧密结合起来,可进一步对本研究鉴定的差异蛋白做功能研究,发现致肝功损害的特异性蛋白,说明差异蛋白质在改变致肝损害中的具体作用。参考文献参考文献谢纲,刘景运.全胃肠外营养长期应用引起的肝损害.药物不良反响杂志,:?.? : 凡 , .,:?.曾思务.全肠

50、外营养的肝胆并发症.肠外与肠内营养,:?.周志韶,舒志军,黎介寿.肠外营养所致的肝脏脏损害一附例报告.诊断病理学杂志,?. ? ., ., , :?.,? , ?.,:?., , , ,:?. .,. ., . ., , ,.?:卜.硕士学位论文裴蕾,任英.丹参作用于肝脏的药理研究进展.中医药学报.,:?.洪莉,吴江,蔡威等.丹参减轻肠外营养所致新生兔肝细胞损伤的实验研究.中华外科杂志.,:?.中华医学会消化病学分会胰腺疾病学组.中国急性胰腺炎诊治指南草案.胰腺病学,:?.赵浩亮,武小勇,李士骏,等.氧自由基在肝脏保存再灌注损伤中的作用及丹参的保护作用.中华实验外科杂志,;. , . .,:.农雄宗,姚玮艳.急性胰腺炎的发病机制.中国实用内科杂志,:?夏强,花天放,张延龄,等.大鼠全胃肠外营养后胆汁淤积的发生机制.中华实验外科杂志,:?.雷志群,胡绍敏.急性胰腺炎并发肝损伤的临床研究.实用医技杂志,:。, . ., :?.李旭,石力,赵碧.乌斯他丁对急性胰腺炎大鼠肝损伤的保护作用.世界华人消化杂志.,.程金川.谷胱甘肽防治患者所致肝功能改变的临床观察.四川医学,:.卢绮萍,史陈让,吴在德,等.丹参防治肝缺血再灌注期肝细胞内钙超载的实验与临床研究.中华外科杂志,:.李钢,王凯诚,陈海平,等.活血化瘀药物对实验性急性胰腺炎肝损害的保护作用.中国中西医结合外科杂志,:.,:?.