DPPH法测定胡萝卜素的抗氧化活性毕业论文

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1、目 录摘要- 1 -Abstract- 2 -第一章绪论- 3 -1.1 果蔬的主要抗氧化活性物质- 3 -1.1.1 茄红素- 3 -1.1.2 类黄酮- 3 -1.1.3 花青素- 4 -1.2 果蔬抗氧化作用机理- 4 -1.3 果蔬抗氧化活性的评价方法- 5 -1.3.1 Rancimat法对果蔬提取物进行抗氧化活性研究- 5 -1.3.2 -胡萝卜素-亚油酸乳化液氧化法- 5 -1.3.3 二苯代苦味酰基自由基(DPPH)法- 6 -1.3.4 硫代巴比妥酸反应物(TBAS)值法- 7 -1.3.5 FRAP(ferric reducing/antiox idant power as

2、say)法- 7 -1.4 本研究的意义和内容- 7 -1.4.1 本研究的意义- 7 -1.4.2 本研究的内容- 8 -第二章实验材料和内容- 9 -2.1 材料与仪器- 9 -2.1.1 实验材料- 9 -2.1.2 实验仪器- 9 -2.1.3 试剂- 9 -2.2 实验内容- 9 -2.2.1 胡萝卜素的提取- 9 -2.2.2 在DPPH体系中测定抗氧化性- 10 -第三章实验结果与讨论- 12 -3.1 胡萝卜素提取液的抗氧化性- 12 -3.2 -胡萝卜素的抗氧化性- 12 -3.3 茶多酚的抗氧化性- 13 -3.4 维生素C的抗氧化性- 14 -3.5 维生素E的抗氧化性-

3、 15 -第四章结论- 17 -展 望- 18 -参考文献- 19 -致 谢- 21 -附 录- 22 -DPPH法测定胡萝卜素的抗氧化活性摘要：胡萝卜中含有大量的-胡萝卜素，摄入人体消化器官后，可以转化成维生素A，是目前最安全补充维生素A的产品。本文中将新鲜胡萝卜打碎并冷冻干燥后浸提得到胡萝卜素，蒸发浓缩至89.15g/ml。用DPPH法测定胡萝卜素的抗氧化活性，对DPPH自由基的清除率为55.07%。比较提取的胡萝卜素与-胡萝卜素、维生素C、维生素E、茶多酚标准样品对DPPH自由基的清除率，结果表明：它们都具有抗氧化活性，提取的胡萝卜素对DPPH自由基的清除能力一般，而维生素C、茶多酚的抗

4、氧化活性都很强。关键词：胡萝卜素；1，1-二苯代苦味酰基自由基(DPPH)；抗氧化性Antioxidant activity of carotene assayed by DPPH methodAbstract: Carrots contain large amounts of -carotene which intake by human digestive system, can be converted into vitamin A, is currently the most secure products of vitamin A supplementation. In this a

5、rticle we extract carotene from broken freeze-dried fresh carrot, and concentrated by evaporation to 89.15g/ml. The antioxidant activity was assayed by using the DPPH method, and the DPPH radical scavenging rate was 55.07%. Comparing the clearance rate to free radicals in DPPH of extracted carotene

6、and standard sample of beta-carotene, vitamin C, vitamin E, polyphenols, it was found that they all have antioxidant activity, and the ability of the clearance rate to free radicals in DPPH was ordinary to the extracted carotene, while the antioxidant activity was high to the vitamin C and polypheno

7、ls, respectively.Key words: carotene; 1, 1-diphenyl-2-pierylhydrazy (DPPH); antioxidant activity第一章 绪论1.1 果蔬的主要抗氧化活性物质果蔬中含有许多不同的抗氧化物质，可清除含氧自由基，这些物质除了维生素E(生育酚)、维生素C(抗坏血酸)、-胡萝卜素、类胡萝卜素外，最近的研究发现番茄红素(lycopene)、类黄酮(Flavonoids)、花青素(anthocyanin)及儿茶素(Catechin)等可能含有更高的抗氧化活性。1.1.1 茄红素茄红素在红番茄、西瓜及红葡萄等中较丰富，其中以红番茄

8、的含量最高(50-90 mg/kg)，其构成为一个特殊的长链分子，含13个双键，是类胡萝卜素中双键含量最高的。这一构造使其具有比-胡萝卜素及其类胡萝卜素更强的清除自由基及终止单线态氧活性的能力。 其顺式异构物的吸收比反式更容易。1-2流行病学研究显示患有膀胱及胰腺癌患者，其血浆中茄红素含量较低。在一个为期7 年包括4.8 万人为对象的实验中，发现摄入来自番茄食品的茄红素可减少前列腺癌，其他的类胡萝卜素则无相关性。1Kohlmeier等测试两组男性脂肪样品中的类胡萝卜素，认为茄红素是最强的心脏保护指标。31.1.2 类黄酮果蔬中的类黄酮主要包括黄酮(Flavones)、黄烷酮(Flavanone

9、s)、黄酮醇(Flavonols)、黄烷醇(Flavanols)、异黄酮(Isoflavones)以及花青素配基(Anthocyanidins)等，通常以糖苷形式存在。4据估计，美国人每天类黄酮的摄入量大于100 mg/人，荷兰人为25.9mg/人，主要来源为茶(61%)、洋葱(13%)及水果(10%)。4类黄酮的抗氧化机制包括去除自由基及活性氧分子；利用螯合能力抑制金属离子，与蛋白质形成复合物，还原氧化的维生素E 或维生素C 以显示加乘效果。类黄酮可以经由螯合方式连结一个或二个铜原子而抑制含铜酶如抗坏血酸氧化酶、多酚氧化酶等。5不同类型的果蔬都含有其特殊的类黄酮,如柑桔类主要是黄烷酮；葡萄则

10、属黄烷醇，主要为儿茶素及表儿茶酚。5Crozier利用HPLC探讨季节、品种及烹煮对番茄、洋葱、芹菜及莴苣中类黄酮含量的影响，结果显示樱桃番茄含有13-203mg/kg鲜重的槲皮酮，一般番茄只有2.1-11mg/kg。洋葱的槲皮酮含量为185-634mg/kg，品种间差异较少，季节性差异较大。烹煮会减少洋葱及番茄中槲皮酮含量。不同莴苣品种槲皮酮含量差异十分明显，变幅为11-911mg/kg。芹菜所含两种黄酮Luteolin(40mg/kg)及Apigen(191mg/kg)亦受品种差异影响含量。61.1.3 花青素花青素是属于黄酮家族的天然色素，广泛存在于水果、蔬菜之中。西方人常吃的葡萄其加工

11、产品可能是花青素的最重要来源。花青素为水溶性，与糖类形成糖苷。Wang等探讨14种花青素的抗氧化活性发现Kuromanin(cyanidin-3-glucoside)活性最高，约为维生素E的3.5倍。7-8桑椹含有大量的矢车菊素(cyanin)及花翠素(dlephinin)，其萃取液可用于治疗微血管疾病以及维持正常的血管渗透性，亦可防止胆固醇引起的动脉硬化。8不同品种葡萄所含总酚类物质的差异相当大，从白色及浅色葡萄的169-272mg/L到深色葡萄的497-1215mg/L。由于深色葡萄品种的黄酮类物质含量较高，其抗氧化活性也较白色及浅白色葡萄为高。因此，红葡萄酒对LDL氧化的抑制效果也比白葡

12、萄酒高出许多。9Saito等最近发现葡萄的萃取液及其所含的Procyanidin具有防止胃溃疡的生理功能。10究其原因可能在于Procyanidin低聚合物具有清除自由基的抗氧化活性，可使胃壁不受自由基引起的伤害；同时Procyanidin可与蛋白质紧密结合而具保护胃壁的功能。3Larrauri研究证明，干燥温度对葡萄皮中多酚含量及抗氧化活性有一定影响，温度愈高，酚类物质及抗氧化活性降低愈明显。111.2 果蔬抗氧化作用机理研究表明，由活性氧引发的自由基会使人体内的脂质与蛋白质发生链式氧化反应。这些自由基寻找生物分子的不饱和位点进行进攻，对有机分子产生一些不应有的修饰和损伤，这些大分子有蛋白质

13、、碳水化合物、脂类物质和核酸。如果在正常细胞代谢中产生的自由基的量超过了保护机能所能承受的限度，就会引起细胞代谢的紊乱，导致细胞膜、组织、酶和基因的损害，以至发生衰老或疾病。12Rosenbtrg13指出柑橘(Citrus)类水果及黄绿色蔬菜富含抗氧化维生C、维生素E 和-胡萝卜素，能够预防白内障的发生。有研究认为莴笋(Asparaguslettuce)叶中富含黄酮类和多酚类物质，能够增强胃液和消化液分泌，增进胆汁分泌。李绍家和刘风书等14指出滇橄榄(Phyllanthus emblica)富含维生素C，并含有18种氨基酸和人体必需的多种常量元素和微量元素。老年人饮用滇橄榄汁2个月后，血液中红

14、细胞超氧化物歧化酶(SOD)活力提高1.3倍，血浆中脂质过氧化物(LPO)含量下降11%。因此，不少学者认为，水果蔬菜防治衰老和老年性疾病可能源于其抗氧化作用。现归纳如下：(1) 清除活性氧自由基。已有大量证据证明，水果蔬菜均有一定的清除氧自由基的能力，这可能是其抗氧化作用的第一道防线。(2) 增强抗氧化酶活性。水果蔬菜可通过增强抗氧化酶活性而保护机体免受氧化损伤。主要证据有：黄刺玫果汁可增强大鼠血GSH-Px活力；卷心菜可提高小鼠肝谷胱甘肽还原酶(GR)及谷胱甘肽硫转移酶(GST)活力；大蒜可增加啮齿动物脑和肝中GST和SOD活性；能提高SOD活性的水果蔬菜还有芥蓝、胡萝卜、灯笼椒、西番莲、

15、猕猴桃、刺玫果、余甘果等。(3) 阻断脂质过氧化链式反应，减少膜脂质过氧化损伤。不少水果蔬菜可抑制过氧化产物MDA及脂褐素的生成，如沙棘、芥蓝、胡萝卜、灯笼椒、刺玫果、山楂、余甘果、西番莲等。杨琦等研究证实，沙棘能够增加大鼠红细胞膜巯基含量，提高大鼠红细胞膜Na+-K+-ATP酶活力。喂饲含花菜的混合饲料后，大鼠结肠粘膜GSH水平明显升高，并呈现剂量效应。(4) 减少DNA 损伤。自由基学说认为，过剩的自由基可以攻击DNA，引起DNA损伤，从而引发多种疾病。对果蔬抗氧化作用的研究目前已有个别深入到DNA分子水平。Stohs等对卷心菜的研究表明，喂饲含卷心菜的饲料可明显减少老年小鼠DNA单链断裂

16、。151.3 果蔬抗氧化活性的评价方法自从果蔬抗氧化活性对于预防癌症、心血管疾病以及抗衰老等方面有很重要的生理功能被提出后，研究果蔬抗氧化活性已成为热门课题。果蔬抗氧化活性的评价方法也随着科学技术的发展和设备的更新而不断地发展和改变。这里简单介绍几种目前常用的评价方法及其采用这些方法所得的研究结果。1.3.1 Rancimat法对果蔬提取物进行抗氧化活性研究Rancimat法测果蔬提取物的抗氧化活性是使用 Rancimat脂肪酸败测定仪来测定的。其工作原理为：在高温条件下通入空气使油脂发生氧化作用，将氧化产生的挥发性小分子醛、酮、酸等物质用硅胶管导入盛有蒸馏水的试管内，使蒸馏水的电导率随时间而

17、变化。用计算机记录试管内水的电导率变化情况，然后再计算出电导率对时间变化曲线二次导数的最大值，可得出油脂氧化初期诱导期的数值。同时与空白对照组比较，就可得出抗氧化剂的保护系数。然后，以保护系数比较抗氧化剂的抗氧化活性。杨安树等16采用Rancimat法对藜蒿(Artemisia selengensis)提取物的抗氧化活性进行了探讨。他们的研究表明：藜蒿提取物对油脂具有明显的抗氧化作用且具有剂量效应关系；在乳化体系中提取物的抗氧化效果比在油体系中强；提取物与丁基羟基甲苯(BHT)和没食子酸丙酯(PG)相比较，提取物浓度达0.10%时，抗氧化活性超过0.02%BHT，而小于0.02%PG；柠檬酸、

18、酒石酸、抗坏血酸对藜蒿提取物表现出较强的协同增效作用。1.3.2 -胡萝卜素-亚油酸乳化液氧化法-胡萝卜素是一种多烯色素，易被氧化而褪去黄色。在反应介质溶液中，由亚油酸氧化产生的过氧化物等能使-胡萝卜素漂白，随时间的延长吸光度越来越小。当以吸光度对时间作图时可得到一条下降曲线。不同原料的溶剂提取物，按其抗氧化活性的大小不同而使-胡萝卜素漂白的速度各异。抗氧化能力越强，吸光度下降越慢。因而不同的曲线有不同的斜率。抗氧化能力越强的，曲线斜率绝对值越小。洪庆慈等17以-胡萝卜素漂白法测定8种粮食材料提取物的抗氧化活性，并比较各提取物的抗氧化活性的高低。他们的实验结果表明，大麦(Hordeum vul

19、gare)籽和燕麦(Avena sativa)籽的石油醚提取物都有较高的抗氧化活性，而稻壳和花生壳的石油醚提取物只有微小的抗氧化活性。而8种粮食的甲醇提取物都具有一定的抗氧化活性，其中以花生壳、稻壳和黄豆壳提取物的抗氧化活性比较强。Von Gadow18用-胡萝卜素掺入实验测定抗氧化活性，实验时在亚油酸中加入-胡萝卜素，随着亚油酸氧化产物的产生，-胡萝卜被氧化，在两者共存的体系中，加入用氧饱和的蒸馏水以加速氧化。在470nm处测吸光度，根据吸光度值的变化判断抗氧化活性。田迪英等19利用-胡萝卜素-亚油酸乳化液氧化法对杭州市场上常见的41种果蔬进行了抗氧化活性的研究，并测定其总酚的含量。他们的实

20、验结果表明：大多数果蔬具有一定的抗氧化活性，其中香椿(Toona sinensis)、藜蒿、莴笋叶、水芹(Oenanthe javanica)等抗氧化活性较强，其总酚含量也较高，说明果蔬抗氧化活性的强弱与果蔬所含的酚类物质有一定的关联性。这为以后天然抗氧化剂的提取和制备提供了一定实验数据。1.3.3 二苯代苦味酰基自由基(DPPH)法DPPH在有机溶剂中是一种稳定的自由基，其结构中含有3个苯环，1个氮原子上有1个孤对电子，呈紫色，在517 nm有强吸收。20-21有自由基清除剂存在时，DPPH的单电子被配对而使其颜色变浅，在最大吸收波长处的吸光度变小，而且这种颜色变浅的程度与配对电子数是成化学

21、剂量关系的。因此，在此波长处的吸收可用于检测自由基的清除情况，从而评价实验样品的抗氧化能力。张立新等22利用DPPH法对青岛地区21种常见蔬菜的乙醇提取液进行了抗氧化活性研究。研究得出：茄子(Solanaceae melongena)和番茄(Lycopersicon esculentum)等蔬菜的抗氧化活性较强，其中茄子皮尤为突出。丰永红等23也用DPPH法测定了甘蔗(Saccharum officinarum)制糖过程中各种原料的抗氧化活性，同时探讨了pH、加热温度、加热时间对自由基清除率的影响。他们的实验结果表明，各种原料均具有较强的抗氧化活性；pH 值对抗氧化活性影响很大，而加热时间、温

22、度对抗氧化活性无显著影响。初步推断该活性物质属酚类。1.3.4 硫代巴比妥酸反应物(TBAS)值法硫代巴比妥酸反应物(TBAS)值法是评价油脂的氧化程度最常用的方法。氧化的油脂多生成丙二醛，一分子的丙二醛可同两分子的硫代巴比妥酸(TBA)作用生成有色化合物，该有色化合物在530 nm左右有吸收。因此，可通过测定丙二醛的量来评价油脂的氧化程度，也可测定抗氧化剂活性。Das 等24用椰子(Cocos nucifera)油为基质，以持续吹入氧气和80 oC水浴为条件，加速氧化40min后测定终产物丙二醛含量，即利用TBAS法测定抗氧化剂抗氧化能力。张英等25用硫代巴比妥酸法测定强化竹叶提取物抗油脂氧

23、化的能力。实验表明：强化后的竹叶提取物的抗氧化能力有显著提高。胡博路和杭瑚26也用硫代巴比妥酸法测定了翅碱蓬(Suaeda heteroptera)提取物的抗氧化作用。他们的实验表明，翅碱蓬的水、甲醇、正己烷提取物对亚油酸脂质过氧化均有良好的阻断作用，其中以正己烷提取物阻断能力最强。他们还用同种方法27测定了核桃壳的抗氧化作用。核桃壳能有效地抑制脂质过氧化，其正己烷、乙酸乙酯提取物抑制脂质过氧化的效果可与茶多酚相媲美。1.3.5 FRAP(ferric reducing/antiox idant power assay)法FRAP原理28为Fe3+-三吡啶三吖嗪(tripyridyl-tria

24、zine, TPTZ, Sigma)可被样品中还原物质还原为二价铁形式，呈现出蓝色，并于593nm处具有最大光吸收，根据吸光度大小计算样品抗氧化活性的强弱。郭长江等29用FRAP对36种蔬菜、30种水果的抗氧化活性进行了测定比较，并且分析了其抗氧化活性与维生素 C 含量的关系。结果表明：一些蔬菜、水果的抗氧化活性较强，有效成分值得进一步研究开发。1.4 本研究的意义和内容1.4.1 本研究的意义大量流行病学研究表明富含果蔬的膳食能降低人体心血管系统疾病和患某些肿瘤的危险性。人们普遍认为产生这些健康效应的成分是膳食中的抗氧化营养素，如维生素E、维生素C、胡萝卜素和硒等。然而，近年来的研究发现，某

25、些植物中存在的多酚类非营养性成分也可能作为抗氧化剂或以其他方式参与其抗肿瘤作用或心血管保护作用。另一方面，对食品的质量而言，脂类的氧化是直接造成食品品质下降的化学因素之一，尤其是富含不饱和脂肪酸的食品，很容易氧化生成过氧化脂类，再经过氧化分解和聚合等反应，产生腐败臭，直至出现毒性。因此，具有抗氧化活性的物质，无论是对食品品质，还是对人体的健康，都具有重大的作用。1.4.2 本研究的内容本文主要研究新鲜胡萝卜中提取的胡萝卜素对DPPH自由基的清除率以确定胡萝卜素的抗氧化活性，并与-胡萝卜素、维生素C、维生素E、茶多酚标准样品的抗氧化活性进行对比得出结论。第二章 实验材料和内容2.1 材料与仪器2

26、.1.1 实验材料新鲜胡萝卜(购自湘潭某超市)，洗净晾干后切小块，用组织捣碎机打碎，在培养皿中铺成薄层冰冻，置于冷冻干燥机中冷冻干燥10h以上后取出，保存于干燥避光处，备用。2.1.2 实验仪器表2-1 实验中使用的主要仪器实验仪器型号生产厂家电热鼓风干燥箱101-1AB型天津市泰斯特仪器有限公司微量移液器1000l量程上海荣泰生化工程有限公司恒温振荡培养箱SPX-250B-D型上海博迅实业有限公司医疗设备厂真空旋转蒸发仪RE-2000A上海雅荣生化设备仪器有限公司紫外分光光度计280 2SUV/VIS电子分析天平BSA 224S Max恒温水浴锅DFD-700真空冷冻干燥系统110-4组织捣

27、碎机2.1.3 试剂二氯甲烷分析纯试剂、无水乙醇分析纯试剂、二苯基苦味酰基自由基(DPPH)、-胡萝卜素、维生素C、维生素E、茶多酚2.2 实验内容2.2.1 胡萝卜素的提取(以下操作均在避光条件下进行)(1) 根据提取的时间、温度、浸提溶剂、料液比等条件的不同，提取出来的胡萝卜素含量也不同，通过正交试验条件优化得到最佳提取条件。(2) 用电子分析天平称取500mg干燥过后的胡萝卜置于1000ml的三角烧瓶中，加入500ml二氯甲烷。(3) 将(2)中的烧瓶置于恒温震荡箱中震荡1.5h，温度为40oC，转速为110r/min。(4) 将浸提过后的溶液过滤得到胡萝卜素提取液，再将胡萝卜素提取液用

28、旋转蒸发仪蒸发浓缩至50ml，温度为30 oC，转速为80r/min。(5) 以二氯甲烷为空白样，用紫外分光光度计在450nm波长处测定上述胡萝卜素提取液的吸光度为2.598，根据胡萝卜素标准样品的浓度-吸光度曲线(图2-1)，可计算出上述提取液中胡萝卜素的浓度为89.15g/ml。(6) 将得到的胡萝卜素提取液转移至棕色广口瓶中，密封置于4 oC干燥环境中保存，备用。图2-1 胡萝卜素标准样品浓度-吸光度曲线2.2.2 在DPPH体系中测定抗氧化性2.2.2.1 溶液的配制(1) DPPH溶液：用电子分析天平称量6mgDPPH用无水乙醇溶解，定容于200ml容量瓶，浓度为30g/ml，摇匀，

29、备用。(2) 胡萝卜素提取液：用5ml移液管分别取5ml上述89.15g/ml胡萝卜素提取液于5个棕色广口瓶中，分别向其中加入0ml、5ml、10ml、15ml、20ml二氯甲烷，得到5个不同浓度胡萝卜素样品液分别为89.15g/ml、44.58g/ml、29.72g/ml、22.29g/ml、17.83g/ml，封口，摇匀，备用。(3) -胡萝卜素标准液：用电子分析天平称量25mg-胡萝卜素用无水乙醇溶解，定容于25ml容量瓶，浓度为1mg/ml，摇匀。用1000l移液枪分别吸取1ml、0.8ml、0.6ml、0.4ml、0.2ml上述-胡萝卜素标准液于5个棕色广口瓶中，分别向其中加入9ml

30、、9.2ml、9.4ml、9.6ml、9.8ml无水乙醇，得到5个不同浓度的-胡萝卜素样品液分别为100g/ml、80g/ml、60g/ml、40g/ml、20g/ml，封口，摇匀，备用。(4) 茶多酚标准液：用电子分析天平称量25mg茶多酚用无水乙醇溶解，定容于25ml容量瓶，浓度为1mg/ml，摇匀。用1000l移液枪分别吸取1ml、0.8ml、0.6ml、0.4ml、0.2ml上述茶多酚标准液于5个棕色广口瓶中，分别向其中加入9ml、9.2ml、9.4ml、9.6ml、9.8ml无水乙醇，得到5个不同浓度的茶多酚样品液分别为100g/ml、80g/ml、60g/ml、40g/ml、20g

31、/ml，封口，摇匀，备用。(5) 维生素E标准液：用电子分析天平称量25mg维生素E用无水乙醇溶解，定容于25ml容量瓶，浓度为1mg/ml，摇匀。用1000l移液枪分别吸取1ml、0.8ml、0.6ml、0.4ml、0.2ml上述维生素E标准液于5个棕色广口瓶中，分别向其中加入9ml、9.2ml、9.4ml、9.6ml、9.8ml无水乙醇，得到5个不同浓度的维生素E样品液分别为100g/ml、80g/ml、60g/ml、40g/ml、20g/ml，封口，摇匀，备用。(6) 维生素C标准液：用电子分析天平称量25mg维生素C用无水乙醇溶解，定容于25ml容量瓶，浓度为1mg/ml，摇匀。用10

32、00l移液枪分别吸取1ml、0.8ml、0.6ml、0.4ml、0.2ml上述维生素E标准液于5个棕色广口瓶中，分别向其中加入19ml、19.2ml、19.4ml、19.6ml、19.8ml无水乙醇，得到5个不同浓度的维生素E样品液分别为50g/ml、40g/ml、30g/ml、20g/ml、10g/ml，封口，摇匀，备用。2.2.2.2 反应液的配制及数据测定DPPH在517nm处有强吸收的特性，加入抗氧化剂后，溶液褪色,用紫外可见分光光度法定量分析自由基清除程度，加抗氧化剂后在波长517nm处吸光度下降表示其对自由基具有消除能力，按表2-2加反应液。表2-2 DPPH试验加样表A0 3ml

33、DPPH溶液+3ml无水乙醇Aj 3mlDPPH溶液+3ml样品溶液Ai 3ml样品溶液+3ml无水乙醇用力摇匀，将样品在37 oC下静置20min后, 加入比色皿中进行吸光度的测定, 测出A0、Ai、Aj所表示样品的吸光度值, 清除率按公式(1)计算。SA(%)=1-(Ai-Aj)/A0100 (1)式中: A0未加提取液的DPPH溶液的吸光度；Ai加入提取液后的DPPH溶液的吸光度；AjDPPH溶液与提取液混合后的吸光度。第三章 实验结果与讨论3.1 胡萝卜素提取液的抗氧化性按照DPPH方法测定不同浓度胡萝卜素提取液的各种反应液在517nm下的吸光度，并计算自由基清除率，结果见表3-1。表

34、3-1 不同浓度胡萝卜素提取液的自由基清除率样品浓度/(g/ml)AiAjA0SA(%)89.150.3770.2220.34555.0744.580.3120.0830.34533.6229.720.3280.0710.34525.5122.290.3340.0600.34520.5817.830.3300.0410.34516.23分析胡萝卜素提取液浓度对DPPH自由基清除率的影响，结果见图3-1。图3-1 胡萝卜素提取液浓度-清除率曲线图由图3-1可知，随着胡萝卜素提取液浓度的增大，其自由基清除率也越大，且清除自由基能力与浓度呈一定的线性关系。3.2 -胡萝卜素的抗氧化性按照DPPH方法

35、测定不同浓度-胡萝卜素的各种反应液在517nm下的吸光度，并计算自由基清除率，结果见表3-2。表3-2 不同浓度-胡萝卜素的自由基清除率样品浓度/(g/ml)AiAjA0SA(%)1000.2690.0820.34545.80800.2710.0680.34541.16600.2740.0420.34532.75400.3050.0290.34520.00200.3240.0110.3459.28分析-胡萝卜素浓度对DPPH自由基清除率的影响，结果见图3-2。图3-2 -胡萝卜素浓度-清除率曲线图由图3-2可知，随着-胡萝卜素浓度的增大，其自由基清除率也越大，且清除自由基能力与浓度呈一定的线性

36、关系。与胡萝卜素提取液的自由基清除率相比，-胡萝卜素的自由基清除率较低，可能是由于胡萝卜素提取液中还含有其他具有抗氧化活性的物质。3.3 茶多酚的抗氧化性按照DPPH方法测定不同浓度茶多酚的各种反应液在517nm下的吸光度，并计算自由基清除率，结果见表3-3。表3-3 不同浓度茶多酚的自由基清除率样品浓度/(g/ml)AiAjA0SA(%)1000.0340.0020.34590.72800.0360.0030.34590.43600.0390.0050.34590.14400.0370.0010.34589.57200.0420.0010.34588.12分析茶多酚浓度对DPPH自由基清除率

37、的影响，结果见图3-3。图3-3 茶多酚浓度-清除率曲线图由图3-3可知，随着茶多酚浓度的增大，其自由基清除率也越大且一直处于较高位置，茶多酚溶液与DPPH溶液混合时溶液立即褪色，都说明茶多酚有较强抗氧化性。清除自由基能力与浓度呈一定的线性关系，但线性相关性相对较低，可能由于茶多酚的抗氧化活性太强，导致一点其他因素就会明显影响曲线变化。需要适当降低茶多酚浓度或提高DPPH溶液浓度或扩大茶多酚浓度梯度。3.4 维生素C的抗氧化性按照DPPH方法测定不同浓度维生素C的各种反应液在517nm下的吸光度，并计算自由基清除率，结果见表3-4。表3-4 不同浓度维生素C的自由基清除率样品浓度/(g/ml)

38、AiAjA0SA(%)500.0090.0030.34598.26400.0140.0010.34596.23300.0210.0020.34594.49200.0330.0020.34591.01100.0500.0010.34585.80分析维生素C浓度对DPPH自由基清除率的影响，结果见图3-4。图3-4 维生素C浓度-清除率曲线图由图3-4可知，随着维生素C浓度的增大，其自由基清除率也越大且一直处于较高位置，维生素C溶液与DPPH溶液混合时溶液立即褪色，都说明维生素C有强抗氧化性。清除自由基能力与浓度呈一定的线性关系。由于维生素C的抗氧化性太强，且维生素C在无水乙醇中的溶解度不高，可以

39、适当降低维生素C溶液的浓度或提高DPPH溶液浓度或扩大维生素C浓度梯度。3.5 维生素E的抗氧化性按照DPPH方法测定不同浓度维生素E的各种反应液在517nm下的吸光度，并计算自由基清除率，结果见表3-5。表3-5 不同浓度维生素E的自由基清除率样品浓度/(g/ml)AiAjA0SA(%)1000.3040.0120.34515.36800.3160.0120.34511.88600.3290.0120.3458.12400.3470.0120.3452.90200.3510.0130.3452.03分析维生素E浓度对DPPH自由基清除率的影响，结果见图3-5。图3-5 维生素E浓度-清除率曲

40、线图由图3-5可知，随着维生素E浓度的增大，其自由基清除率也越大，且清除自由基能力与浓度呈一定的线性关系。在实验过程中，维生素E在无水乙醇中的溶解度非常低，这可能是导致最后自由基清除率低的主要原因，而相关文献表明，维生素E不溶于水，溶于乙醇，且有较强抗氧化活性，所以实验过程中的维生素E不溶物可能是一些辅助药品。建议以后的实验可以更换维生素E样品或用其他有机溶剂溶解。第四章 结论(1) 从新鲜胡萝卜中提取的胡萝卜素具有抗氧化活性，对DPPH自由基的清除率随着胡萝卜素提取液的浓度升高而增大，且呈现一定的线性关系。(2) -胡萝卜素、维生素C、维生素E、茶多酚与胡萝卜素提取液对DPPH自由基的清除率

41、比较见图7。图4-1 各种物质自由基清除率比较由图7可知，各种物质抗氧化活性强弱顺序为：维生素C 茶多酚胡萝卜素提取液-胡萝卜素维生素E。可见，新鲜胡萝卜中粗提取的胡萝卜素具有一定抗氧化活性。展 望本文利用DPPH在517nm处有强吸收的特性，测定新鲜胡萝卜中提取的胡萝卜素对DPPH自由基的清除率，从而评价其抗氧化活性，并与-胡萝卜素、茶多酚、维生素C、维生素E 的抗氧化活性进行对比得知其抗氧化活性强弱。虽然总体已得出一个大致结果，但由于时间、实验室检测手段等因素，尚有很多方面值得进一步研究：(1) 胡萝卜素的提取虽然是经过正交试验得到的最佳提取条件，但也还有很多的其他客观因素没有考虑进去，导

42、致胡萝卜素提取不完全。(2) 整个实验过程中，由于实验设备及条件的影响，可能避光不充分，导致胡萝卜素部分分解，影响其抗氧化活性。(3) 抗氧化活性的检测方法有很多种，而本研究中只用到DPPH法，产生的结果可能有偏差，以后的研究中可以考虑用其他方法再测定。(4) 胡萝卜素提取液可能含有多种抗氧化活性物质，本实验只做了胡萝卜素的粗提取，在以后的研究中可以进一步提取分离纯化不同的物质进行抗氧化活性深入探究。参考文献：1 Levy J, Danilenko M, Sharoni Y. The tomato carotenoid lycopene and cancer A. In: Shahidi F.

43、 Food Factors For Cancer PreventionC. New York: AOCS, 1997.209-212.2 Nir Z, Hartal D. Lycopene: A new carotenoid extracted from tomatoes A. In: Shahidi F. Food Factors for Cancer PreventionC. New York: AOCS, 1997.562-564.3 Kohimeier L. Lycopene and myocardial infarction risk in the EURAMIS study J.

44、AmJ Epidemiology, 1997, 146(8): 198-203.4 Ho C T. Antioxidant properties of plant flavonoids J. In: Food Factors for Cancer Prevention , 1997.593-597.5 Rice-Evans C , Miller N, Paganga. Antioxidant properties of phenolic compounds J. Trends in plant Sci, 1997,2 (4): 152-159.6 Crozier A, Lean M, McDo

45、nald E. Quantitative analysis of the flavonoid content of commercial tomatoes, onions, lettuce and celery J. J Agric Fd Chem, 1997 (45): 590-595.7 Wang H, Cao G, Prior R. Total antioxidant capacity of fruits J. J Agric Fd Chem, 1996 (44): 701-705.8 Wang H, Cao G, Prior R. Oxygen radical absorbing ca

46、pacity of anthocyanins J. J Agric Fd Chem, 1996 (45): 304-309.9 Meyer A, Yi O S, Pearson D. Inhibition of human low density lipoprotein oxidation in relation to composition ofvphenolic antioxidant in grapeJ. J Agric Fd Chem, 1997 (45) : 1638 - 1643.10Saito M, Hosoyama H, Yamaji N. Antiulcer activity

47、 of grape seed extract and procyanidinsJ. J Agric Fd Chem, 1998 (46) : 1460 - 1464.11Larrauri J, Ruperez P, Saura - Calixto F. Effect of drying temperature on the stability of polyphenols and antioxidant activity of red grape pomace peels J. J Agric Fd Chem, 1997, 45: 1390 - 1393.12万素英，赵来军，李林，等食品抗氧化

48、剂M北京：中国轻工业出版社，1998913Donovan J L, Meyer A S, Waterhouse LPhenolic composition and antioxidant activity of prunes and prune juice(Prunus domestica)JJ Agric Food Chem，1998，46：1247 - 125214李绍家，刘风书，侯开胃，等滇橄榄系列产品抗衰老作用研究J食品科学，1998，19(2)：19 - 2115张名位，郭宝江果蔬抗氧化作用研究进展J华南师范大学学报：自然科学版，2001，(4)：115 - 12116杨安树，邓丹雯

49、，郑功源藜蒿中黄酮类物质抗氧化作用的研究J食品科学，2003，24(7)：67 - 7017洪庆慈，吴敏，吴月名，等几种粮食提取物的抗氧化活性研究J粮食储藏，1998(5)：36 - 3918孙艳梅，徐雅琴，杨林天然物质类黄酮的抗氧化活性的研究J中国油脂，2003，28(3)：54 - 5719田迪英，杨荣华果蔬抗氧化活性的研究J食品与发酵工业，2003，19(4)：37 - 4020许申鸿，杭瑚用DPPH 分析法研究野生植物的抗氧化活性J青岛大学学报，1999，12(3)：75 - 7821张尊听，贺云，刘谦光，等分光光度法测定太白山20 种中草药的抗氧化活性J分析试验室，2002，1(3)

50、：50 - 5222张立新，杭瑚，王宗花，等某些常见蔬菜抗氧化活性的研究J食品科学，1999，20(1)：21 - 2323丰永红，王俊芬，于淑娟，等DPPH 法测甘蔗提取物抗氧化活性研究J甘蔗糖业，2003(1)：31 - 3324Das N P , Pereira T A. Effects of flavonoids on thermal autoxidation of palm oil structure activity relationshipsJ. Journal of Oil Chemistry Society, 1990(67)：225 - 25825张英，吴晓琴，傅小伟，等强

51、化竹叶提取物对麦乳精抗氧化性能的改进J食品科学，2001，22(6)：76 - 7926胡博路，杭瑚翅碱蓬的抗氧化活性研究J中国海洋药物，2001，20(4)：29 - 3227胡博路，杭瑚核桃壳抗氧化作用的研究J中国油脂，2002，27(2)：22 - 2328BenzieI F F, Strain J J. The ferric reducing ability of plasmaasa measure of “antioxidant power” : the FRA PassayJAnal Biochem，1996(239)：70 - 7629郭长江，韦京豫，杨继军，等66 种蔬菜、水果

52、抗氧化活性的比较研究J营养学报，2003，25(2)：203 - 207致 谢在此次毕业设计中，我要感谢张继红老师对我的指导与帮助，让我在物质抗氧化活性研究领域学到了很多知识，大大增强了我的自主学习、思考、动手的能力；感谢张老师在工作、生活、为人处事等各方面对我的教诲，让我懂得面对问题应该如何正确的去面对与处理。感谢彭丹同学对我的关心与帮助，在我遇到困难的时候可以与我一起讨论并解决问题，帮助我一起顺利地完成毕业设计。还要感谢实验室各位研究生学长学姐对我的指导与帮助，感谢在环保楼的每一位老师的关心与照顾，感谢化工院提供给我们实验室与实验器材与用品，给我们做毕业设计提供的方便。总之通过此次实验，使

53、我受益匪浅。谢谢大家。附录：在印度经常食用的鲜果及干果的抗氧化活性摘要：从其他世界各地的流行病学研究表明，水果和蔬菜的消费量增加伴随着慢性退行性疾病的风险降低。水果是印度饮食的一个重要组成部分。研究表明，水果和蔬菜都是酚类化合物和抗氧化活性(AOA)丰富的来源。本研究通过两种不同的方法(清除自由基)以确定在印度经常食用的鲜果和干果中抗氧化活性和酚类物质组成，并且这是第一次涉及到他们的总酚含量(TPC)。本文共研究了14种经常食用的新鲜水果和10种干果。鲜果和干果中的AOA和TPC含量都表现出了明显的差异。通过这两种方法评价AOA和TPC之间相关性分析表明在新鲜水果中酚类物质可能最大限度地与AB

54、TS(r=0.84)相关同时与DPPH(r=0.77)相关性较低，然而在干水果中，酚类物质与DPPH(r=97)有很好的相关性而与FRAP(r=87)相关性较低。一般情况下，大部分研究结果表明鲜果及干果富含酚类抗氧化剂，对自由基具有很强的清除能力，也意味着其对人体健康的重要性。关键词：抗氧化活性(AOA)；2，2-联氮基双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二氨盐(ABTS)；2,2-二苯代苦味酰基苯肼基(DPPH)；三价铁还原抗氧化能力(FRAP)；茶多酚；总酚含量(TPC)；2,4,6-三(2-吡啶基)三嗪(TPTZ)1 引言流行病学研究表明，水果和蔬菜消费量增加伴随着退行性疾病的风险降低(

55、Ames， Shigenaga，& Hagen, 1993)。现在的生活作风导致自由基和活性氧自由基生产过剩。天然抗氧化剂发挥着重要的保健作用由于其保护免受氧化应激反应和相关疾病(Lopezet al.，2007)。植物性食物是天然抗氧化剂的主要来源。水果和蔬菜是人类抗氧化多酚重要的食物来源(Vayalil，2002)。相比新鲜水果，干果由于其水分含量低，因此其多酚类含量和AOA(抗氧化活性)可能更高且保质期更长。在近期，由于天然抗氧化剂推定的安全和潜在的治疗价值，已经引起营养学家、食品制造商和消费者的极大兴趣。由于在印度经常食用的新鲜水果和干果中抗氧化活性(非营养成分)和酚类含量的数据资料寥

56、寥无几，因此到目前为止作为功能性食品却很少受到关注(Tarwadi & Agte，2007；Sreeramulu，Vijayakumar Reddy，& Raghunath，2009)。因此，在印度最常用的食品它被认为是与检测化活性相关(Nair，Nagar，& Gupta 1998；Scalbert，Manach，Morand，& Remesy，2005)，并及到他们的总酚内容(TPC)。在本文中，我们首次报告了在印度经常食用的新鲜水果及干果中的AOA和TPC。2 材料和方法2.1 药品和试剂2,2-二苯代苦味酰基苯肼基(DPPH)，没食子酸，2,4,6-三(2-吡啶基)三嗪(TPTZ)，2

57、，2-联氮基双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二氨盐(ABTS)，三价铁还原抗氧化能力(FRAP)，水溶性维生素E，氯化铁，都来自Sigma公司，所有其他试剂和化学分析纯试剂都购自当地，实验中使用超纯水。2.2 样品采集和提取每种鲜果和干果都从当地三个市场购买三个样品，并分别作为该市场的单独样品，每个采集的样品总质量为250-300g。采取适当的照顾以避免未成熟、损坏和烂熟水果。对市场上购买的水果进行清洗，将可食用部分切成小块并用酸化甲醇水溶液浸提。简单地说，将干果整个样品的可食用部分用国产搅拌器打成粉末，取2-5g的样品浸提，新鲜水果责考虑直接放入多速加速器匀浆机并提取。对三个市场样本进行

58、抗氧化活性和总酚的提取和分析，并对每个样本重复估计(Miller，Rigelhof，Marquart，Prakash，& Kanter，2000)。2.3 可溶性酚类化合物的提取Sing，Chidambara Murthy，Jayaprakasha(2002)和Chidambara Murthy，Singh，and Jayaprakasha(2002)对用甲醇提取的每一步都进行了描述。水果抗氧化活性和总酚含量(可溶性酚类化合物)的每一种提取方法都有较早的描述(Mohamed，Cesarettin，Anne，Mark，& Fereidoon，2005)，Vinson，Yong，Xuelci，Li

59、gid，和 Bose(2001)做出了些微修改。样品(2-5g)在多速加速器匀浆机中用10ml含有0.1%盐酸的60%甲醇溶液浸提两次。汇集样品悬浮液并在室温下放置至少2小时，偶尔涡旋振荡。将样品悬浮液在10000 g，10离心15分钟，将上清液保存在40直到分析。2.4 总酚含量测定Singleton and Rossi(1965)对总酚含量的每种测定方法都进行了描述。简单地说，将相应量的样品提取液用福-锡二氏试剂氧化，并将反应物用碳酸钠中和。没食子酸用来作为参考标样。2.5 DPPH自由基清除活性Aoshima，Hideaki，Hirofumi， Yoshinobu(2004)和Chimm

60、ic，Benedini，Gainai， Riponi(2004)进行了抗氧化活性测定。此法是基于抗氧化能力以清除DPPH阳离子自由基。此方法确定分子的供氢能力且不会产生氧化链式反应或与自由基中间体反应。简单来说，100l样品提取液或标准样品中加入2.9mlDPPH试剂(0.1mM溶于甲醇)并剧烈涡旋振荡。将反应混合物在黑暗中室温下静置30min，将变色的DPPH在517nm波长下空白测定值用可溶性维生素E的等值mg/100g来表示。2.6 FRAP法Iris，Benzie，and Strain(1999)测定了样品萃取物的三价铁还原抗氧化能力(FRAP)。该方法是基于样品将Fe3+转化为Fe2

61、+的能力。在TPTZ存在下，Fe2+的TPTZ复合物，呈现蓝色并在593nm波长出被测定。简单地说，在相应浓度的样品提取液中加入3.0mlFRAP试剂(少数样品进一步稀释至标准范围)，并在室温保温6min后在593nm波长处测定吸光度。用硫酸亚铁水溶液作为标准制定标准曲线。2.7 总抗氧化检测(TEAC/ABTS)TEAC法是基于对蓝绿色ABTS自由基阳离子的清除能力，相对于可溶性维生素E对ABTS自由基清除能力来说。这种方法同时适用于亲脂性和亲水性抗氧化剂(Re et al.，1999)。现配的ABTS自由基溶液是将ABTS(7mM水溶液)溶液与硫酸钾(2.45mM的最终浓度)反应，并将该反应混合物于黑暗环境中室温静置12-16h后再使用。现配的ABTS溶液在