微生物的纯种分离培养学习教案

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1、会计学1微生物的纯种分离微生物的纯种分离(fnl)培养培养第一页，共24页。二、实验原理二、实验原理 在自然在自然(zrn)界里，微生物的种类繁多，数量很大界里，微生物的种类繁多，数量很大，几乎都是杂居在一起的。，几乎都是杂居在一起的。 微生物群落在土壤的物质转化中具有多种重要作微生物群落在土壤的物质转化中具有多种重要作用，它与土壤肥力和植物营养有密切关系，同时又用，它与土壤肥力和植物营养有密切关系，同时又是工业和医药用菌的资源。是工业和医药用菌的资源。 从含有多种微生物的自然从含有多种微生物的自然(zrn)材料中，通过稀释材料中，通过稀释分离、划线分离、单细胞分离等方法，使它由单个分离、划线

2、分离、单细胞分离等方法，使它由单个的个体在固体培养基上繁殖形成单个菌落，由于此的个体在固体培养基上繁殖形成单个菌落，由于此菌落是由单个个体繁殖而来的，故可获得纯种。这菌落是由单个个体繁殖而来的，故可获得纯种。这种获得单个菌株纯培养的过程称为微生物的分离与种获得单个菌株纯培养的过程称为微生物的分离与纯化。纯化。 第2页/共24页第二页，共24页。常用的微生物的分离与纯化方法1.简易(jiny)单细胞挑取法 在不借助显微操作器的情况下，直接在普通 显微镜下利用低倍镜分离单孢子的方法。它采用很细的毛细管吸取较稀的萌发的孢子悬浮液滴在培养皿盖的内壁上，在低倍镜下逐个检查微滴。将只含有一个萌发孢子的微滴

3、放一小块营养琼脂片，使其发育成微菌落。再将微菌落转移到培养基中，即获得仅由单个孢子发育而成的纯培养。 第3页/共24页第三页，共24页。2.平板分离法该方法操作简便，应用普遍。其基本原理及特点包括两方面： （1）通过稀释涂布或平板划线等技术能实现单细胞来源的纯培养。 （2）通过控制培养条件实现选择性分离。选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养、酸碱度、温度和氧等要求或加入某种抑制剂造成只利于(ly)该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。第4页/共24页第四页，共24页。三、实验用品三、实验用品( (一一) )材料材料 土壤样品、牛肉膏蛋白胨培养土壤样品、牛肉膏

4、蛋白胨培养基、高氏一号培养基、马铃薯培养基、豆芽基、高氏一号培养基、马铃薯培养基、豆芽(du y)(du y)汁培养基。汁培养基。( (二二) )器材器材 无菌培养皿、无菌吸管、无菌无菌培养皿、无菌吸管、无菌水、酒精灯、接种环、接种针、火柴等。水、酒精灯、接种环、接种针、火柴等。 第5页/共24页第五页，共24页。四、实验操作四、实验操作1.1.连续稀释分离法连续稀释分离法（1 1）稀释土样）稀释土样 称称10 g10 g土样，加到有土样，加到有90 mL90 mL无菌水和少许无菌水和少许(shox)(shox)玻璃珠的三角烧瓶内，充分振荡，使土样与水充分混玻璃珠的三角烧瓶内，充分振荡，使土样

5、与水充分混合，使微生物充分释放到土壤悬液合，使微生物充分释放到土壤悬液( (原液原液) )中。中。 用无菌吸管吸取土壤悬液用无菌吸管吸取土壤悬液l mLl mL，加到一个盛有，加到一个盛有9 9 mLmL无菌水的试管内，制成稀释度为无菌水的试管内，制成稀释度为10-110-1的土壤悬液，的土壤悬液，将此吸管在试管内反复吹洗将此吸管在试管内反复吹洗3 3次，然后取出，通过火焰次，然后取出，通过火焰，再插入纸套内，以备再用。轻轻摇动试管，使菌液，再插入纸套内，以备再用。轻轻摇动试管，使菌液均匀。再用刚才用过的吸管，插入试管内，反复吹洗均匀。再用刚才用过的吸管，插入试管内，反复吹洗3 3次，然后取出

6、次，然后取出l mLl mL菌液，加到另一支菌液，加到另一支9 mL9 mL无菌水中，无菌水中，制成稀释度为制成稀释度为10-210-2的土壤悬液。的土壤悬液。 相同操作直到获得相同操作直到获得lO-4lO-4的土壤稀释液。的土壤稀释液。第6页/共24页第六页，共24页。用移液管吸取(xq)菌液 第7页/共24页第七页，共24页。 （2）接种 从稀释液（10-4）各吸取1 mL分别(fnbi)加到2个牛肉膏培养皿，从稀释液（10-3）吸取1 mL分别(fnbi)加到高氏一号、马铃薯、豆芽汁培养皿各2个。第8页/共24页第八页，共24页。（3）倒平板(pngbn) 将培养基加热融化，待冷至556

7、0时，右手持三角瓶置火焰旁边，用左手将瓶塞轻轻地拔出，瓶口保持对着火焰；然后用右手手掌边缘或小指与无名指夹住瓶塞，左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒入培养基约15ml，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基与菌液混合并均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上，静置凝固。 第9页/共24页第九页，共24页。倒如下倒如下(rxi)(rxi)平板：平板：牛肉膏蛋白胨平板（分离细菌）牛肉膏蛋白胨平板（分离细菌）2 2个：个： 加稀释度为加稀释度为10-410-4的菌液；的菌液；(2)(2)高氏一号平板（分离放线菌）高氏一号平板（分离放线菌）2 2个：个： 加稀释度为加稀释度为10-310-3的菌液；

8、的菌液；(3)(3)马铃薯培养基平板（分离霉菌）马铃薯培养基平板（分离霉菌）2 2个：个： 加稀释度为加稀释度为10-310-3的菌液；的菌液；(4)(4)豆芽汁培养基平板（分离酵母菌）豆芽汁培养基平板（分离酵母菌）2 2个：个： 加稀释度为加稀释度为10-310-3的菌液；的菌液；(5)(5)牛肉膏蛋白胨空白平板牛肉膏蛋白胨空白平板2 2个：个： 备用（细菌的划线分离操作）备用（细菌的划线分离操作）第10页/共24页第十页，共24页。2.平板划线法纯化菌株 将融化的培养基制成平板，冷凝后，左手持皿底，平板面向上，稍斜，靠近火焰(huyn)，用接种环取稀释样品一环在平板上划线，划线分离方法如图

9、。 第11页/共24页第十一页，共24页。分段分段(fn dun)划线划线连续连续(linx)划线划线第12页/共24页第十二页，共24页。恒温培养 将分离细菌（牛肉膏蛋白胨培养基）的培养皿置于（倒置(dozh)）370C恒温箱中，培养24小时；分离的放线菌（高氏I号培养基）培养皿置于（倒置(dozh)）280C恒温箱中培养7天；分离的霉菌（马铃薯培养基）培养皿置于（倒置(dozh)）280C恒温箱中培养4天；分离的酵母菌（豆芽汁培养基）的培养皿置于（倒置(dozh)）280C恒温箱中培养48小时。 第13页/共24页第十三页，共24页。土壤微生物数量推算 土壤中的微生物经稀释倾注培养后，每一

10、个活菌细胞可以在平板上繁殖形成一个肉眼可见的菌落，故可根据(gnj)平板上菌落的数目推算出每克土壤中所含的活菌总数，计算公式如下： 每克土壤微生物的数量= 本次实验只计牛肉膏蛋白胨平板上的细菌数、高氏一号上的放线菌数。平均菌落数稀释倍数(10/1) 100土壤克数第14页/共24页第十四页，共24页。 菌落形态 区分和识别各类微生物可从菌落形态（群体形态）和细胞形态（个体形态）两方面进行(jnxng)。菌落是由大量微生物细胞集结的宏观形态，每大类的微生物都具有特定的菌落特征，可作为微生物分类研究的初步依据。多种霉菌(mjn)菌落第15页/共24页第十五页，共24页。 菌落(jnlu)形态 多种

11、酵母菌菌落(jnlu)细菌(xjn)菌落(E.coli)第16页/共24页第十六页，共24页。 菌落(jnlu)形态 放线菌菌落(jnlu)（诺氏链霉菌）放线菌菌落(jnlu)(链霉菌)Streptomyces coelicolor (天蓝色链霉菌分泌抗菌素)Thompson et al. Genome Biology 2002 一些土壤放线菌菌落第17页/共24页第十七页，共24页。 菌落(jnlu)形态 多种细菌(xjn)菌落第18页/共24页第十八页，共24页。 菌落形态(xngti)的观察描述 从不同平板上选择不同类型的菌落进行肉眼观察，从如下方面进行描述 大小：直径范围 形状：圆形、

12、不规则形、根足形等 颜色：分正面、反面 边缘：整齐、锯齿状、丝网状、放射状等 光泽：润泽或干燥，透明、不透明或半透明 质地：平滑致密或粗糙疏松，与培养基结合紧密度 有无特殊形态(xngti)如皱襞、旋涡状、荷包蛋状 隆起：程度分扁平、隆起、内陷等第19页/共24页第十九页，共24页。菌落形态(xngti)的描述举例 1圆形，边缘(binyun)整齐，表面光滑2圆形，边缘(binyun)整齐，表面有同心圆3圆形，叶状边缘(binyun)，表面有放射状皱褶4圆形，锯齿状边缘(binyun)，表面较不光滑5不规则形，波浪状边缘(binyun)，表面有不规则皱纹6圆形，边缘(binyun)残缺不全，表

13、面呈颗粒状7毛状8根状第20页/共24页第二十页，共24页。菌落(jnlu)形态的描述举例 微生物菌落隆起(ln q)程度的差异绿脓杆菌(l nn n jn)Pseudomonas aeruginosa植物乳杆菌Lactobacillus plantarumAn unkown isolate第21页/共24页第二十一页，共24页。四大(s d)类微生物菌落形态的比较 细菌细菌放线菌放线菌霉菌霉菌酵母菌酵母菌相对大小小较小大较小隆起隆起较扁平隆起隆起度较细菌为高光泽多润泽，或干燥无光泽，有皱摺，表面粉状或颗粒状无光泽润泽粘稠，呈奶油状颜色多样，常见白、黄、红常见灰白，色素颜色多样，正反色不同颜色多样，孢子与菌丝不同正反不同常见白、红、土黄致密度易挑起结合紧密难挑起菌丝疏松但难完整挑起，孢子易沾取易挑起气味多臭味多土腥味多霉味多酒味第22页/共24页第二十二页，共24页。菌落(jnlu)形态描述记录表 菌落一菌落一菌落二菌落二菌落三菌落三菌落四菌落四培养基培养时间、温度大小形状、边缘隆起度光泽颜色致密度第23页/共24页第二十三页，共24页。感谢您的观看感谢您的观看(gunkn)！第24页/共24页第二十四页，共24页。