给学生微生物遗传育种学复习思考题1

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1、2010级生物技术专业微生物技术方向微生物遗传育种复习思考题微生物遗传育种复习思考题01 绪论1、 工业微生物菌种应具有哪些基本特征？ 非致病性；适合大规模培养工艺要求；利于规模化产品加工工艺；具有相对稳定的遗传性能和生产性状；形成具有商业价值的产品或具有商业应用价值。2、 简述工业微生物遗传育种的分类。 天然菌种（native strain）：通过自然筛选和分离获得的工业菌种；诱变菌种（mutagenized strain）：通过物理、化学等诱变剂在实验室人工诱变自然筛选与分离的菌株所获得产量或/和性状改善的工业菌种；重组菌种（recombinant strain）是通过遗传重组技术对菌种进

2、行定向遗传改良获得的工业菌种；遗传修饰生物体（genetic modification organisms, GMOs）：经外源基因导入并因此发生遗传整合和性状改变的生物体。3、 试从微生物遗传学的不同角度阐述你对微生物多样性的认识。 一、微生物物种的多样性;二、微生物遗传的多样性;三、微生物代谢的多样性;四、微生物的生态多样性;五、微生物利用的广泛性02 第四章 工业微生物育种诱变剂1、 什么是诱变剂？可分为哪几种类型？ 诱变剂：凡能诱发生物基因突变，并且突变频率远远超过自发突变率的物理因子或化学物质.可以分为三类：物理诱变剂；化学诱变剂：一类能对DNA起作用，改变DNA结构，并引起遗传变异

3、的化学物质；生物诱变剂：采用某些噬菌体来筛选抗噬菌体突变菌株时，常常发现伴随着出现抗生素产量明显提高的抗性突变株。因此，可以认为这些溶源性噬菌体是一种生物诱变剂。2、 什么是突变？突变的表现型有哪些？基因突变的特点有哪些？ 突变，从广义上讲，除了转化、转导、接合等遗传物质的传递和重组引起生物变异以外，任何表型上可遗传的突变都属突变范围，如染色体整倍性和非整倍性的变化及染色体结构上的畸变等都包括在内。 1、形态突变型，是一种可见突变，它包括微生物菌落形态变化，如菌落形状大小、颜色、表面结构等；2、生化突变型，；3、条件致死突变型；4、致死突变型；5、抗性突变型；6、营养缺陷型； 普遍性；随机性（

4、基因突变可以发生在生物个体发育的任何时期和生物体的任何细胞。突变发生的时期越早，表现突变的部分越多，突变发生的时期越晚，表现突变的部分越少。）；突变率低；多数有害；不定向性（一个基因可以向不同的方向发生突变，产生一个以上的等位基因。3、 突变后其基因型是否会很快表现？为什么？ 变基因的出现并不意味着突变表型的出现，表型的改变落后于基因型的改变，即表型延迟，微生物通过自发突变或人工诱变而产生新的基因型个体所表现出来的遗传特性不能在当代出现，其表型的出现必须经过2代以上的繁殖复制。表现延迟的原因有：1、与诱变剂性质和细胞壁结构组成有关；2、当突变发生在多核细胞中的某一个核，该细胞就成为杂核细胞了；

5、3、原有基因产物的影响。（产生原因：分离性迟延现象生理性迟延现象）4、物理诱变剂主要有哪几类？请举例？ 物理诱变剂包括：紫外线，X射线，射线，快中子，射线，射线，微波，超声波，电磁波，激光射线和宇宙射线等5、 化学诱变剂主要有几大类？ 碱基类似物；烷化剂；脱氨剂；移码诱变剂；羟化剂；金属盐类；其他化学诱变剂6、 使用化学诱变剂时需要注意什么？、 在进行化学诱变处理时，控制使用剂量要以诱变效应大，而副反应小为原则。处理时的温度对诱变效应也有一定影响。绝大多数化学诱变剂都具有毒性，其中90%以上是致癌物质或极毒药品，使用时要格外小心，不能直接用口吸，避免与皮肤直接接触，不仅要注意自身安全防止污染环

6、境，造成公害。7、 根据你所学的诱发突变的知识，你认为能否找到一种仅仅对某一基因具有特异性诱变作用的化学诱变剂？为什么？ 不能找到具有特异性诱变作用的化学诱变剂，因为对于一般的化学诱变剂：碱基类似物、碱基修饰剂、移码突变剂，均不具有特异性。诱变的特异性是靠识别碱基对来进行的，而任一个基因都不可能有完全特异的碱基对供识别。突变是随机性的。因为从分子生物学的角度来看，所有的基因都是存在于DNA双链中，基因的信息都存在于由ATCG碱基对的排列顺序中。即使有某些物质可以特异的识别某几个碱基的排列顺序，但这种排列也存在于其他基因之中，诱变是在整个基因组范围内发生的。所以从现有的科研水平来看，不存在有特异

7、性的理化诱变剂。现在对基因的诱变可以通过传统的遗传学方法实现，可以构建带有诱变位点的基因载体，转入生物体中，达到特异诱变的目的。 8、表现延迟：微生物通过自发突变或人工诱变而产生新的基因型个体所表现出来的遗传特性不能在当代出现，其表型的出现必须经过2代以上的繁殖复制。03 第五章 菌种分离筛选1、 工业微生物的来源？ 1、向菌种保藏机构索取有关菌株，从中筛选所需菌株；2、由自然界采集样品，如土壤、水、动植物体等，从中进行分离筛选；3、从一些发酵制品中分离目的菌株。2、 从土壤中筛选微生物时，采样应该注意一些什么问题？ 根据土壤特点：1、土壤有机质含量和通气情况；2、土壤酸碱度和植被状况；3、地

8、理条件；4、季节条件；采样方法：用取样铲，将表层5cm左右的浮土除去，取5-25cm处的土样10-25g，装入事先准备好的塑料袋内扎好。3、 什么叫富集培养？ 是在目的微生物含量较少时，根据微生物的生理特点，设计一种选择性培养基，创造有利的生长条件，使目的微生物在最适的环境下迅速地生长繁殖，数量增加，由原来自然条件下的劣势种变成人工环境下的优势种，以利分离到所需要的菌株。4、 纯种分离的方法有哪些？简述菌种分离和筛选的步骤。 纯种分离通常采用梯度稀释涂布法和划线法。 划线法是用接种针挑取微生物样品在培养基上直接划线（一般采用梯度划线法），培养后获得单菌落。划线法简便、快速，但所得到的单菌落不一

9、定是纯种（可采用多次转接划线加以弥补）。 稀释法是先将样品经无菌水或灭菌生理盐水梯度稀释后，再涂布到固体培养基上，培养后获得单菌落。稀释法使微生物样品分散更加均匀，获得纯种的概率更大。通过控制营养和培养条件进行纯种分离：一般都采用筛选性平板辅以筛选性培养条件（1）控制分离培养基中的营养成分（碳氮源）（2）控制培养基的pH值（采用缓冲体系）（3）控制培养温度（嗜热性、大类特性如细菌35，霉菌27度）（4）供氧条件的控制（厌好氧）利用生化反应进行分离（初步分离）：根据目的微生物的特殊生理特性或其代谢产物的生化反应进行设计。常用方法：（1）透明圈法（培养基浑浊）（2）变色圈法（指示剂或显色剂）（3）

10、生长圈法（采用营养缺陷菌作为指示）（4）抑菌圈法（抗生素敏感菌作为指示） 可分为采样、富集、分离、产物鉴别几个步骤。04 第六章 微生物诱变育种1、 用野生型的大肠杆菌为出发菌株，可用哪种诱变剂怎样进行诱变得到Leu-突变株，如何检出和鉴定该突变株？1。先要获得野生型大肠杆菌的纯培养物2。诱变：可以选择各种诱变法，如紫外线诱变法，将一定浓度的菌液（可分成好几等分分别做实验）放在一定强度的紫外灯下照射，那分成的几等分可以分别照射10S，20S，30S，40S，50S，60S，注意，菌液不可太稀太浓，这个操作应该在黑暗的条件下进行，只允许有紫外光，以免光修复造成突变失败。3.培养：将上述菌种分别涂

11、抹在配好的完全培养基上（牛肉膏-蛋白胨培养基），倒置培养过夜4，筛选：配置好基本培养基，再往上面添加一定浓度的氨基酸营养液，除了不要添加你说要得到的营养缺陷的那种氨基酸，必需氨基酸都要添加，再用影印法将3中的菌落印到这些培养基上，倒置培养过夜。5。挑取：直接挑取4中培养基上的菌落，就是你要找的氨基酸营养缺陷突变菌株在2中，之所以要分成好几份做，再以不同时间长短去照射，是为了加大筛选的效率时间过短，可能得不到想要的突变菌种，而时间过长，菌株全死，也得不到想要的菌株，所以这样做也可以算是一个试验性的步骤！2、诱变育种工作中如何制备菌悬液？ 在诱变育种中，所处理的细胞必须是单细胞的均匀悬液状态。原因

12、：1、分散状态的单细胞可以均匀地接触诱变剂；2、可避免长出不纯菌落。菌悬液由出发菌株的孢子或菌体细胞用生理盐水或缓冲液制备而成，其质量将直接影响诱变效果。1、供试菌株的孢子或菌体要年轻、健壮；2、菌悬液制备方法：细菌经20h-24h培养的新鲜斜面，移接到盛有基本培养基的三角瓶中，于35-37振荡培养到对数期，在于6培养1h使之同步生长，然后加入一定密度的嘧啶、嘌呤或酵母膏，继续振荡培养20-60min。置于低温10min，离心洗涤，用冷生理盐水或缓冲液制备菌悬液，放在盛有玻璃珠的三角瓶内振荡10min,令其分散，用无菌脱脂棉或滤纸过滤。通过菌体计数，调整菌悬液的浓度供诱变处理。3、根据突变的光

13、复活修复作用、原理，你认为在进行紫外线诱变处理时，应注意什么?为了使被诱变的细胞能均匀地受到紫外线照射，你将如何做？ 必须在暗室或红光下进行，并且不能马上进行光照射 照射距离要合适，不能太远，否则达不到诱变作用，也不能太近，否则菌体会死 照射时间要恰当紫外灯的功能要适宜。 在紫外线照射时，盛菌液的培养皿应置于磁力搅拌器上，边照射边搅拌使细胞能均匀受到紫外线照射。4、 紫外线引起的胸腺嘧啶二聚体对微生物有何影响？哪些修复系统可对此进行修复，其结果如何？微生物在正常情况下进行DNA复制时，首先DNA双链解开成为单链，然后两条单链各自与细胞内游离的碱基互补配对形成新链。如果此时双链之间有嘧啶二聚体存

14、在，则因二聚体的交联作用，阻碍双链分开，复制到此处就无法进行下去，造成DNA异常状态。如果在一条单链上出现嘧啶二聚体，则会影响复制过程碱基的正常配对。在正常情况下T与A配对，若二聚体形成，就要破坏A的正常掺入，复制就会在这一点突变停止或错误进行，以致在新形成的链上有了一个改变了的碱基序列。有光修复、切补修复、重组修复、SOS修复系统。还有聚合酶的校正作用。光修复、是一种高度专一的修复方式，只作用由紫外线引起的DNA嘧啶二聚体的修复切补修复、发生在DNA复制之前，是对模板的修复，如大肠杆菌的Uvr修复系统，负责切除大量的胸腺嘧啶二聚体。重组修复、不将损伤碱基除去，而是通过复制后，经染色体交换，使

15、子链上的空隙部位不再正对T=T，而是面对正常的单链。其中Rec系统负责消除那些没有被切除修复系统所切除的T=T可能造成的可怕的后果。SOS修复系统、松懈DNA复制校对系统，允许新生DNA链越过T=T而延伸，不去管双螺旋结构的变形。导致错误的碱基出现在生长链的任何位置，数量太大，错配修复和切除修复系统纠正一些，仍留有很多错配碱基，从而造成突变。光修复、切补修复和聚合酶修复都是修复模板链。而重组修复是形成一条新的模板链，SOS是产生连续的子链。SOS修复是唯一导致突变的修复，其余的修复机制都是将DNA损伤恢复到损伤前的状态或产生与亲本完全相同的子代DNA。5、某人将一细菌培养物用紫外线照射后，立即

16、涂布在加有链霉素（Str）的平板上，放在有光条件下培养，从中筛选Str抗性突变株，结果没有长出Str抗性菌落，试分析失败的原因？ 1、紫外线诱变后见光培养，造成光修复，使得突变率大大下降，以致选不出str抗性菌株；2、紫外线的照射后可能根本没有产生抗str的突变。6、紫外线诱变育种的作用机制。 紫外线诱变一般采用15W紫外线杀菌灯，波长为2537A灯与处理物的距离为1530cm，照射时间依菌种而异，一般为几秒至几十分钟。一般我们常以细胞的死亡率表示，希望照射的剂量死亡率控制在7080%为宜。被照射的菌悬液细胞数，细菌为106个/mL左右，霉菌孢子和酵母细胞为106107个 /mL。由于紫外线穿

17、透力不强，要求照射液不要太深，约0.51.0cm厚，同时要用电磁搅拌器或手工进行搅拌，使照射均匀。由于紫外线照射后有光复活效应，所以照射时和照射后的处理应在红灯下进行。7、 何为基本、完全、补充培养基？ 基本培养基：凡是能满足某种野生型菌株营养要求的最低成分的合成培养基，称为基本培养基；常以-表示；完全培养基：在基本培养基中加入一些富含氨基酸、维生素及含氮碱基之类的天然有机物质如蛋白胨、酵母膏等，以满足该微生物的各种营养缺陷型菌株都能生长繁殖的培养基，称为完全培养基，常用+表示；补充培养基：在基本培养基中只是有针对性地加入某一种或某几种营养缺陷成分，以满足相应的营养缺陷型生长的培养基，称为补充

18、培养基，补充培养基可按所加入营养成分相应地用A、B等来表示。8、何为野生型、营养缺陷型、原养型？ 营养缺陷型（auxotroph）：经诱变产生的一些合成能力出现缺陷，而必须在培养基内加入相应有机养分才能正常生长的变异菌株。如：lys - ；his - ；野生型(wild type)：自然界分离到的任何微生物，在其发生营养缺陷突变前的原始菌株，为该微生物的野生型。如：lys+；his+;原养型 (prototroph) ：指auxo突变菌株回复突变或重组后产生的菌株，与野生型的表型相同。9、 淘汰野生型的目的、原理及方法如何？ 目的：使缺陷型菌株得以富集，以利于检出； 原理：限制营养成分使缺陷型

19、细胞生长受抑制，野生型细胞在生长过程中被杀死或生长后被除去。方法：1）抗生素法：野生型能在MM中生长，而缺陷型不能，于是将诱变处理液在MM中培养短时让野生型生长，处于活化阶段，而缺陷型无法生长，仍处于休眠状态。由于细菌或酵母对一些抗生素敏感，于是就相应加入一定量的抗生素，结果活化状态的野生型就被杀死，保存了缺陷型。一般细菌可以采用青霉素，酵母可采用制霉菌素。2）菌丝过滤法：适用于丝状菌（放线菌、霉菌）。原理：野生型在基本培养基上发 育成菌丝，不能 通过滤膜；营养 缺陷型孢子可通过滤膜，野生型 菌丝不能通过。3）差别杀菌法：基本培养基上只有野生型生长，加热杀死野生型营养体，保留营养缺陷型芽孢。

20、细菌80 酵母60 适用于产芽孢、孢子菌。10、如何检出和鉴定营养缺陷型突变株？ 原理：在固体基本培养基和完全培养基上，生长情况完全不同，缺陷型在CM上生长良好，而在MM上则不生长，野生型都能生长。 检出具体方法：影印法1将一较平皿直径小1cm的金属圆筒蒙上一层灭菌的丝绒，用金属夹夹住，灭菌。2将完全培养基上长出的全部菌落在丝绒上轻轻一压，使之成为印模，标记方位。3将基本培养基平皿和完全培养基平皿在标记的同一方位上先后轻轻一压，此菌印模即复印于上。4 将CM和MM在恒温箱中培养。5二平皿相同方位进行比较， 即可发现在MM平皿上长出的菌落少于GM平板上的。MM上未长而相应于CM上长出的那几个菌落

21、就可能是缺陷型。此法要求平皿上菌落不能太多，菌落之间应有一定间隔。 点种法（点植对照法）也就是任意法。用接种针或牙签将CM上长出的菌落在MM和CM两副平板上接种，依次在相应位置点种，然后一起培养，观察其生长情况。此法结果明确，但工作量大。夹层法先在培养皿上倒一层基本琼脂培养基，凝固后涂上一层含菌的MM，凝固后再倒一薄层MM琼脂培养基，培养24h，将出现的菌落标记，然后倒上一层CM琼脂培养基，再培养。这时第二批长出的菌落就可能是缺陷型。此法缺点是，结果有时不明确，而且将缺陷型菌落从夹层中挑出并不很容易。限量补充培养法。鉴定方法： 含营养缺陷型菌株的基本培养基平板的制备。 营养缺陷型营养类别的鉴定

22、。 缺陷型菌株单一营养因素的鉴定。可分为两类：一种方法是在一个平皿中加入一种营养物质以测定多株缺陷型菌株对该生长因子的需求情况；第二种方法是在同一平皿上测定一种缺陷型菌株对许多种生长因子的需求情况，成为生长谱法。步骤：测定缺陷型菌株所需生长因子的类别具体测缺陷该类别物质中的哪种生长因子用单一生长因子进行复证试验。1）缺陷型类别的鉴定；2）缺陷型所需生长因子的测定。 11、用什么方法可获得大肠杆菌（E. coli）的组氨酸缺陷型？营养缺陷型菌株的筛选一般要经过：（1）诱发突变 （2）淘汰野生型菌株 （3）检出营养缺陷型 （4）鉴定营养缺陷型4个环节。将筛选得到的缺陷型菌株分别涂在不加任何氨基酸的

23、基本培养基和加有组氨酸的基本培养基上，过夜培养一段时间后观察，若前者不长后者长出菌落，即为组氨酸缺陷型。12、试述筛选营养缺陷型菌株的方法，并说明营养缺陷型菌株在应用上的作用。 （1）诱发突变 （2）淘汰野生型菌株 抗生素法 菌丝过滤法 原理：野生型在基本培养基上发 育成菌丝，不能 通过滤膜；营养 缺陷型孢子可通过滤膜，野生型 菌丝不能通过：高温杀菌法（3）检出营养缺陷型 点植对照法影印法夹层法限量补充培养法（4）鉴定营养缺陷型 作用：1、可作为标记菌种；2、利用缺陷型可以获得某些代谢的中间产物，因此在生产上可作为生产菌种，氨基酸、核苷酸等；3、作为氨基酸、维生素、碱基的测定菌株；4、营养缺陷

24、型在杂交育种中是不可缺少的工具；5、可以用来研究生物合成途径。13、 在营养缺陷型突变株的筛选过程中，淘汰野生型的目的是什么？并写出3中主要方法及其原理。 目的是：使缺陷型菌株得以富集，以利于检出；1）抗生素法：野生型能在MM中生长，而缺陷型不能，于是将诱变处理液在MM中培养短时让野生型生长，处于活化阶段，而缺陷型无法生长，仍处于休眠状态。由于细菌或酵母对一些抗生素敏感，于是就相应加入一定量的抗生素，结果活化状态的野生型就被杀死，保存了缺陷型。一般细菌可以采用青霉素，酵母可采用制霉菌素。2）菌丝过滤法：适用于丝状菌（放线菌、霉菌）。原理：野生型在基本培养基上发 育成菌丝，不能 通过滤膜；营养

25、缺陷型孢子可通过滤膜，野生型 菌丝不能通过。3）差别杀菌法：基本培养基上只有野生型生长，加热杀死野生型营养体，保留营养缺陷型芽孢。 细菌80 酵母60 适用于产芽孢、孢子菌。14、 有一营养缺陷型菌株，在基本培养基上不能生长，但能在含有核酸碱水解液的培养基上能正常生长，请设计一实验方法鉴定此菌株是何种营养缺陷型。 15、诱变育种的目的？ 1、提高有效产物的产量；2、改良菌种特性，提高产品质量；3、简化工艺条件；4、开发新品种。16、 前培养和后培养的目的？ 前培养的目的：对数中后期：生长旺盛，细胞浓度高，对诱变剂敏感；同步培养物：诱变剂处理时，群体变化一致；细胞内应具有丰盛的内源性碱基：DNA

26、被诱变剂作用后所造成的损伤能快速通过复制而形成突变，可以获得较高的突变率。 后培养的目的：1、是诱变处理后发生的突变，通过DNA修复、繁殖，才能形成一个稳定突变体；2、使各种表型都有充分表达的机会，避免表型延迟现象。17、 诱变后的富集培养的目的？ 诱变后突变型菌株的数量很少，野生型菌株多，因此，要富集突变型菌株，以提高检出效率。18、诱变育种的主要程序有哪些？ 出发菌株的选择；出发菌株的纯化；单孢子悬液的制备；诱变剂及诱变剂量；诱变剂的处理方式；影响突变率的因素。19、何谓营养缺陷型？举例说明其在工业微生物菌种选育中应用 营养缺陷型（auxotroph）：经诱变产生的一些合成能力出现缺陷，而

27、必须在培养基内加入相应有机养分才能正常生长的变异菌株。如：lys - ；his - ；营养缺陷型在生产上和科学研究上用途很大。目前生产氨基酸、核苷酸的菌种都是各种类型的缺陷型。要研究代谢途径，育种技术都必须有营养缺陷型的菌株为材料。1）作为标记菌株：进行基因工程、诱变育种、 代谢过程的研究中的亲本标记；2）作为生产菌种：氨基酸、核苷酸等生产菌种；3）作为氨基酸、维生素、碱基的测定菌株。20、 在营养缺陷型突变选育中，有哪些方法用于淘汰野生型？方法及对象。 1）抗生素法：野生型能在MM中生长，而缺陷型不能，于是将诱变处理液在MM中培养短时让野生型生长，处于活化阶段，而缺陷型无法生长，仍处于休眠状

28、态。由于细菌或酵母对一些抗生素敏感，于是就相应加入一定量的抗生素，结果活化状态的野生型就被杀死，保存了缺陷型。一般细菌可以采用青霉素，酵母可采用制霉菌素。2）菌丝过滤法：适用于丝状菌（放线菌、霉菌）。原理：野生型在基本培养基上发 育成菌丝，不能 通过滤膜；营养 缺陷型孢子可通过滤膜，野生型 菌丝不能通过。3）差别杀菌法：基本培养基上只有野生型生长，加热杀死野生型营养体，保留营养缺陷型芽孢。细菌80酵母60 适用于产芽孢、孢子菌。 05 第七章 代谢控制育种1、 什么叫代谢控制育种？ 代谢调节控制育种通过特定突变型的选育，达到改变代谢通路、降低支路代谢终产物的产生或切断支路代谢途径及提高细胞膜的

29、透性，使代谢流向目的产物积累方向进行。2、 以谷氨酸棒杆菌为出发菌株，通过代谢调控育种，为什么筛选高丝氨酸突变株可以获得赖氨酸高产菌株？进一步说明营养缺陷型菌株筛选的主要步骤及其理由。 工业上选育高丝氨酸营养缺陷型（Hom-）的谷氨酸棒杆菌作为赖氨酸的发酵菌株。由于它不能合成高丝氨酸脱氢酶（HSDH），故不能合成高丝氨酸，阻断了合成Met和Thr的支路代谢，节省了原料，使天冬氨酸半醛这个中间产物全部转入Lys的合成；在补给适量高丝氨酸（或苏氨酸和甲硫氨酸）的条件下，使Met和Thr的生成有限，从而解除了Thr和Lys对天冬氨酸激酶（AK）的协同反馈抑制，使Lys得以积累；能产生大量赖氨酸。营养

30、缺陷型：野生型菌株经过人工诱变或自然突变失去合成某种营养的能力，只有在基本培养基中补充所缺乏的营养因子才能生长。筛选营养缺陷型的步骤（1）诱发突变 （2）淘汰野生型菌株 （3）检出营养缺陷型 （4）鉴定营养缺陷型一）、营养缺陷型菌株的分离和筛选一般经诱变后，再经中间培养、淘汰野生型、检出营养缺陷型、确定生长谱等。1、营养缺陷型的诱发营养缺陷型的诱变方法和诱变因子与普通诱变育种基本相同。诱变剂：凡能诱发生物基因突变，并且突变频率远远超过自发突变率的物理因子或化学物质。2、淘汰野生型在诱变后的存活菌体中营养缺陷型菌株的数量很少，一般仅占存活菌体的百分之几或千分之几，而野生型细胞却大量存在，因而要采

31、取一些措施，尽量淘汰野生型细胞，使缺陷型菌株得以富集，以利于检出。淘汰野生型菌株的方法有：抗生素法、菌丝过滤法、差别杀菌法和饥饿法等。3、营养缺陷型的检出营养缺陷型菌株的检出方法有：点植对照法、夹层平板法、限量营养法和影印接种法等。观察对比菌落生长情况。如果基本培养基上不生长或出现的形态较小的新菌落或生长缓慢的小菌落而完全培养基相应位置上生长的菌落，可能为营养缺陷型。4、营养缺陷型的鉴定（1）营养缺陷型鉴定步骤A、缺陷型类别的测定通常分别用氨基酸、维生素、核酸碱基等几种物质，培养后，观察圆滤纸片周围菌株生长情况，如出现混浊的生长圈，就可初步确定缺陷型所需的生长因子属于哪一类别，进一步复证。B、

32、缺陷型所需生长因子的测定06 第八章 工业微生物杂交育种1、 微生物基因重组的主要方式。 主要有转化、转导、接合、接合。转化：受体菌直接吸收了来自供体菌的DNA片段，通过交换整合到自己的基因组中，从而获得部分新的遗传型状的现象。转染：把噬菌体或其它病毒的DNA（或RNA）抽提出来，让它去感染感受态的宿主细胞，并进而产生正常的噬菌体或病毒的后代，这种现象称为转染。转导：通过完全缺陷或部分缺陷噬菌体的媒介，把供体细胞的DNA小片段携带到受体细胞中，通过交换与整合，使后者获得前者部分遗传形状的现象。接合：是指细菌通过细胞间的接触而导致遗传物质的转移和基因重组的过程，又称细菌杂交2、 什么叫杂交育种？

33、杂交育种的类型有哪些？ 以基因重组为理论基础，指不同种群、不同基因型个体间进行杂交，并在其杂种后代中通过选择而育成纯合品种的育种方法称为杂交育种。杂交育种通过微生物杂交将不同菌株的遗传物质进行交换、重组，使不同菌株的优良特性集中于一个重组体中。“杂交”类型：接合、准性杂交、有性杂交、原生质体融合、转化、转导3、 真菌的有性生殖与准性生殖有什么相同之处？不同之处？相同之处：都要过细胞间的结合，都涉及整个染色体组，涉及染色体的交换。不同之处：1、有性发生在特殊的囊器中，产生有性孢子，在生理形态上营养细胞都不同；准性发生在一般细胞中，重组结果产生一般的无接合型的细胞；2、有性中减数分裂导致基因重组，

34、很有规则的；准性中体细胞交换和单原化都是偶然的，无规律的；3、在有性中，是看重组频率的多少，在准性中，是看纯和频率的多少。4、 什么叫体细胞交换？其特点是什么？ 是指杂合二倍体核在有丝分裂过程中的交换现象。也就是说，杂合二倍体核在繁殖过程中，细胞分裂处在四线期时两染色体之间发生交换而产生部分标记现象。特点：离着丝粒愈近的基因纯合化的机会愈少，越远越大。而且着丝粒一端的纯合化不影响另一端基因的纯合化；可根据纯和率分析基因与着丝粒位置，间接分析图距，可用选择培养基检出纯合基因，确定纯和率，有可能在内有有性生殖的M中进行基因定位。5、什么叫单倍化过程？和减数分裂区别？ 是指杂合二倍体细胞在增殖过程中

35、，基因借助整条染色体的随机交换而得到单倍体重组体或单倍的亲本分离子。单倍体化细胞内的染色体是单倍的，杂合二倍体中的两直接亲本的染色体遗传到单倍分离子时是随机的，只有二分之一的重组机会。区别：1、在减数分裂中，几乎每一染色体都发生一次交换：在单元化中，体细胞交换是偶然的，2、减数中，每一染色体同时减为半数；在单元化中，只是个别染色体变为一个；3、单元化可使隐性性状得以表现，产生分离，又因为体细胞交换与单元化很少同时发生，当某一染色体单元化后，某一隐性基因表现，在其之上的其他隐性基因也同时表现，分离，因此可断定一基因所属的连锁群。6、何谓基因重组？原核微生物和真核微生物各有哪些基因重组形式？ 把两

36、个不同性状个体内的遗传基因转移到一起，经遗传分子的重新组合后，形成新的遗传型个体的方式，称为基因重组；在原核微生物中，可通过转化、转导、接合的方式进行基因重组。在真核微生物中，基因重组主要有有性杂交、准性杂交、原生质体融合。7、简述真菌的准性生殖过程，并说明其意义。 菌丝连结形成异核体核融合形成杂合二倍体体细胞交换和单倍体化意义：半知菌中基因重组的主要方式，为一些没有有性过程但有重要生产价值的半知菌的育种工作提供了重要手段。07 第九章 原生质体育种和原生质体融合育种1、 何谓原生质体、原生质体融合育种技术？ 细胞壁被酶水解剥离，剩下由原生质膜包围着的原生质部分成为原生质体。原生质体融合育种技

37、术是用水解酶除去遗传物质转移的最大障碍细胞壁，制成由原生质膜包被的裸细胞，然后用物理、化学或生物学方法，诱导遗传特性不同的两亲本原生质体融合，经染色体交换、重组而达到杂交的目的，经筛选获得集双亲优良性状于一体的稳定融合子。2、 各类微生物原生质体如何制备？活性原生质体制备过程：原生质体的分离、收集、纯化、活性鉴定和保存等操作步骤。细胞去壁与原生质体分离：细胞去壁后，原生质体从中释放出来的过程为原 生质体分离。去壁的方法有三种：机械法、非酶分离法和酶法，其中最有效、最常用的是酶法。酶法分离原生质体的主要步骤。1. 酶法分离原生质体的影响因素(1) 培养基组成(2) 菌体培养方式(3) 菌体菌龄(

38、4) 稳定剂：高渗溶液(5) 酶解前的预处理：Triton-100、EDTA(6) 酶系和酶的浓度：细菌溶菌酶 真菌蜗牛酶(7) 酶的作用温度和作用pH值(8) 菌体密度(9) 酶解方式2. 原生质体的鉴定（分离程度）(1) 低渗爆破法(2) 荧光染色法（红光）3. 原生质体的收集和纯化(1) 过滤法(2) 密度梯度离心法(3) 界面法(4) 漂浮法4. 原生质体的活力鉴定(1) 荧光素双醋酸盐染色法（有荧光）(2) 酚藏花红染色法（红色）(3) 伊文思蓝染色法（无色）5. 原生质体的保存：低温、液氮、DMS3、原生质体融合的优势？ 1. 大幅度提高亲本之间重组频率（10-1）2. 扩大重组的

39、亲本范围（远缘间产生融合子）3. 原生质体融合时亲本整套染色体参与交换，遗传物质转移和重组性状较多，集中双亲本优良性状的机会更大。4、 试述原生质体融合育种的特点及步骤原生质体融合育种技术是用水解酶除去遗传物质转移的最大障碍细胞壁，制成由原生质膜包被的裸细胞，然后用物理、化学或生物学方法，诱导遗传特性不同的两亲本原生质体融合，经染色体交换、重组而达到杂交的目的，经筛选获得集双亲优良性状于一体的稳定融合子。特点：1. 大幅度提高亲本之间重组频率（10-1）2. 扩大重组的亲本范围（远缘间产生融合子）3. 原生质体融合时亲本整套染色体参与交换，遗传物质转移和重组性状较多，集中双亲本优良性状的机会更

40、大。步骤：直接亲本及其遗传标记选择；双亲本原生质体制备与再生，活性原生质体制备过程：原生质体的分离、收集、纯化、活性鉴定和保存等操作步骤；亲本原生质体诱导融合；融合重组体分离，融合体再生包括：融合体细胞壁合成、重建和融合体的再生，具体过程与一般原生质体再生相同；遗传特性分析与测定。5、 原生质体的制备是原生质体融合育种的前提和基础。为了使细菌细胞易于原生质体化，控制菌体的培养时间很重要。一般来说，芽孢杆菌采用对数生长期的后期比较好，而对于放线菌，可采用对数生长期到稳定期之间的转换型的菌体最为适当。请设计一个实验，如何确定某种细菌在培养过程中处于什么生长阶段？从接种开始每隔一个小时取一次样，记录

41、相应的OD值，以培养时间为横坐标，OD值为纵坐标，并在坐标纸上标出相应的位置。建议：测OD值至少三次，然后取平均值，这样的话比较准确。（优点：取样的间隔时间比较短，画出的曲线也比较准确。缺点：容易造成污染）然后你就会发现在你的坐标值上，每个点连接上，就会是一条漂亮的生长曲线。也就很容易找到你所要的时期。08 第十一章 基因工程育种1、 简述微生物基因工程育种时，目的基因的获得途径。选择适宜的给体细胞,从中采集分离有生产意义的目的基因;通过反转录酶的作用由mRNA合成cDNA(互补DNA);用化学方法合成特定功能的基因（PCR体外扩增目的基因）。2、 何为基因工程？简述微生物基因工程育种的主要操

42、作步骤？也叫基因操作、遗传工程，或重组体DNA技术。一般说来所谓的基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，并使之参入到原先没有这类分子的寄主细胞中内，而能持续稳定的繁殖。 步骤：1、目的基因的获得；2、载体的选择与准备；3、目的基因与载体连接成重组DNA；4、重组体的筛选； 3、 基因工程中常用的柯斯质粒载体有哪些主要特点？是一类用于克隆大片段DNA的载体，它是由噬菌体的cos末端及质粒重组而成的载体。具有噬菌体的特性；具有质粒载体的特性；具有较高容量的克隆能力；具有与同源性序列的质粒进行重组的能力。09 第十四章 工业微生物菌种复壮与保藏1、 简述菌种

43、保藏的基本原理。是抑制菌种的代谢活动，使之停止繁殖，处于休眠状态。为此，保藏要在绝氧、干燥、低温等条件下，若是斜面保存，要求培养基营养成分较贫乏。2、 常用的工业微生物菌种保藏技术有哪些？1）斜面保藏法2）冷冻干燥保藏法3）超低温冷冻保藏法4）液氮超低温保藏法5）沙土管保藏法6）干燥保藏法7）液体石蜡油保藏法3、何谓菌种退化？试述其表现、原因、防治方法如何？主要是指生产菌种或选育过程中筛选出来的较优良菌株，由于进行移接传代或保藏之后，群体中某些生理特征和形态特征逐渐减退或完全丧失的现象。集中表现在：目的代谢产物合成能力降低，产量下降，有的是发酵力和糖化力降低。以生长代谢来说，孢子数量减少或变得

44、更多，部分菌落变小或变得更大、生长能力更弱、生长速度变慢，或者恰好相反。原因：基因突变，基因突变导致菌种退化、质粒脱落导致菌种退化；连续移代；培养和保藏条件的影响。防治方法：尽量减少传代；菌种经常纯化；创造良好的培养条件；用单核细胞移植传代；采用有效的菌种保藏方法。4、 何谓菌种复壮？如何进行？狭义的复壮：是一种消极措施，指在菌种已发生退化的情况下，通过纯化分离和测定生产性能等方法，从退化的群体中找出少数尚未衰退的个体，进一步繁殖，以达到恢复该菌种原有典型性状的一种措施；广义的复壮：是一项积极措施，即在菌种的生产性能尚未退化前就经常有意识地进行纯种分离与生产性能的测定工作，以保持菌种稳定的生产

45、性状，甚至使其逐步有所提高。5、你学完微生物遗传育种这门课程后有何收获？对该门课程的教学有哪些建议？ 首先是掌握了大量理论知识，从菌种的选育技术到其遗传学机理，老师介绍了很多学科发展的前沿，激发了我们的学习兴趣，拓宽了知识面。 其次是注重思维训练。老师在课堂讲授理论的时候，教我们从哪里分析入手，如何分析，使我们养成了一种成熟和严密的思维方法和习惯，这对我今后的学习是非常有帮助的。 在教学中，老师非常注重学习方法的培养，注重运用理论知识解决实际问题能力的培养，使我们学习的思路更加开阔，遇到问题能够从多角度、多方向加以思考并解决，这对我们以后的成长很有帮助。老师课上认真讲授，实验课上耐心辅导。理论课易懂好学，实验课与生产实际结合，实验室课余对学生开放让学生自由训练，特别是中国高校工业微生物资源平台等与本课程密切相关的学校各类科研平台，在课程期间积极为我们本科生科研与创新活动提供机会，同学们对这门课程都表现出了极大的兴趣。 最后，也是我印象最为深刻的一点，是老师在传授知识的同时，结合课程教学，对我们人文情怀的培养。老师在实验细节的提醒中所体现出来的对学生的人文关怀让我感动，老师在课堂教学中所展示出的人文底蕴让我钦佩。他们在传授知识的同时，让我们明白了很多做人和做学问的道理，将让我们终生受益。第 10 页 共 10 页