离心沉降分离原理

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1、離心沉降分離原理A、概述利用微生物、動物、或植物細胞生產有機酸、胺基酸、抗生素、特化品、酵素、甚或藥用蛋白質已經是相當成熟的生物技術。不管生產細胞的取得是經由篩選、突變、原生質融合或是基因工程，在量產時通常要給與適當的培養基及培養環境，提高細胞數量並誘導生成產物。產物生成的模式不外乎三類：(1)分泌於細胞体外醱酵液；(2)溶於細胞体內；(3)不溶性胞內包涵體 (inclusion body) 。下表為各種生技產品及其生產菌株表現產物的模式：第(1) 類產物：分泌於細胞体外醱酵液；有機酸產物如檸檬酸、乳酸，胺基酸產物(如味精、離胺酸，抗生素產物如青黴素、紅黴素) ，酵素產物(如糖化酵素、蛋白質分

2、解酵素等)。動物細胞表現藥用蛋白質產品如Erythropoietin則屬第(1) 類模式產物。第(2)類產物：溶於細胞体內；一些分子量較大的生化物質如阿巴汀(avermectin)、勃激素 (gibberellin) 、過氧化氫觸媒酵素 (catalase)等。將外來的基因轉殖於宿主微生物表現時，其蛋白質產物無法排出體外，如r-DNA 酵母菌 B型肝炎表面抗原(Hepatitis B surface antigen, HBsAg) ，亦屬於第 (2)類產物。第(3)類產物：不溶性 胞內包涵體 ；常見於採用基因工程改造的微生物表現高等動物蛋白質的情況。轉殖於宿主微生物的 結構基因 (struct

3、ure gene)，被強力的 啟動子 (promoter) 推動而在短時間大量表現蛋白質產物，造成在胞內形成不溶性胞內包涵體 ，如 r-DNA 大腸桿菌的胰島素等。產物生產菌株產物特性表現模式分離策略味精， MSGBrevibacterium胞外，溶於(1)去除菌体divaricatumbroth之胺基酸小分子檸檬酸Aspergillus胞外，溶於(1)去除菌体nigerbroth之有機酸小分子青黴素Penicillium胞外，溶於(1)去除菌体chrysogenumbroth之抗生素分子糖化或蛋白質Aspergillus胞外，溶於(1)去除菌体分解酵素nigerbroth之酵素大分子阿巴汀S

4、treptomyces胞內之二次代(2)取得菌体以利(avermectin)avermitilis謝分子溶劑萃取過氧化氫觸媒Bacillus subtilis 胞內之酵素大酵素 (catalase)分子r-DNA HbsAgr-DNA胞內之蛋白質Saccharomyces大分子cerevisiaer-DNA Insulinr-DNA胞內之蛋白質Escherichia coli大分子內涵體(inclusionbody)r-DNAr-DNA CHO胞外之蛋白質大Erythropoietincell分子(2) 濃縮及清洗菌体以利細菌破碎釋出酵素(2) 濃縮及清洗菌体以利細菌破碎釋出 HbsAg(3)

5、 濃縮及清洗菌体以利細菌破碎釋出 inclusion body(1) 除去動物細胞下游產品回收的工程包括 : 菌体分離、細胞破碎及去除、粗分離、純化及製劑配方等步驟。 將細胞菌体回收或去除端看產物的生成模式 ，如青黴素或蛋白質分解酵素，必須除菌取得胞外液；如阿巴汀，必須取菌体後，再行萃取工作；如表現 HBsAg 的r-DNA 酵母菌醱酵液，因為 HBsAg 生產於酵母菌胞內，在打破細胞釋出產品前，醱酵液中仍含相當多之雜蛋白質宜先行移除，所以必須取菌濃縮及清洗，再行打破。細胞菌体之分離回收方法甚多，但可以量產規模實施，連續及自動化操作的有下列幾種程序 : 一般過濾、膜過濾、離心沉降、及離心過濾等

6、。本實驗僅就離心沉降做簡單的介紹。B、離心沉降的原理( principle of centrifugal sedimentation)(1) 離心機介紹沉降 (sedimentation)乃是利用菌體密度大於醱酵液密度而會沉降於底層的特性來分離菌體。但由於微生物菌体顆粒很小，沉降非常慢，故要提供離心場，來加速沉降速度，稱為 離心沉降 (centrifugal sedimentation)，亦即離心沉降 是利用離心力及物質密度不同的一項分離技術。 一般常用的 批次離心機 (或瓶式離心機 ，batch centrifuge)為分析及樣品製備用途，但當規模大於150公升時批次離心機 已不適合使用，因

7、此一定要以 連續離心 (continuous centrifugation)的設計，方能放大使用。如下圖，常見之工業用 連續離心機 有 (a) 管碗式高速離心機 (tubular bowl centrifuge) ；(b)固体停留盤式離心機 (solid-retaining type disk centrifuge) ；(c)間斷式排渣盤式離心機 (intermittent ejection type disk centrifuge) ；(d)噴嘴式盤式離心機 (nozzle type disk centrifuge)及(e)螺旋式離心機 (screw type decanter)。以下說明：

8、(b)、 (c)、 (d)皆為盤式設計，在離心室內安裝重疊之盤狀片以提供大量的沉降面積。盤與盤之間有管道供醱酵液由下往上流動，其間距僅若干 mm或更低，期望如此短之沉降距離，使菌體能在離心室內短暫之滯留時間內被離心抓下來。(b)為固体停留式，被離心下來之菌体在內壁上累積並不排出，直到充滿整個固体存放空間後，就必須停機清台(屬於半連續式 )，一般用於醱酵液中菌量小於0.11%時。 (c)為間斷排渣式，此機有特別之機械設計，當菌体在整個固体存放空間累積到相當量時，可以自動地將被離心之菌体摔出，達清除作用，適用於於醱酵液中菌量 110%時。(d)為噴嘴式，在離心室周圍開有適當之噴嘴，菌体離心到壁上會

9、不斷由噴嘴排出 (屬於完全連續操作之機型 )，適用於更高菌量的情況；工業上最常見以噴嘴式盤式離心機來濃縮及清洗酵母菌。(e)為螺旋式設計，主要是針對更高固体含量的情形，但離心力比較不足，但是離心後之濃稠固体可經由螺旋的轉動將被離心之菌体擠出機外 。此螺旋式設計能有效地用來分離抗生素 整槽萃取 (whole broth extraction)液中之有機相、水相及固相。(a)為管碗式設計，屬於極高速離心機，可高達 40,000倍重力，頗適合針對不易離心的細菌類之分離。此因 (b)(e)機種的離心力多小於 10,000倍重力，分離能力比較不足。對大腸桿菌、枯草桿菌、假單胞菌、乳酸菌等不易離心之細菌是

10、很好的選擇。唯本機型亦屬半連續型，處理菌量高之醱酵液時，離心次數多，比較不方便。不過現亦有自動刮渣的機型上市。批次離心機 (或瓶式離心機 )是實驗室常用的離心機型 。如果 批次離心機 (或瓶式離心機 )具超強之離心力，則可應用於 超離心技術 (微分離心技術 )，亦即將混合物中各組成份分離，已成功應用於細胞內所含胞器如粒線體、微粒體、溶酶體等之分離，或各種蛋白質及各種核酸之分離， 超離心技術 是研究遺傳工程學、酶工程學必須的基礎。本實驗除介紹 離心沉降 原理外，並設計一簡單的 批次離心實驗，以了解某些變數對離心沉降效果的影響，並從實驗之數據來評估設備之選擇及操作條件之擬定。(2) 離心沉降原理：

11、當粒子在流體 (牛頓流體 )中沉降時，會同時受到向下的重力 (Fg)、向上的浮力 (Fb)與黏滯力 (Fd )的作用，若三力達力平衡時 (Fg = Fb + Fd)，則沉降速率即達到終端沉降速度 (ut)2(p-f) dp(Stokes Law)(1)u = gt18 ut： 重力場下菌体的 終端沉降速度 (sedimentation velocity， m/sec)。p：粒子的密度。f：流體的密度。dp：粒子的粒徑。：流體的黏度。2如果粒子在離心力場中沉降，則將重力加速度g 換成離心加速度2r，則(p-f) dp2t2(2)u = r18 (p-f) dp22r，即粒子的tp fp= fu與

12、 r、(-)、d 、等有關。18 ：角速度 = 2 N/60，( 單位： rad/s)。N為旋轉速度 (單位 rpm)。r：粒子距轉軸心的距離。(常速離心 fr 3000 g，中速離心 fr = 300050000 g，高速離心 fr 50000 g，超高速離心 f r =20000 200000 g， g為重力加速度 )定義：離心力強度22fr = r/g ，亦即離心加速度 r 表示成多少個 g。(設定離心力強度 時可設定轉速為幾個rpm，或改設為幾個g )如果粒子在離心力場中作直線運動，則(p-f) dp2t2，積分u = dr/dt = r18 18 )(3) t = ln(r /r2212(p-f) dpt：沉降時間r1：旋轉軸心至離心管液面之距離r2：旋轉軸心至粒子層之距離* 各種工業用 連續離心機 之衍生公式可參考生化分離的相關書籍！