合生素对肉仔鸡肠道微生物区系的影响效应研究

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1、合生素对肉仔鸡肠道微生物区系的影响效应研究杨会玲1，许尧兴2，周利勇1，高玉鹏基金项目：浙江省重大科技攻关资助项目（2008C12052）；浙江省农业科学院创新提升工程（2010R17Y01D01）联系方式：杨会玲，Tel：15091765887；E-mail： yhl200704。通信作者高玉鹏，Tel：13325384321；E-mail：gaoyupeng112（1 西北农林科技大学动物科技学院，陕西杨凌 712100；2浙江省农科院植物保护与微生物研究所，浙江杭州 310021）摘要：【目的】研究合生素对肉仔鸡盲肠微生物区系的影响。【方法】选择1日龄肉仔鸡450只，随机分成5个日粮处理

2、，分别为基础日粮、基础日粮+抗生素、基础日粮+益生素、基础日粮+益生元、基础日粮+合生素。每处理3个重复，每个重复30只。在21d、42d每个重复选择4只屠宰，无菌采集盲肠内容物，提取细菌基因组总DNA，PCR扩增16s rDNA，用DGGE方法分析盲肠细菌群落结构的变化，用实时荧光定量PCR检测肠道中总菌、乳酸杆菌、双歧杆菌和大肠杆菌数量。【结果】在21、42日龄，日粮添加合生素比单独应用益生素、益生元或抗生素提高了肉仔鸡的平均日增重和饲料转化率（P0.05），肉仔鸡盲肠DGGE条带数（菌群丰富程度）均高于对照组、抗生素组、益生素组、益生元组；基因测序分析发现肉仔鸡盲肠中特异条带主要是不可培

3、养细菌。合生素能促进盲肠总菌数、双歧杆菌和乳酸杆菌的增殖，抑制大肠杆菌数量。【结论】合生素对肉仔鸡促生长的效用与其对盲肠菌群的调控作用有关，且合生素的效果优于益生素、益生元或抗生素。关键词：合生素；肉仔鸡；肠道菌群；DGGE；qPCREffects of Dietary synbiotics on intestinal microbial ecology in broiler chickensYang Hui-ling1, Xu Yao-xing2, Zhou Li-yong1, Gao Yu-peng1(1College of Animal Science, Northwest A&F un

4、iversity, Yangling, Shaanxi 712100; 2Institute of Plant Protection and Microbiology, Zhejiang Academy of Agricultural Science, Hangzhou, Zhejiang 310021)Abstract:【Objective】This study was carried out to investigate the effects of dietary supple- mentation of synbiotics on intestinal microbial flora

5、ecology in broilers.【Method】Four hundred and fifty 1-d-old “Cobb 48” broiler chicks were randomly assigned to 1 to 5 dietary treatments , each treatments allocated to 3 replicates of 30 broilers. The dietary treatments were 1) control, 2) basal diets supplemented with antibiotics, 3) basal diets sup

6、plemented with probiotics, 4) basal diets supplemented with prebiotics, 5) basal diets supplemented with synbiotics. On d 21, 42, four birds from each replicate were randomly selected and killed, cecal contents were aseptically collected, extraction the total genomic DNA, then analyzing the intestin

7、al bacterial community by denaturing gradient gel electrophoresis(DGGE) analysis of universal 16S rDNA after amplication with PCR, detecting the populations of tobal bacteria, Lactobacillus, Bifidobacterium and E.Coil by real-time PCR.【Result】On d 21 and 42, The supplementation of synbiotics increas

8、ed average daily gain and feed conversion ratio, compared with prebiotics, probiotics or antibiotics alone (P0.05), and the number of PCR-denaturing gradient gel electrophoresis bands of synbiotics-fed group was higher than those in the control, antibiotics, probiotics and prebiotics groups.Gene seq

9、uences analysis indicated that the specific bands were mainly uncultured bacteria in cecum of broilers. Dietary synbiotics increased the populations of total bacteria, Lactobacillus, Bifidobacterium and E.Coil.【Conclusion】The effects of synbiotics on growth performance was consistent with that on in

10、testinal microbial ecology, and the effects of synbiotics is better than probiotics, prebiotics or antibiotics alone.Key words: synbiotics, broiler, intestinal microflora,denaturing gradient gel electrophoresis, real-time PCR0 引言【研究意义】菌群对家禽的生长和健康具有重要作用。肠道内有益菌群不仅能有助动物消化功能，而且能合成多种维生素，对病原菌有拮抗作用，还可分泌许多免

11、疫物质，促进动物免疫功能。日粮因素可影响胃肠道不同部位的微生物菌群组成1,2。合生素是由益生素和益生元组合而成，能同时发挥两者的协同作用，促进动物健康，提高生产性能3。【前人研究进展】肠道微生物是动物消化系统的一个组成部分，其种类和数量随着动物年龄和日粮类型的差异而不同4，许多研究表明，家禽盲肠中的微生物种类较其它消化道丰富。但迄今为止，关于合生素对家禽肠道微生物区系的影响，主要是利用传统培养基法对菌群数量的检测，鲜有利用分子生物学技术对肠道微生物群落结构及多样性的研究。更何况动物肠道微生物种类多数是不可培养的，基于16S rRNA的变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE）技术则克服了这种缺陷5。

12、PCRDGGE的基本原理是长度相同而碱基组成不同的DNA序列在不同变性条件下（如尿素和甲酰胺浓度）变性，在变性梯度凝胶电泳上特定位置形成特定泳带，不同泳带代表不同的微生物种类，从而反应肠道微生物的结构和多样性6，关于此类研究近年来较多7,8,9。但是，由于PCRDGGE技术只能检测到占整个菌落细菌数量约1%或以上的类群10，即细菌数量要大于108 CFU/g11，因此需要其他方法来检测微量细菌的数量。实时荧光定量PCR（Real-time fluorescent quantitative PCR，FQ-PCR，qPCR），是一种在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光集团，利用反应过程中荧光信号的

13、累积实时监测整个PCR过程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法12。qPCR可以检测到粪便中低至101102拷贝数的细菌的16S rRNA13，具有操作简便、高敏感性和特异性而被用于动物肠道菌群定量检测。关于日粮中添加合生素饲喂肉仔鸡的效果已有报道14,15,16，【本研究切入点】但未见对由枯草芽孢杆菌、低聚木糖及低聚甘露糖复合制成的合生素的试验研究。【拟解决的关键问题】本试验在肉仔鸡基础日粮中分别加入由枯草芽孢杆菌、低聚木糖和低聚甘露糖复合制成的合生素，并将其与日粮中单独使用抗生素、益生素、益生元进行比较，利用PCRDGGE和qPCR技术探讨其对肉仔鸡肠道微生物区系结构的影响。1

14、材料和方法选择450只1日龄健康的“科宝48”肉仔鸡，随机分成5个处理组，每组3个重复，每个重复30只。试鸡在密闭控温鸡舍的小群体肉鸡专用笼饲养，自由采食和饮水，育雏期13d舍温33，以后每周降3至室温保持在22左右。试鸡免疫程序：3、10日龄分别进行新城疫疫苗点眼免疫，28日龄饮水免疫；14、22日龄分别进行法氏囊饮水免疫。常规饲养管理。试验基础日粮与营养水平见表1。表1 基础日粮组成及营养水平Table1 Composition (%)of the basal experimental diet and nutrient level成分Compositon 021日龄Starter die

15、t2242日龄Growth diets玉米 Corn (%)6165豆粕 Soybean meal (%) 31.628.6鱼粉 Fish meal (%)43磷酸氢钙Calcium monophosphate (%)1.11.1石粉 Stone power (%)0.90.9食盐 Salt (%)0.30.3氯化胆碱 Chline chloride (%)0.10.1预混料 Premix (%)11营养水平 Nutrient level代谢能 ME (MJkg-1)11.8011.92粗蛋白 CP (%)20.8219.25钙 Ca (%)0.860.77有效磷 Available phos

16、phorus0.470.44蛋氨酸 Methionine (%)0.470.39赖氨酸 Lysine (%)1.131.01半胱氨酸 Cysteine (%)0.340.32苏氨酸 Threonine (%)0.880.81注：1）、日粮营养成分：ME为计算值，其他为测定值。2）、预混料为每kg饲料提供：锰70 mg，锌50 mg，铁90 mg，铜8 mg，碘0.45 mg，硒0.20 mg，维生素A14 000 IU，维生素D3 2800 IU，维生素E 23.80 IU，维生素K 1.96mg，维生素B1 2.24mg，维生素B2 8.40mg，维生素B6 4.75 mg，泛酸10.10m

17、g，烟酸1.12 mg，生物素0.046 mg，维生素B120.056 mg，胆碱1100 mg。Notes: 1) Diets nutrient composition: ME value was calculated, the others values were measured. 2) Premix contained the following per kg diets: manganese,70 mg; zinc, 50 mg; iron, 90 mg; copper, 8 mg; selenium, 0.20 mg; vitamin A, 14,000 IU; vitamin D

18、3, 2,800 IU; vitamin K, 1.96 mg; vitamin B1, 2.24 mg; vitamin B2, 8.40 mg; vitamin B6, 4.75 mg; vitamin B12, 0.056 mg; pantothenic acid, 10.10 mg; nicotinic acid, 1.12 mg; biotin, 0.046 mg; choline, 1,100 mg.1.2 试验设计益生素：成分为枯草芽孢杆菌（活性4.0108cfu/g） ；益生元为低聚木糖和低聚甘露糖；合生素：主要成分为枯草芽孢杆菌（活性4.0108cfu/g）、低聚木糖和低聚甘

19、露糖。均为浙江省农科院微生物所提供。试验设计方案见表2。表2试验设计方案Table2 Design of experimental protocol处理Treament试验设计Experimental design日粮组成Diets composition对照组Control基础日粮Basal diets抗生素组Antibiotics基础日粮+抗生素（黄霉素4mg/kg）Basal diets+ Antibiotics(Xanthomycin 4mg/kg)益生素组Probiotics基础日粮+枯草芽孢杆菌0.1%Basal diets+ Bcillus subtilis 0.1%益生元组Pr

20、ebiotics基础日粮+低聚木糖0.015%+低聚甘露糖0.1%Basal diets+ Xylooligoscaharide0.015%+ Mannanoligosccharide 0.1%合生素组Synbiotics基础日粮+枯草芽孢杆菌0.1%+低聚木糖0.015%+低聚甘露糖0.1%Basal diets+ Bcillus subtilis 0.1% Basal diets+ Xylooligoscaharide 0.015%+ Mannanoligosccharide 0.1%1.3 测定指标及其方法1.3.1 生产性能指标记录与测定 试期内每天以重复为单位记录试鸡采食量，计算平均

21、日增重、日采食量和饲料转化率，记录鸡只死亡数并剖检检查； 分别在鸡第21日龄、42日龄早空腹，以重复为单位进行称重；1.3.2 肠道样品的采集 分别在21、42日龄屠宰试鸡，每重复随机选取4只（公母各半），禁食12h后颈静脉放血屠宰，无菌操作，分离盲肠，将盲肠内容物迅速放入无菌的离心管中，液氮速冻，-80冰箱保存，备用。1.3.3 肠道内容物总DNA的提取 将同一处理组的12个样品混合均匀，采用德国QIAGEN公司的QIAamp DNA Stool Mini Kit试剂盒提取肠道内容物总DNA，操作步骤按照产品说明书进行。提取的DNA通过微量核酸测定仪（NANO DROP 2000）测定DNA

22、浓度，置-20保存备用。1.3.4 PCR-DGGE 将提取的肠道内容物总DNA作为PCR反应模板，采用对大多数细菌16S rRNA基因V3区具有特异性的引物（341-517）设计合成引物27：GC-341F（5- CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GCC TAC GGG AGG CAG CAG-3）和517R（5-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3）。PCR反应程序：94预变性4 min；94变性1min，55退火45 s，72延伸45s，30个循环，最后72延伸10 min。PCR反应体系为50L，上下游引

23、物各1L，10x缓冲液5L，dNTP混合物4L，TaqDNA聚合酶0.5L，加水至50L。PCR扩增产物采用Bio-Rad Dcode进行DGGE凝胶电泳，凝胶浓度为40-60%。电泳条件为：先在40V下电泳1h，然后80V电泳10-12小时。电泳结束后，从玻璃板上取下凝胶，在EB染液中染色25 min后用TANON2500凝胶成像系统采集图像。将DGGE图谱上的差异条带和共性条带分别割胶回收后浸泡在50LTE buffer中4过夜。取5L为模板再次扩增16S rDNA V3区，扩增产物做DGGE确认回收条带PCR产物的正确性。将正确的胶回收条带进行纯化后，将产物连接在Promega T ea

24、sy Vector载体上4下过夜，然后转化，挑选阳性克隆进行测序。将测序结果登陆GenBank运用Blast进行分析。1.3.5 实时荧光定量PCR（FQ-PCR）反应总菌、乳酸杆菌、双歧杆菌、大肠杆菌的特异性引物分别参照Denman18、Walter19、Satokari20、Huijsdens21的方法，其上下游序列见表3，引物对由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。表3 总菌、乳酸杆菌、双歧杆菌、大肠杆菌特异性引物Table 3 The specific primer for total bacteria, lactobacillus, bifidbacterium and E.Coi

25、l项目Items引物Primer引物序列(5-3)Primer sequence(5-3)扩增长度（bp）Amplicon size(bp)总菌 Total bacteria1114-fCGGCAACGACGCAACCC1471275-rCCATTGTAGCACGTGTGTAGCC乳酸杆菌LactobacillusLac1-fGCAGCAGTAGGGAATCTTCCA347Lac2-rGCATTYCACCGCTACACATG双歧杆菌BifidobacteriumBif164fGGGTGGTAATGCCGGATG511Bif662rCCACCGTTACACCGGGAA大肠杆菌E.CoilE.Co

26、il-fCATGCCGCGTGTATGAAGAA96E.Coil-rCGGGTAACGTCAATGAGCAAA参照Taverniers22,23的方法制备FQ-PCR所检测菌的标准模板，采用能作为特异性引物模板的DNA序列与克隆载体相连，获得重组质粒，以重组质粒模拟菌群基因组DNA作为标准品。FQ-PCR反应体系为20L：SYBR Green QPCR Mix（TOYOBO）10L，上下游引物各0.4L，DNA模板5L，加水至20L。所检测菌FQ-PCR反应条件如下：总菌反应条件：94预变性4 min；94变性30s，66退火30 s，72延伸1min，35个循环，最后72延伸5 min。乳酸

27、菌反应条件：94预变性4 min；94变性45s，64退火45 s，72延伸1min，35个循环，最后72延伸5 min。双歧杆菌反应条件：94预变性4 min；94变性45s，62退火45 s，72延伸1min，35个循环，最后72延伸5min。大肠杆菌反应：94预变性4 min；94变性45s，59退火45 s，72延伸1min，35个循环，最后72延伸5 min。所有荧光定量PCR反应在ABI 7500 Real-time PCR System（ABI）上进行。1.4 数据分析DGGE图谱用Quantity One软件进行分析，用Dice法计算相似性指数CS，用MEGA 4.1软件构建系

28、统发育树，进行聚类分析FQ-OPCR检测数据采用SPSS13.0中的单因素方差分析（ONE-WAY ANVOA）进行统计分析，均值采用Duncan法进行多重比较。2 结果2.1 日粮添加合生素对肉仔鸡生长性能的影响表4日粮添加合生素对肉仔鸡生产性能的影响Table 4 Effect of supplemental synbiotics in broiler diets on growth performance项目Item对照组Control抗生素组Antibiotics益生素组Probiotics益生元组Prebiotics合生素组Synbiotics121d日采食量(g/只.d)Daily

29、 feed intake37.080.82 a40.780.32b40.370.19b40.210.93b41.700.57b日增重(g/只.d)Daily weight gain20.651.73 a25.261.75b26.551.35 b26.221.05 b26.151.71b料肉比Feed conversion ratio1.920.04 b1.610.02a1.520.04a1.530.06a1.590.02a2242d日采食量(g/只.d)Daily feed intake149.592.65a 154.701.54 b151.151.15 ab152.701.46 ab156.

30、452.10 b日增重(g/只.d)Daily weight gain73.481.09a 76.170.81 b75.350.98b75.921.25b84.331.39c料肉比Feed conversion ratio2.040.02b 2.030.01b2.010.01b 2.000.01 b1.860.01a142d日采食量(g/只.d)Daily feed intake93.341.03 a97.581.04b96.510.75b96.531.08b99.080.84b日增重(g/只.d)Daily weight gain46.390.29 a50.720.52b50.950.35

31、b50.750.30 b55.240.57c料肉比Feed conversion ratio2.010.02 c1.920.02 b1.890.01 b1.900.03b1.790.01a注：同行数据肩注字母不同者表示差异显著（P0.05）。从表3可看出，日粮添加合生素后，肉仔鸡分别在121d、2242d及142d与其他组相比，1）、平均日增重：与对照组和抗生素组比较均有显著提高（P0.05）；与益生素组和益生元组相比，肉仔鸡在2242d、142d时均有显著提高（P0.05）；2）料重比：与对照组鸡相比均显著降低（P0.05）、8.37%和6.77%（P0.05）；与益生素和益生元组相比，肉仔

32、鸡在 2242d，142d饲养期显著降低（P0.05）。3）、合生素对肉仔鸡生长性能的影响效应生长后期（22-42d）大于生长前期。2.2 日粮添加合生素对肉仔鸡肠道微生物菌群多样性的影响 Con-21 Ant-21 Pro-21 Pre-21 Syn-21 Con-42 Ant-42 Pro-42 Pre-42 Syn-42图1 不同处理组肉仔鸡21d、42d盲肠内容物DGGE图谱（注：图谱中数字为切胶编号）Fig.1 Polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis profiles generated fr

33、om chicken cecal contents图2 各个处理组肉仔鸡盲肠内容物在不同时期PCR-DGGE图谱条带数Fig.2 Number of polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis bands from cecal contents将PCR-DGGE图谱（图1），使用Quantity One软件分析该图谱的条带数并绘制柱状图（图2）分析表明：DGGE谱图（图-1、图-2）共回收了23个条带，分析这些条带中可以看出，在21d、42d，日粮中添加合生素后，与对照组、抗生素组、益生元组相比其条带数较多

34、。合生素组在21d、42d的DGGE图谱上条带分别为27和32条，均高于其他处理组。说明日粮添加合生素可以增加肉仔鸡肠道微生物多样性，且肉仔鸡在42d的多样性高于21d。分析表明：各个处理组间也存在一些共性条带，如图中条带13、14、15、19，说明在21d、42d肉仔鸡肠道中均存在这几种条带所代表的微生物类型；各个处理组肉仔鸡在21d和42d的肠道微生物差异比较大，如21d的优势条带3、18在42d几乎消失或含量很低。肉仔鸡饲喂合生素后，在21d的条带3、17成为其盲肠内优势菌群，且含量高于其他试验组，说明合生素通过调节肉仔鸡肠道，使条带3、17所代表的微生物成为其优势菌群。2.3 日粮添加

35、合生素对肉仔鸡盲肠微生物种类的影响 条带号Band number序列长度（bp）Size GenBank数据库中最相近的菌种名称（登录号）NCBI BLAST matches(Accession number)相似性（%）Similarity Band1188Uncultured Prevotellaceae bacterium clone M4-7(eu530358.1)99Band2168Uncultured bacterium clone E416QYJ01EDVLX(HQ313909.1)98Band3168Uncultured Clostridiales bacterium clon

36、e ABXD_S7(FJ440076.1)100Band4168Uncultured bacterium clone 13AC_H02(HM575008.1)100Band5194Uncultured Phascolarctobacterium sp. clone ABXD_I1(FJ440060.1)99Band6188Bacteroides plebeius strain: M12(AB200217.1)100Band7171Clostridiaceae bacterium SH021(AB298756.2)97Band8188Uncultured Bacteroides sp. clon

37、e Gull50-86 (FJ220958.1)94Band9171Uncultured bacterium clone 9AB_A06(HM574859.1)100Band10169Uncultured Firmicutes bacterium clone TCF2-145(GU959521.1)99Band11168Ruminococcus gauvreauii strain CCRI-16110(EF529620.1)99Band1216816S rDNA sequence amplified from human fecal sample (FP077207.1)98Band13171

38、Uncultured bacterium clone E416QYJ01EXGSG(HQ315332.1)97Band14176Uncultured Bacteroidales bacterium clone MS194A1_F09（EF709128.1）93Band15183Uncultured bacterium clone 054C03.b（EU837961.1）96Band16174Uncultured Clostridia bacterium clone ABXD_AE2（FJ440031.1）98Band17188Uncultured chicken cecal bacterium

39、 clone 2F4（AB075670.1）99Band18168Uncultured bacterium clone 13AC_H02（HM575008.1）100Band19192Megamonas hypermegale strain ABXD_Z48（FJ489251.1）99Band20194Uncultured bacterium clone A4-146（GQ898022.1）100Band21168Uncultured bacterium ckncm319-B7-19（AF376223.1）99Band22194Enterococcus cecorum strain sp200

40、7-00740-01（GU585588.1）100Band23188Uncultured Prevotellaceae bacterium clone M4-7（EU530358.1）100对DGGE图谱中的主要条带进行切胶回收，共回收了23个条带，将这些条带进行克隆转化、测序，由测序结果知，各个处理组肉仔鸡在21d和42d共分离出23种不同的细菌，未测出乳酸杆菌、双歧杆菌和大肠杆菌等优势菌，主要以不可培养的细菌为主，主要包括不可培养的普雷沃氏菌属（Uncultured Prevotellaceae bacterium）、不可培养的梭菌目细菌（Uncultured Clostridiales

41、bacterium）、不可培养的考拉杆菌属细菌（Uncultured Phascolarctobacterium sp.）、不可培养的硬壁门细菌（Uncultured Firmicutes bacterium）、不可培养的拟杆菌属细菌（Uncultured Bacteroidales bacterium）、巨大单胞菌（Megamonas hypermegale）、瘤胃球菌属（Enterococcus cecorum）等。2.4日粮添加合生素对肉仔鸡盲肠微生物菌群相似性的影响图3各个试验组微生物的PCR-DGGE指纹聚类分析图Fig.3 Cluster analysis profile of P

42、CR-DGGE of microorganisms from each treament用MEGA 4.1软件构建肉仔鸡盲肠微生物菌群系统发育树并进行聚类分析。从图3可看出， 肉仔鸡21日龄时，合生素组与对照组、抗生素组、益生素组、益生元组的相似性系数均相对较低，分别为55.6%、70.5%、60.7%、73.8%；42日龄时，合生素组与对照组、抗生素组、益生素组、益生元组的相似性系数相对较低，分别为51.3%、54.6%、63.1%、61.4%。由此可见，无论肉仔鸡在21、42日龄，合生素组与益生素、益生元组的相似性较高，而与对照组、抗生素组相似性较低，说明合生素、益生素、益生元对肉仔鸡肠道

43、菌群结构调节有相似作用，但调节强度不同，其原因是，合生素是益生素和益生元的复合物，能发挥两者的协同作用。2.5 日粮添加合生素对肉仔鸡盲肠总菌、乳酸杆菌、双歧杆菌、大肠杆菌数量的影响 表5 real time-PCR方法检测肉仔鸡盲肠总菌、乳酸杆菌、双歧杆菌、大肠杆菌含量Table 5 Populations of total bacteria, lactobacillus, bifidbacterium, and E.Coil in cecal contents of broiler by real time-PCR 项目Items对照组Control抗生素组Antibiotic益生素组Pr

44、obiotics益生元组Prebiotics合生素组Synbioticslog10 of copies/ g of feceslog10 of copies/ g of feceslog10 of copies/ g of feceslog10 of copies/ g of feceslog10 of copies/ g of feces总菌Total bacterium21d8.450.07a8.650.01 bc8.620.06 b8.710.02 c8.740.02 d42d8.800.06ab8.750.02a8.850.02 bc8.880.02 c8.910.04 c乳酸杆菌La

45、ctobacillus21d5.420.06 a5.560.02 b5.380.03 a5.570.02 b5.640.03 c42d5.490.02 a5.590.05 b5.650.03 c5.530.02 a5.660.03 c双歧杆菌Bifidobacterium21d4.150.04 a4.220.04 a4.250.09 a4.200.03 a4.780.07b42d4.920.02 b4.790.05 a5.170.06 c5.160.04c5.280.05d大肠杆菌E.Coil21d5.740.05 a5.220.01 ab5.190.09 ab5.390.01 ab5.060

46、.10 b42d5.210.03 a5.170.05 ab5.180.11 a5.060.08 bc5.010.08c用FQ-PCR方法检测肉仔鸡盲肠微生物菌群，结果显示，肉仔鸡在21d、42d时，日粮添加合生素与对照组、抗生素组相比，均显著提高其盲肠总菌、乳酸菌、双歧杆菌含量，降低了大肠杆菌含量（P0.05）。随着试鸡日龄的增大，其盲肠内总菌数量呈增加趋势，且合生素组试鸡乳酸菌、双歧杆菌数量也随着日龄的增加而增多。本试验中双歧杆菌数量均低于乳酸菌和大肠杆菌，且含量在4.154.28 log copies /g feces。3 讨论3.1日粮添加合生素对肉仔鸡盲肠微生物菌群结构影响及其与促生长

47、性能的关系 Hume等24报道，用传统菌种分离培养技术和分子生物学技术分析鸡盲肠微生物区系变化表明：随着鸡的生长，盲肠微生物菌群由简单变为复杂，本试验用PCRDGGE分析结果与其相同：肉仔鸡在21d时，日粮添加由枯草芽孢杆菌和低聚木糖、低聚甘露糖组成的合生素组试鸡盲肠DGGE图谱共检测到27个条带，42d时，则检测到32个条带，且条带数均高于同期其它试验组；肉仔鸡盲肠微生物菌群相似性分析表明：合生素组与对照组、抗生素组、益生素（枯草芽孢杆菌）组、益生元（低聚木糖、低聚甘露糖）组相比，其不同日龄菌群的相似性系数也相对较低。21d和42d，合生素与对照组的相似性系数分别为55.6%、51.3%，均

48、低于其与其它试验组的相似性指数。说明合生素具有丰富肉仔鸡盲肠菌群种类的作用，且随着鸡龄的增加而作用强化。合生素这种丰富肉仔鸡盲肠微生物菌群种类的效用可能是其综合了益生素和益生元叠加效果。本试验分析还表明，无论肉仔鸡在21、42日龄，合生素组与益生素、益生元组的相似性较高，而与对照组、抗生素组相似性较低，说明合生素、益生素、益生元对肉仔鸡肠道菌群结构调节有相似作用，但调节强度不同，其原因是，枯草芽孢杆菌作为益生菌的一种，能调节肠道黏膜细胞因子的产生数量，如刺激单核细胞产生抗炎症细胞因子，产生抗菌物质等，并与肠道病原菌竞争定植位点，平衡肠道微生态区系25,26，低聚木糖和低聚甘露糖在动物肠道内能作

49、为益生菌的重要营养基质，促进有益菌的生长27，为动物机体提供了健康的肠道内环境，减少有害微生物对肠道的刺激作用，进而促进绒毛的生长和完整性。而由枯草芽孢杆菌和低聚木糖、低聚甘露糖组成的合生素能使两者协同作用，其效果明显优于单一益生素或益生元。合生素强化肉仔鸡肠道微生物菌群种类的效应与其对生长性能影响具有较强的关联性。随着鸡龄的增加合生素的强化作用越大，而对肉仔鸡日增重、饲料转化效率等经济性状指标影响的总体评价仍然是生长后期（22-42d）的效用大于生长前期（0-21d）。导致合生素这种取向一致效应的原因可能是：肉仔鸡在生长前期，消化道发育及功能不完善，日粮添加适量的合生素仅能帮助其建立相对优化

50、的肠道微生物环境，上调上皮细胞相关基因的表达，并使宿主对这种基因产生记忆，有利于有益微生物的后期定植28，但对于生长前期不完善的肉仔鸡肠道功能而言，其用于助生长的效用可能并不十分显著，合生素的优势未能完全表达；而在肉仔鸡生长后期，其肠道黏膜已完全适应有益菌的定植，且又源源不断地从饲粮中获得定植源合生素芽孢杆菌和营养基质寡糖，两者协调发挥良好的效能，营造健康的肠道微生态环境，进而体现出明显的促进动物生长效用29,30。3.2日粮添加合生素对肉仔鸡盲肠微生物菌群数量的影响本试验用FQ-PCR技术检测肉仔鸡盲肠微生物的总菌数、乳酸杆菌、双歧杆菌和大肠杆菌数量，结果显示，肉仔鸡日粮添加合生素与其他组比

51、较，均能显著提高其盲肠总菌、乳酸菌、双歧杆菌含量，降低了大肠杆菌含量（P0.05）；随着试鸡日龄的增大，其盲肠内总菌数、乳酸菌、双歧杆菌数量也随之增多。合生素对肉仔鸡肠道微生物菌群数量影响的这种作用亦与其促生长性能效用一致。益生素对宿主的有益作用主要体现在争夺有害菌定植位点，分泌抗菌素，竞争排斥有害菌31,15。益生元可以选择刺激有益菌（如双歧杆菌和乳酸菌）、抑制有害菌增殖32，Fritts等33指出，枯草芽孢杆菌C-3102能降低肉仔鸡肠道病原菌如沙门氏菌和弯曲菌，Teo和Tan29,34报道，枯草芽孢杆菌PB6能增加肠道有益菌如乳酸菌的增殖，降低肠道产气荚膜菌和大肠杆菌数量。但本试验测定结

52、果表明，肉仔鸡盲肠双歧杆菌数量低于104CFU/g，乳酸菌数量低于106CFU/g，均少于108CFU/g，与DGGE检测结果相同。说明虽然合生素能促进盲肠乳酸菌和双歧杆菌的增殖，抑制大肠杆菌数量，但有益菌双歧杆菌和乳酸菌，并不是肉仔鸡盲肠内的优势菌，至少不是在本试验分析条件下的优势菌，故需对其优势菌尚需做进一步研究。4.结论肉仔鸡日粮中添加由枯草芽孢杆菌和低聚木糖、低聚甘露糖组成的合生素，分析其盲肠微生物菌群的DGGE图谱，表明合生素具有丰富肉仔鸡盲肠菌群种类的作用，且随着鸡龄的增加作用强化；合生素与益生素、益生元饲喂肉仔鸡，其盲肠菌群的相似性较高，而与对照组、抗生素组的相似性较低；合生素能

53、促进双歧杆菌和乳酸菌的增殖，抑制大肠杆菌数量；合生素对肉仔鸡盲肠微生物菌群影响的作用与其对肉仔鸡促生长的效用一致。References1 Johansen C H, Bjerrum L, Finster K, Pedersen K. Effects of a campylobacter jejuni infection on development of the intestinal microflora of broiler chickens.Poultry Science, 2006, 85: 579-587.2 Stuart E D, Christopher S M. Developme

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