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1、本章主要知识点本章主要知识点色谱的基本概念色谱的基本概念u固定相：固定相是色谱分离的一个基质。它可以是固体物质固体物质（如吸附剂，凝胶，离子交换剂等），也可以是液体物质液体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶液），这些基质能与待分离的化合物进行可逆的吸附、交换等作用。u流动相：在层析过程中，推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体等，都称为流动相。柱层析中一般称为洗脱剂洗脱剂，薄层层析时称为展层剂展层剂。 按操作形式分类：柱层析柱层析：将固定相装于柱内，使样品沿一个方向移动而达到分离。纸层析纸层析：用滤纸做液体的载体，点样后用流动相展开，以达到分离鉴定的目的。薄层层析薄层层析：将适当粒
2、度的吸附剂铺成薄层，以纸层析类似的方法进行物质的分离和鉴定。 纸层析和薄层层析主要适用于小分子物质的快速检测分析和少量分离制备，通纸层析和薄层层析主要适用于小分子物质的快速检测分析和少量分离制备，通常为一次性使用。常为一次性使用。 柱层析是常用的层析形式，适用于样品分析、分离。生物化学中常用的凝胶层柱层析是常用的层析形式，适用于样品分析、分离。生物化学中常用的凝胶层析、离子交换层析、亲和层析、高效液相色谱等都通常采用柱层析形式。析、离子交换层析、亲和层析、高效液相色谱等都通常采用柱层析形式。色谱分离方法的分类其他分类 流动相与固定相 固定相的形状：纸层析、薄层层析等 压力：低压、中压和高压 流
3、动相的流动方向：轴向和径向 分离操作方式：洗脱、前流、置换 分离机理：吸附、离交、亲和、凝胶过滤 u分配系数可由Langmuir方程得出Kd-分配系数q、c-溶质在固相和液相中的浓度cqKd色谱参数色谱峰：色谱柱流出组分通过检测器时产生的响应信号的微分曲线。 峰宽：峰的起点与终点间的直线。峰高(h)：在峰的两侧拐点处所作切线与峰底相交两点之间的距离。半峰宽（W1/2）：通过峰高的中点做平行与峰底的直线，与其峰两侧相交两点间的距离。峰面积（A）：峰与峰底间的面积，又称作响应值。标准偏差（）：0.607倍峰高处所对应的峰宽的一半。拖尾峰：后沿较前沿平缓的不对称峰。前伸峰：前沿较后沿平缓的不对称峰。
4、死时间（t0）:不被固定相滞留的组分，从进样到出峰最大之所需的时间保留时间（tR）：组分从进样到出峰最大之所需的时间。死体积（V0）：不被固定相滞留的组分，从进样到出峰最大之所需的流动相的体积。保留体积（VR）：组分从进样到出峰最大之所需的流动相的体积。校正保留时间（tR） tR=tR-t0校正保留体积（VR） VR=VR-V0VR=tRF F-流动相流动线速度缘）的移动距离在同一时间内溶剂（前溶质的移动距离移动速度流动相在色谱系统中的溶质的移动速度fRsdmmfAKAARsdmeVKVV22/1)(54. 5WtNR2)(16bRWtN NLH u分辨率：两个邻近的峰之间的距离除以两个峰宽的
5、平均值。R-分辨率；S-两峰之间的距离；W1,W2-峰1和峰2的宽度。212WWSR高速逆流色谱高速逆流色谱High-SpeedCountercurrent Chromatography,HSCCC 载体固定相纤维素水硅藻土纤维素（硅胶）乙二醇丙二醇聚乙二醇甲酰胺硅藻土纤维素硅胶液体石蜡正十一烷硅油HPLCHPLC ChromatogramSource RPC30m15m5mInfluence of Particle Size on the Separation effect常用的离子交换树脂Mini Q PC 3.2/3: Glutathione synthetaseSDS-PAGEStar
6、ting materialPeak 2Expanded Bed8. 凝胶色谱（分子筛色谱）分子筛凝胶色谱原理Desalting proteinsproteinssalts0 T凝胶色谱填料特特 点点GFCGFC的优点如下：的优点如下：1、溶质与介质不发生任何形式的相互作用，因此可采用恒定洗脱法洗脱展开，操作条件温和，产品收率可接近100； 2、每批分离操作结束后不需要进行介质的清洗或再生，故容易实施循环操作，提高产品纯度； 3、作为脱盐手段，GFC比透析法速度快，精度高；质活性收率高； 4、分离机理简单，操作参数少，容易规模放大。 特特 点点GFC的不足之处在于 ：1、仅根据溶质之间分子量的差
7、别进行分离，选择性低，料液处理量小； 2、经GFC洗脱展开后产品被稀释，因此需要在具有浓缩作用的单元操作(如超滤、离子交换和亲和层析等)后使用。 9. 疏水作用色谱(Hydrophobic Interaction Chromatography）疏水色谱的原理主要是利疏水色谱的原理主要是利用蛋白质分子表面上的疏用蛋白质分子表面上的疏水区域和介质中的疏水基水区域和介质中的疏水基团之间的相互作用，无机团之间的相互作用，无机盐的存在能使相互作用力盐的存在能使相互作用力增强。增强。Mechanism of HIC 固定相介质表面的疏水性比反相色谱介质表面的疏水性弱,为有机聚合物键合相或大孔硅胶键合相。流
8、动相为pH6-8盐水溶液。A 2800.04 AUNa2SO41.0 M疏水层析操作疏水层析操作在高盐浓度时，蛋白质分子中疏水性部分与固定相的疏水基团产生疏水性作用而被吸附；盐浓度降低时蛋白质疏水性作用减弱，目的蛋白质被逐步洗脱下来，蛋白质疏水性越强，洗脱时间越长。与反相色谱相比，疏水色谱回收率较高，蛋白质变性可能性小u由于在高浓度盐溶液中疏水性吸附作用较大，因此HIC可直接分离盐析后的蛋白质溶液； u可通过调节疏水配基链长和密度调节吸附力，并根据目标产物的性质选择适宜的吸附剂； uHIC不仅是一种有效的分离纯化手段，而且还可与IEC互补短长，分离纯化利用IEC难于分离的蛋白质。u疏水性吸附剂
9、种类多，选择余地大，价格与离子交换剂相当 。HICHIC的特点的特点10. 亲和色谱（Affinity chromatography）AC ver 99032630Steric considerations &spacer armsSmall ligand (1,000)Risk of steric interference with binding between matrix and target moleculeOften need spacer armbut watch out for adsorption to the spacer!Spacer armCompetitive elu
10、tion11. 蛋白质分离常用的色谱方法AIEXTechniqueUltrafiltrationUFSuperdex 200 p.g.GFPurificationfactorQ Sepharose FF 10 times purification 82% yieldPhenyl Sepharose HPHICY.-F. Liao et al. (1996)J. Biol. Chem. 271, 2834863622719Purification of recombinant a-mannosidase from Pichia pastorisKTA explorer 100色谱系统色谱系统KT
11、A explorer 100色谱系统工作流程色谱系统工作流程12.12.纸层析纸层析展开剂的选择展开剂的选择13.13.薄层色谱法薄层色谱法14.14.多肽的分离纯化多肽的分离纯化5 / S. Renlund: Peptides from all sources/ ver. 3.1, 980610Separation techniquesPeptideProteinRPCGFIEXIEXGFRPCPeptides from All SourcesPeptides from All SourcesHow does a peptide differ from a protein?12 / S. R
12、enlund: Peptides from all sources/ ver. 3.1, 980610Synthetic PeptidesSynthetic PeptidesRPC method optimisation Make test runsat two pH valuespH 2.5Make gradient optimisation at both pH valuesScale up and purifyIdentification:MS, A A SequencePurity check: RP-HPLC, IEX, CZE pH 7.06Strategy/AC/1998/JB/
13、. DanielssonProtein PurificationProtein PurificationuAnalytical toolsA rapid and reliable assay for the target proteinPurity determination(e.g. SDS-PAGE)Total protein determination (e.g. colorimetric method)15.15.蛋白的纯化蛋白的纯化11Strategy/AC/1998/JB/. DanielssonThree Phase Strategy - Ranking of Chromatog
14、raphy TechniquesThree Phase Strategy - Ranking of Chromatography TechniquesTechniqueCaptureIntermediatePolishingGFIEXHICACRPCConsiderationsLimited sample volumeLimited flow rate rangeProtein ligand is sensitiveto harsh cleaning conditionsUse of organic solvents,loss of biological activityTechniquePp
15、tHICAIEXCIEXACPurificationfactor720240818647Porcine cerebella homogenateRESOURCE QAmmonium sulfateprecipitationButyl Sepharose Fast FlowRESOURCE sHiTrap HeparinG Protein Receptor Kinase PurificationRec a-Mannosidase Purification from PichiaTechniquePurificationfactor63622719UFGFAIEXHICPhenyl Sepharose HPQ Sepharose FFSuperdex 200 pgUltrafiltrationDNA Binding Protein PurificationTechniqueDNA-1 Sepharose CIEXACACACCIEXPurificationfactor58494392447HeLa cell nuclearextractsSP Sepharose High PerformanceHeparin Sepharose Fast FlowDNA-2 Sepharose Mono S
生物分离技术：Chapter 9 色谱技术
