黄河鲤铜蓝蛋白基因片段的克隆及序列分析毕业论文

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1、 黄河鲤铜蓝蛋白基因片段的克隆及序列分析 摘要：为探讨黄河鲤铜蓝蛋白基因序列的特点，应用PCR技术和同源分析方法研究铜蓝蛋白核酸序列在不同动物体内的存在情况。结果：黄河鲤铜蓝蛋白的核酸序列与鲫鱼（Carassius auratus ）的同源性最高，达到96%；与鳙鱼（Aristichthys nobilis）铜蓝蛋白核酸序列的同源性达到93%；与斑马鱼（Danio rerio ）铜蓝蛋白核酸序列的同源性达到91%。与其他物种相比，不同种属间铜蓝蛋白核酸序列的同源性很低。以上结果表明，铜蓝蛋白基因在不同物种间存在一定甚至是较大差异，在同一种属中同源性则较高。关键词：黄河鲤；铜蓝蛋白；PCR；同源

2、性Clone and Sequence Analysis of part gene of Ceruloplasmin in Cyprinus Carpio Abstract: Clone and Sequence Analysis of part gene of Ceruloplasmin in Cyprinus Carpio was studied by using PCR techniques and isogeny analysis method. The results showed that the cloned part gene sequence of Ceruloplasmin

3、 makes the highest homology with Carassius auratus, reached 96%;Aristichthys nobilis (Aristichthys nobilis) reached 93%,and the zebrafish (Danio rerio) reached 91%. Compared with other species, i found that the homology of Ceruloplasmin nucleic acid sequence is low.It shows that Ceruloplasmin gene m

4、ust have great differences between species, but the homology is higher in the same species.Key words: Cyprinus carpio；Ceruloplasmin；PCR；Homology 铜蓝蛋白(EC 1163)是Holmberg和Laurell于1948年从人血清a2球蛋白中纯化出的一种蛋白质，因其具有氧化酶活性，且外观呈蓝色1，故将之命名为铜蓝蛋白(Ceruloplasmin or Caeruloplasmin，CP)，同年他们又在猪血清中发现了CP1。之后的许多人分别在蛙、犬、小鼠、鸡

5、、鹅、牛、骆驼、兔等几乎所有有常见家畜禽机体中发现了CP的存在，而植物中含有的是与CP结构、性质及功能相似的其他多铜氧化酶家族的成员，且广泛存在。因此CP是广泛分布于各种动物机体中的一种含铜蛋白质。CP主要合成于肝脏，先在肝细胞内合成铜蓝蛋白前体蛋白，当前体蛋白到达肝细胞分泌区时，即渗入铜原子到前体蛋白中形成全铜蓝蛋白，随后被分泌出肝细胞。CP进入到组织间液中可发挥氧化酶作用2-3，并参与生物体内铜的转运4；通过其亚铁氧化酶作用调节机体内细胞铁的代谢5-8；参与机体抗氧化9；参与某些生物(斑马鱼)肝脏的发育过程10，也在胚胎发育过程中发挥重要作用11-12；参与神经系统的发育及新生毛细血管的形

6、成等13-14；是机体急性反应期的反应蛋白15-16，是各种炎症、感染、中毒及肿瘤疾病的标志性蛋白17-19；因CP与微量元素铜之间的特殊关系，它还是机体内铜营养状况的指示蛋白21-21，它还为母畜及妇女妊娠期、胎儿初生后为胎儿提供高效的生物铜源，并发挥营养作用22-24；与人类wilson病、阿尔茨梅病、帕金森病、遗传性低CP血症、神经变性综合症、肿瘤及癌症等多种疾病有密切的联系25-26 。因此，长期以来不少的研究工作者从CP蛋白的结构、生化特性、生物合成、在体内的分布、代谢及生理功能等诸多方面展开了大量研究，尤以该蛋白与人类部分疾病之间的联系研究较多，并取得了不少的成就。在鱼类铜蓝蛋白基

7、因序列的研究目前主要集中在斑马鱼、鲫鱼和鳙鱼，并获得了部分的铜蓝蛋白核酸序列。目前还未见黄河鲤铜蓝蛋白核酸序列的报道，因此，本试验对黄河鲤铜蓝蛋白核酸序列进行克隆和序列分析，为进一步研究铜蓝蛋白的结构和功能奠定基础。1试验材料1.1试验动物 黄河鲤取自黄河鱼场 ，体长(13.462.93)cm，体重(75.896.25)g左右。试验前停喂3 d，使其尽量排尽体内粪便,避免残饵和粪便对金属形态影响。水温（262），每天换一次水，气泵充气保证供氧。1.2试验仪器试验仪器名称 仪器来源洁净工作台 上海博讯实业有限公司医疗设备厂电泳设备 北京市六一仪器厂PCR仪 Eppendof公司台式高速离心机 E

8、ppendof公司台式高速低温离心机 Eppendof公司智能生化培养箱 宁波莱夫科技有限公司电子天平 北京塞多利斯天平有限公司凝胶成像系统 北京誉朗诺科技有限公司微型分光光度计 Eppendof公司1.3试验试剂 Trizon、 DEPC 、HiFi-MMLV cDNA Kit、 DM2000 和 Taq MasterMix均购自CWBIO（康为世纪）公司，CuSO4.5H2O、异丙醇、氯仿、无水乙醇等均为国产分析纯试剂，枪头、EP管等均购自 TaKaRa公司。1.4试验用溶液的配制方法 （1）氨苄青霉素储存液配制方法 1）称取5gAmpicillin置于50ml塑料离心管中。 2）加入40

9、ml灭菌水充分混合溶解后定容至50ml。 3）0.22m滤膜过滤除菌，分装后-20保存备用。 （2）LB/Amp液体培养基配制方法 1）称量下列试剂，置于1L烧杯中 Tryptone 10g Yeast Extract 5g NaCl 10g 2）加入约800mL的去离子水，充分搅拌溶解。 3）滴加5N NaOH（约0.2mL），调节pH值至7.0。 4）加去离子水将培养基定容至1L。 5）高温高压灭菌后，冷却至室温。 6）加入1mL Ampicillin（100mg/mL）后均匀混合后于4保存。 (3)TAE缓冲液配制方法 1)称量下列试剂置于1 L烧杯中。 Tris 242g Na2EDT

10、A2H2O 37.2g 2)向烧杯中加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解。 3)加入57.1 ml的醋酸，充分搅拌。 4)加去离子水将溶液定容至1 L后，室温保存。1.5 载体和宿主菌 克隆载体为pMD19-T载体，购自 TaKaRa宝生物大连有限公司；宿主菌株为DH5a，购自天根生化科技有限公司。2试验方法2.1总RNA的提取取黄河鲤肝胰脏，经生理盐水处理后，锡纸包裹经液氮速冻后冻存于-60冰箱备用。（1）在经0.1DEPC水处理过的5 mL试管加入1 mL Trizon，取50 mg的组织浸入Trizon中，匀浆30s，转至1.5 mL的Eppendof管中，充分混匀，冰上静置5 m

11、in；（2）再加入0.2 mL氯仿，剧烈震荡15s后室温静置3min，于412000 r/min离心15min； （3）取上层水相于一新的Eppendof管中，加入同体积的异丙醇，颠倒混匀后-40静置10 min，412000 r/min离心10 min；（4）弃上清，沉淀用1ml的75乙醇洗涤，震荡以悬浮沉淀，412000 r/min离心5min， （5）弃上清，倒扣Eppendof管室温干燥，干燥后用适量的无酶水溶解即得总RNA提取液。（6）将提取的总RNA在微量光分光光度计下测其吸光度A值，根据样品在260/280 nm波长处的吸光度确定总RNA提取液中RNA的浓度，之后稀释使其浓度在1

12、000ng/l，-80保存。2.2反转录（1）第一链cDNA的合成 1）20l反应体系: 10mM dNTP 4l 5RT Buffer 4l Primer Mix 2l 0.1M DTT 2l 200U/l HiFi-MMLV 1l RNA Temple 1l DEPC水 6l震荡瞬离；2）反应条件：42 50min70 15min 冰上冷却瞬离。-20保存。3）进行半定量RTPCR扩增所用的目的基因和内参基因GAPDH的特异性引物27。引物设计的原则：长度：1530bp，其有效长度Ln=2(G十C)十(A十T)一般不大于38，否则PCR的最适延伸温度会超过Taq酶的最佳作用温度(74度)，

13、从而降低产物的特异性。G十C含量：应在40%一60%之间，PCR扩增中的复性温度一般是较低Tm值引物的Tm值减去510度。引物长度小于20时，其Tm恒等于4(G十C)十2(A十T)。碱基分布的随机性：应避免连续出现4个以上的单一碱基。尤其是不应在其3端出现超过3个的连续G或C，否则会使引物在G十C富集序列区错误引发。引物自身：不能含有自身互补序列，否则会形成发夹样二级结构。引物之间：两个引物之间不应有多于4个的互补或同源碱基，不然会形成引物二聚体，尤应避免3端的互补重叠。上下游引物的互补性：一个引物的3末端序列不允许结合到另一个引物的任何位点上。3末端：如果可能的话，每个引物的3末端碱基应为G

14、或C。引物应当超出限制性内切酶识别位点至少3个核苷酸。如表1所示，引物由上海生物技术有限公司合成。表1 CP基因和GAPDH基因引物For.1 Gene primers of CP and GAPDH引物序列PCR产物大小CP上游5- CCACTGTAGACGTTATCAAGGAC- 3244bpCP下游5- GATTCCATGCATCTTGTTGC- 3GAPDH上游5-GCCTCCTGCACCACCAACTG -3250bpGAPDH下游5- CGGAAGGCCATGCCGGTCAG- 32.3 PCR扩增 (1）25l反应体系： 2Es Taq MasterMix 12.5l Forwa

15、rd Primer 1l Reverse Primer 1l cDNA 1l DEPC水 9.5l (2)反应条件为： 94预变性 2min 94变性 30s 53.6退火 30s 72延伸 20s 72终延伸 2min38个循环，-20保存。采用EB染色，直接取5l PCR反应产物点样进行电泳。琼脂糖凝胶浓度为1.0，电泳缓冲液为TAE。电压120 V，电流110 mA，电泳时间40 min。2.4 PCR产物纯化与检测切胶回收试剂盒用TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver.3.0。方法参照试剂说明：（1）用洁净的刀片从琼脂糖凝胶上

16、切下目的条带，尽量切除多余部分，放入干净的离心管中称重，向PCR反应液（或其它酶促反应液）中加入5倍量的Buffer DC，颠倒混匀使胶块充分溶解。（2）将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。（3） 将上述操作（1）的溶液转移至Spin Column中，室温12,000 rpm离心1分钟，弃滤液。注）如将滤液再加入Spin Column中离心一次，可以提高DNA的回收率。（4） 将700 l的Buffer WB加入Spin Column中，室温12,000 rpm离心30秒钟，弃滤液。（注）提前确认Buffer WB中已经加入了指定体积的100%乙醇。（5）

17、重复操作步骤（4）。（6）将Spin Column安置于Collection Tube上，室温12,000 rpm离心1分钟。（7） 将Spin Column安置于新的1.5 ml的离心管上，在Spin Column膜的中央处加入 30l的灭菌水或Elution Buffer，室温静置1分钟。注）将灭菌水或Elution Buffer加热至60使用时有利于提高洗脱效率。（8）室温12,000 rpm离心1分钟洗脱DNA。2.5 连接与转化（1） 在微量离心管中配制下列DNA溶液，全量为10l。 pMD19-T Vector 1l DNA 1l Solution 1 5l dH2O 3l（2）全

18、量（10 l）加入至100 l DH5感受态细胞中，冰中放置30分钟。（3）恒温孵育器中42加热90s秒钟后，再在冰中放置1分钟。（4）加入890 l LB培养基，37、220rpm振荡培养60分钟。（5）5000rpm、3min离心，吸去500l上清，将所有菌液吹打混匀。（6）在含Amp的L-琼脂平板培养基上加入40lx-gal、10lIPTG涂匀、晾干，取80l菌液到平板上，置于37恒温培养箱中过夜培养。2.6菌液PCR鉴定（1）挑选白色菌落，使用PCR法确认载体中插入片段的长度大小。用菌液做模板进行PCR鉴定，25l反应体系如下： Forward Primer 1l Reverse Pr

19、imer 1l 2Es Taq MasterMix 12.5l 菌液 1l DEPC水 9.5l （2)反应条件为： 94预变性 2min 94变性 30s 53.6退火 30s 72延伸 20s 72终延伸 2min30个循环。2.7 DNA测序与分析从电泳结果为阳性的菌液中，取100l加到含Amp的LB中，增菌培养5h，委托上海生物工程有限公司进行测序。将所得核苷酸序列输入GenBank进行同源性比较。3结果3.1总RNA的提取 分别在每个时间点的每一个浓度组中采3尾鱼取样，提取所有组织中的总RNA，用微量分光光度计对所有的样品定量，所得OD260/280值在1.82.0之间，浓度均大于1

20、000ng/l，说明总RNA的提取很成功，可以进行PCR扩增。3.2铜蓝蛋白的目的基因片段的RT-PCR扩增 以提取的总RNA为模板进行反转录，在用所得cDNA为模板用目的基因引物进行RT-PCR反应。用1.0的琼脂糖凝胶电泳检测铜蓝蛋白目的基因片段的大小与引物设计时预测的一致。如图3.1所示：2000bpp250bppM 图3.1 PCR电泳结果DM2000 DNA Marker(M)Fig.3.1 Electrophoresis analysis of PCR products、3.3菌液PCR鉴定电泳 纯化的产物分别与pMD19-T Vector连接，转入DH5感受态细胞中，蓝白斑筛选出

21、阳性菌落，培养后进行菌液PCR鉴定，用1.0的琼脂糖凝胶电泳检测，如图3.2所示：250bpp2000bppM 图3.2 铜蓝蛋白基因菌液PCR电泳结果DM2000 DNA Marker(M)Fig.3.2 Electrophoresis analysis of Bacterinum PCR products-CP3.4重组质粒测定及分析 扩增后的产物经纯化、连接、转化、鉴定后，所得CP目的基因片段测序结果为CCACTGTAGACGTTATCAAGGACATGTACAGTGGCTTGAT 40CGGTCCGCTGGTCATCTGCAAGAAGAGCCTGGCTCGTACA 80CTGGGGCT

22、GAAGAAAGAGATCGAGGAGTTCGCTCTGCTCT 120TCATGGTCTTTGATGAGAATGAATCTTGGTATCTGGATGA 160CAACATCAAAGCTCATGTTAAAATCCCTCCCAAGGCACTT 200AAGGAGGATGAAGAGTTTATCGAAAGCAACAAGATGCATG 240GAAT 244CP目的基因片段大小为244bp。3.5黄河鲤铜蓝蛋白核酸序列的同源性比较与进化树 将本试验所获得的黄河鲤铜蓝蛋白基因的部分序列与NCBI上登录的不同物种的铜蓝蛋白的核酸序列进行对比分析28，结果表明黄河鲤铜蓝蛋白的核酸序列与鲫鱼（Carassiu

23、s auratus ）的同源性最高，达到96%，序列来源为HM355584.1；与鳙鱼（Aristichthys nobilis）铜蓝蛋白核酸序列的同源性达到93%，序列来源为FJ502083.1；与斑马鱼（Danio rerio ）铜蓝蛋白核酸序列的同源性达到91%，序列来源为BC064000.1。 图3.3 黄河鲤与其他物种的铜蓝蛋白的进化树Fig.3.3 Evolution tree of the deduced amino acid sequence of Cyprinus Carpio with CP of other species 在进化树中Equus caballus为马，Ca

24、nis lupus为灰狼，Sus scrofa为山猪，Ovis aries为绵羊，Oryctolagus cuniculus为欧洲野兔，Mus musculus为小家鼠，Macaca mulatta为普通猕猴，Oreochromis niloticus为奥尼罗非鱼，Chionodraco rastrospinosus 为眼斑雪冰鱼，Danio rerio为斑马鱼，Hypophthalmichthys nobilis为鳙鱼，Cyprinus Carpio为黄河鲤，Carassius auratus为鲫鱼。 用Mega程序对铜蓝蛋白核酸序列进行分析建立了进化树（图3.3）。从进化树可以看出，黄河鲤

25、与鲫鱼、鳙鱼、斑马鱼、眼斑雪冰鱼及奥尼罗非鱼聚在一起，说明鱼类之间亲缘关系最近，其中黄河鲤与鲫鱼亲缘关系最近，黄河鲤与鳙鱼、斑马鱼亲缘关系稍次，眼斑雪冰鱼与奥尼罗非鱼聚成一束，与黄河鲤的亲缘关系较近；小家鼠与欧洲野兔、绵羊、山猪、灰狼、马、普通猕猴又聚成一类，灰狼与马、山猪、绵羊聚成一类，与黄河鲤亲缘关系最远，普通猕猴与小家鼠、欧洲野兔与黄河鲤亲缘关系稍远。4讨论 铜蓝蛋白作为一个重要的亚铁氧化酶，它在机体铁转运和铁平衡中起着重要，无铜蓝蛋白血症患者在肝细胞和网状内皮细胞中铁浓度显著增高，血中铁蛋白浓度增高、铁离子浓度下降，大多数患者有轻度贫血29-31。 对蛋白质进行基因克隆和测序，可以了解

26、蛋白质的核酸序列及基因结构，为该蛋白质开发利用提供有力支撑。 Spee.B在犬铜中毒研究过程中克隆出了犬铜蓝蛋白221bp的部分序列。Robert E等分离出小鼠肝脏组织的铜蓝蛋白cDNA，发现小鼠铜蓝蛋白核酸序列与人铜蓝蛋白的同源性达到了93。本试验通过RT-PCR方法从黄河鲤组织中成功克隆出了黄河鲤铜蓝蛋白基因部分序列，长约244bp，填补了这一蛋白质核酸序列的空白。将本试验所获得的黄河鲤铜蓝蛋白基因的部分序列与NCBI上登录的不同物种的铜蓝蛋白的核酸序列进行对比分析发现黄河鲤铜蓝蛋白的核酸序列与鲫鱼（Carassius auratus）的同源性最高，达到96%，与鳙鱼（Aristicht

27、hys nobilis）铜蓝蛋白核酸序列的同源性达到93%，与斑马鱼（Danio rerio）铜蓝蛋白核酸序列的同源性达到91%。用Mega程序对铜蓝蛋白核酸序列进行分析建立了进化树发现，与其他物种相比，不同种属间铜蓝蛋白核酸序列的同源性很低，表明铜蓝蛋白基因在不同物种间存在一定甚至是较大差异，在同一种属中同源性则较高。这一结果与传统的研究结果相符。 多年来，人们一直认为铜蓝蛋白是引起细胞铁释放的关键蛋白，主要基于它具有亚铁氧化酶活性，能催化二价铁离子氧化为三价铁离子，帮助三价铁离子与转铁蛋白相结合，从而参与细胞铁释放32。0skai等于1966年首先提出铜蓝蛋白在铁代谢中的作用是帮助细胞铁释

28、放，30多年来这种观点一直被人们广为接受，无铜蓝蛋白血症的发现进一步论证了这种观点的正确性30-31,33。但近年有学者对铜蓝蛋白在铁代谢中的作用提出了不同的观点，他们认为铜蓝蛋白的作用是促进细胞铁摄入。Mukhhopadhyay等对Hep G2(人肝癌细胞)的研究发现，铁缺乏能增加铜蓝蛋白基因的转录表达，结果显示铜蓝蛋白参与铁的摄入34。Attieh等对Hep G2细胞的研究，Qian等对BT325(神经胶质瘤细胞)的研究也发现了相同的现象32，35-36。对黄河鲤铜蓝蛋白在铁代谢中作用的深入研究有助为解决这一争论提供新的证据。致谢：本试验研究是在河南农业大学生命科学研究中心完成的，论文写作

29、在指导老师高春生老师悉心指导帮助下完成，在此期间河南农业大学牧医工程学院硕士研究生乔晶晶给予极大支持和帮助，在此表示由衷的感谢！参考文献：1Holmberg C G，Laurel C BInvestigation serum copperIIIsolation of the copper containing protein，and a description of some its properties.JAtta Chem. Scand，1948,(2):550-556.2Musci G，Bonaccorsi D，Patti M CModulation of the redox state

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