553988401828猪细小病毒VP2与猪圆环病毒多肽p21基因

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1、猪细小病毒VP2与猪圆环病毒多肽p21基因的克隆及联合表达孙彦欣，左玉柱，李建辉，范京惠*（河北农业大学 动物科技学院，河北 保定 071001）摘要：从河北省部分地区病猪中分离猪细小病毒，通过RT-PCR技术获得扩增VP2蛋白的编码基因，采用PCR技术对猪圆环病毒的多肽P21基因进行扩增。分别将其连入Simple-T载体中，经酶切，PCR及序列测定法进行鉴定。测序正确后，将VP2基因与多肽P21基因插入到pET-32a（+）载体中构建原核表达载体。将此重组质粒转化到大肠杆菌BL21感受态细胞中，并用IPTG诱导，将诱导产物用SDS-PAGE和Western-blot检测到分子量大小为85kd

2、的目的蛋白，结果显示VP2基因与P21基因可以在大肠杆菌中获联合表达。Western-blot试验证明，该蛋白可以与猪细小病毒免疫血清产生特异性结合反应，具有良好的抗原性，为构建二联基因工程疫苗提供重要物质基础。 关键词：猪细小病毒；VP2基因；P21基因；原核表达Cloning and expression of Procine parvovirus and P21 Polypeptide of Porcine cireovirus type2Sun yanxin，ZUO Yu-zhu，LI jianhui, FAN Jing-hui*（College of Animal Science a

3、nd Technology, Hebei Agricultural University, Baoding 071000,China）Abstract:Procine parvovirus derived from diseased swines in some areas of Hebei Province, The specific VP2 gene amplified by RT-PCR was cloned into Simple-T vector.a pair of primers were designed according to DNA fragment of P21 Poly

4、peptide of Porcine cireovirus type2 , subsequent P21 encoding gene was amplified through PCR and was cloned into Simple-T vector.and identified it through digested with restriction endoucleases, PCR and sequence analysis methods. After sequencing exactly, The VP2/P21gene sequence was cloned into pro

5、karyotic expression vector pET-32a (+) and the recombinant transformed into E.coli cell BL21. SDS-PAGE and Western-blot. indicated that the recombinant fusion protein was about 85kd, The results have shown that VP2 /P21gene was highly expressed in E. coli and protein was consistented with the expect

6、ed molecular weight. And the western-blot experiment has demonstrated that the protein can have specific binding reaction with Procine parvovirus antiserum. This study can provide a basis for developing a genetically engineered vaccine candidate against ppv/pcv2.Key words: Procine parvovirus; VP2 ge

7、ne; Porcine cireovirus type2;prokaryotic expression猪细小病毒(Porcine parvovirus，PPV)是一种自我复制的细小病毒，主要引起初产母猪的繁殖障碍1。PPV单纯感染猪以外，该病毒与猪圆环病毒(Porcine Circovius Type2，PCV2)的混合感染更为普遍。目前这两种传染病在猪场并发或继发感染现象较为普遍，给养猪业造成了巨大的经济损失。猪细小病毒是一种自主复制性DNA病毒，其基因组编码2种结构多肽（VP1和VP2）及3种非结构蛋白NS1, NS2 和 NS3 ，其中VP2核衣壳蛋白是PPV的主要保护性抗原，而且具有很

8、高的保守性2。Martinez等，于1992将PPV VP2基因克隆到杆状病毒表达系统中，在昆虫细胞中表达时发现，VP2基因不仅能在昆虫细胞中高效表达，而且表达的蛋白能自我装配成类病毒粒子，用其免疫母猪后，能诱导产生与猪细小病毒相似的免疫应答。3VP2基因在体外表达的蛋白形成的类病毒粒子的高效免疫原性，以及VP2基因的高度保守性，都表明VP2基因所表达的类病毒粒子是作为诊断和预防此病的良好抗原物质。基金项目：作者简介：孙彦欣（1983-）河北保定人，河北农业大学预防兽医学硕士研究生，主要从事猪传染病病原学及防治研究，Email:sunyanxin07；电话:0312-7528478范京惠为通讯

9、作者，主要从事兽医微生物与免疫学研究，Email:jinghui76.目前，学者们分别对PCV2基因组各开放阅读框（ORFs）及其编码蛋白的结构和功能进行了研究，并对各蛋白的细胞表位进行了测定， Stevenson等研究表明，位于ORF1内201-220位氨基酸的多肽P21，为一免疫优势T细胞表位4，免疫动物后，动物体内的淋巴细胞明显增多，而且免疫动物血清中PCV2特异的抗体水平亦明显升高。Mahe等研究结果显示，位于ORF1内185-211位氨基酸的多肽P4(与P21共享201-211氨基酸)内存在一个B细胞表位5。以上研究结果提示，多肽P21内存在PCV2特异的优势抗原表位，是研制抗原表位

10、疫苗的首选目标表位。本研究利用大肠杆菌表达系统，对VP2基因以及多肽p21基因进行克隆并进行了表达，为二联基因工程疫苗研制奠定了基础。 1 材料与方法1.1材料：1.11菌株、病毒株及质粒：pET-32a-vp2-p21质粒，含有猪细小病毒VP2基因，5端插入猪圆环病免疫优势T细胞表位P21多肽基因，由本实验室构建保存；原核表达载体pET-32a(+)有本实验室保存；猪细小病毒株由本实验室从河北省部分地区患猪体内分离获得；感受态E.coli DH5、BL21； pMD18-Tsimple载体购自大连宝生物公司。1.12主要试剂和设备：Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、限制性内切酶Bam

11、H、Xho、Sal购自大连宝生物公司。Trans 2K plus DNA Marker、低分子量蛋白Marker、预染蛋白Marker购自北京全是金生物技术有限公司；DNA胶回收试剂盒、小量质粒提取试剂盒为上海生工生物工程技术服务有限公司，鼠源抗PPV高免血清、鼠抗PCV2血清由本实验室制备保存;HRP标记的羊抗鼠IgG购自Promega公司。DAB显色液购自北京solarbio公司。1.13引物的设计与合成：根据GenBank发表的猪细小病毒参考毒株NADL-2 株VP2基因的核苷酸序列，设计用于扩增VP2编码区基因的一对引物： 上游引物YVP2: 5 TCT GTC GAC（Sal） AT

12、G AGT GAA AAT GTG GAA C 3下游引物ZVP2: 5 AGT CTC GAG (Xho） TGA TTA ACC AAG TAA CTG A 3根据GenBank发表的猪圆环病毒的基因核苷酸序列和位于ORF1内201-220位氨基酸的多肽P21序列，设计出一对寡核苷酸引物进行P21基因的扩增。上游引物P1：5GGA TCC （BamH） ATG GAT GGA TAT CAT GGA GAA GAA GTT GTT GTT GTT TTG GAG GA 3下游引物P2：5 GTC GAC（Sal ） CCA AGG TAA CCA GCC ATA AAA ATC ATC C

13、AA AAC AAC AA 31.2方法：1.2.1 VP2基因片段的扩增应用上述扩增VP2编码区基因的引物，采用PCR扩增目的片段。反应条件为：95预变性5min；94变性1 min，52退火1min，72延伸2min，30个循环；72终延伸10 min；反应结束后,PCR产物用1琼脂糖凝胶电泳，观察扩增结果，得到大小为1740bp目的片段。用小量凝胶回收试剂盒进行纯化回收，并连接与pMD18-T载体，并进行酶切鉴定。1.2.2 P21基因片段的扩增应用上述扩增多肽P21基因的引物采用PCR扩增目的片段。上游引物中还引入一个起始密码子ATG,并且上、下游引物之间互补重叠16bp，从而互为引物

14、和模板，进行P21基因的扩增反应条件为：70加热5min；23或室温）退火5min，37延伸30min，最后70加热10 min；反应结束后，PCR产物用2琼脂糖凝胶电泳，观察扩增结果，得到大小为60bp目的片段，用小量凝胶回收试剂盒进行纯化回收，并连接与pMD18-T载体，并进行酶切鉴定。1.2.3 重组表达载体的构建用Sal和Xho对pMD18-T-vp2进行双酶切，用Sal和Xho对表达载体pET-32a（+）进行双酶切，产生相匹配的粘性末端，然后回收纯化目的片段和载体片段，经T4 DNA连接酶连接，构建重组体pET-32a（+）-vp2；然后用Sal和BamH对pMD18-T-P21进

15、行双酶切，用Sal和BamH对重组体pET-32a（+）-vp2进行双酶切，产生相匹配的粘性末端，然后回收纯化目的片段和载体片段，经T4 DNA连接酶连接，构建重组体pET-32a（+）-vp2-p21；并把重组体转化直大肠杆菌BL21感受态细胞后，小量质粒提取试剂盒提取重组体阳性质粒DNA，并进行PCR和酶切鉴定。1.2.4重组质粒pET-32a（+）-vp2-p21的表达及表达产物的SDS-PAGE分析将转化至大肠杆菌BL21的pET-32a（+）-vp2-p21重组质粒以及pET-32a（+）空载体，分别转接于含Amp(100g/mL)的LB培养基中，200r/min振摇培养过夜，次日按

16、1100转接于含Amp的50mL LB培养基中,37振摇培养至对数生长期(D600 nm=0.61.0)，加入终浓度为0.6mmol/L的IPTG，在28振摇诱导培养，分别于诱导后0、1、2、3、4、5h取菌。菌液经12000r/min离心1min弃上清，沉淀用50L pH7.3的PBS重悬后, 加入等体积的上样缓冲液，煮沸变性5min后，12000r/min离心1min，静置2min，取上清，进行SDS-PAGE电泳。1.9重组蛋白的Western-blot将重组蛋白进行SDS-PAGE电泳，然后转印到硝酸纤维膜（NC膜）上，再转移至BSA封闭液中，4过夜；利用鼠源抗PPV高免血清、鼠抗PC

17、V2血清 (一抗)和HRP标记标记羊抗小鼠抗体(二抗)先后分别杂交,最后通过DNB显色液显色, 待条带清晰后迅速用蒸馏水终止显色反应，鉴定表达的重组蛋白。2 结果2.1 VP2基因与多肽P21基因的PCR扩增图1 PCR基因的扩增1: P21基因的PCR产物2: VP2基因的PCR产物M: Trans 2K plus DNA Marker; Fig.1 Amplification of P21 gene by PCR Fig.2 Amplification of VP2 gene by PCRM:Trans 2K plus DNA Marker; 1 2 Mbp5000300020001000

18、750500250100601740用DNA提取试剂盒提取VP2基因的DNA，以YVP2/ZVP2 为引物，进行PCR扩增，于1琼脂糖凝胶中电泳观察结果，在约1740bp处出现一条特异的DNA带，与预期扩增的VP2基因大小相符（见图2）。2.4 重组体pET-32a-VP2-P21的鉴定对重组质粒pET-32a-VP2-P21进行双酶切及PCR鉴定，电泳结果显示，与预期结果相符（见图2-3），说明目的重组的基因已经正确插入表达载体的阅读框中。50003000200010007505002501001 2 M bp1800bp图3重组质粒pET-32a-VP2-P21的pcr鉴定Fig.1 Id

19、entification for recombinant virus by PCRM:Trans2K Plus DNA Marker 1-2:重组VP2+P21基因的PCR产物;1-2: recombinant virus product of PCR.图2重组质粒pET-32a-VP2-P21的酶切鉴定Fig.1 Identification of the plasmid pET-32a-VP2-P21M:Trans2K Plus DNA Marker1:BamH和Xho双酶切产物;2: Sal和Xho双酶切产物3.BamH和Sal双酶切产物1: double enzyme digestio

20、n by BamH和Xho2: double enzyme digestion by Sal和Xho3: double enzyme digestion by BamH和Sal1 2 3 M bp50003000200010007505002501001800_174060_2.5 表达产物的SDS-PAGE分析图4 诱导不同时间重组菌的SDS-PAGE分析Fig.4 Identification of the amount of pET-32-vp2-p21 expressed from the Recombinant protein in different time1: pET-32a空

21、载诱导前0h; 2:pET-32a空载诱导后3h; M:蛋白质标准; 39: pET-32a-VP2-P21诱导1h,2h,3h,4h,5h,6h,7h1: uninduced plasmid in 0h; 2: uninduced plasmid in 5h; M:Marker; 39: induced in 1h,2h,3h,4h,5h,6h,7h1 2 M 3 4 5 6 7 8 9 85kdKD10062403024将含有阳性重组载体在IPTG诱导下，不同诱导时间的产物经SDS-PAGE检测，结果在约85kd处可见表达条带，与预期蛋白大小相一致（见图4），而未诱导菌和空载体菌诱导后，均

22、没有出现此蛋白条带，与诱导前对照菌相比（用微波扫描仪分析），诱导5h时表达量最高，且表达量约占总体蛋白的30%。2.6重组蛋白 Western-blot检测100KD62KD40KD 30KD24KD85kdM 1 2 BM 1 2175KD80KD58KD46KD30KD23KDA85kd858585858585kd图5重组蛋白wester-blot检测Fig.5 Identification for Recombinant protein by wester-blotA: 利用鼠源抗PPV高免血清为一抗的wester-blot检测B: 利用鼠源抗PCV2高免血清为一抗的wester-blo

23、t检测A: Western-blot analysis of the recombinant protein reacted with anti-PPV antiserumB: Western-blot analysis of the recombinant protein reacted with anti-PCV2 antiserum利用鼠源抗PPV高免血清、鼠抗PCV2血清(一抗)和HRP标记的羊抗鼠IgG (二抗)先后分别杂交,最后通过DAB显色液显色, 待条带清晰后迅速用蒸馏水终止显色反应，鉴定表达的重组蛋白。3 讨论基因工程亚单位疫苗(subunit vaccine) 不含感染性组

24、分,所以无需灭活,也无致病性。细小病毒的免疫方式主要是体液免疫,同时细小病毒的基因组较小,比较容易在载体上获得表达。VP2蛋白是病毒粒子的主要结构蛋白,占总衣壳蛋白的60%以上,是PPV的主要免疫原性抗原 6 。VP2蛋白在体外表达后可以自我装配成病毒样颗粒,且在其5端连接一小段基因不影响病毒样颗粒形成,并且具有较好的免疫原性。Sedlik等研究结果表明,PPV VP2蛋白具有独特的生物学特性,其形成的病毒样颗粒不仅稳定性高、免疫原性好,而且可高效提高其他病原的免疫原性T细胞表位多肽,诱导机体同时产生针对PPV的体液免疫和针对其他病原的细胞免疫7-8。因此,用基因工程的方法生产PPV亚单位疫苗

25、是一条较好的途径。本研究扩增并克隆了猪细小病毒vp2与猪圆环病毒多肽p21基因，构建的pET-32a-VP2-P21重组体系统在IPTG诱导下于大肠杆菌中成功表达了重组蛋白，本试验对表达的重组蛋白进行了Western Blot检测，检测后确定所表达的蛋白质分子质量大小约为85ku,且具有天然蛋白的抗原特性,为构建猪细小病毒与猪圆环病毒二联基因工程疫苗提供重要物质基础。参考文献（References）1 Carwright,S.F.;and Huck,R.A.1967.Viruses isolated in association with herd infertility, abortions

26、 and stillbirths in pigs.Vet Rec 81:196-197.2 Cotmore S F,Tattersall P.1987.The autormously replicating parvoviruses of vertebrates. Adv.Virus Res,33:91174.3Martinez C, Dalsgaard K, Lopez de Turiso J A, et al. Production of porcine parvovirus empty capsids with high immunogenic activity J. Vaccine 1

27、992，10: 684-690.4Stevenson, SL. Gilpin, DF. Douglas, A. Mcneilly, F. Mcnair, I. Adair, BM. Allan, GM. T lymphocyte epitope mapping of porcine circovirus type 2J. Viral Immunol. 2007,20(3):389-398.5Mahe, D. Blanchard, P. Truong, C. Arnauld, C. Le Cann, P. Cariolet, R. Madec, F. Albina, E. Jestin, A.

28、Differential recognition of ORF2 protein from type 1 and type 2 porcine circoviruses and identification of immunorelevant epitopesJ. J Gen Viro. 2000,81(7):1815-1824.6 殷震,刘景华.动物病毒学M.北京:科学出版社,1997.7 Sedlik C,Sarraseca J,Rueda P.Immunogenicity of po-liovirus B and T cell epitopes presented by hybrid por-cine parvovirus particles J. J Gen Virol, 1995, 76(9):2361-2368.8 Lo-Man R,Rueda P,Sedlik C,et al.A recombinant virus-like particle system derived from parvovirus as an efficient antigen carrier to elicit a polarized Th1 im-mune response without adjuvantJ.Eur J Immunol, 1998,28(4):140-1407.