雌性和雄性虎纹捕鸟蛛粗毒蛋白质含量比【推荐论文】

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1、精品论文雌性和雄性虎纹捕鸟蛛粗毒蛋白质含量比较分析王美迟，段志贵，胡朝暾，刘珍5（湖南师范大学生命科学学院，蛋白质化学及发育生物学教育部重点实验室，长沙 410081） 摘要：自然界虎纹捕鸟蛛雌蛛数量远多于雄蛛数量，用不同方法比较了单个虎纹捕鸟蛛雌、 雄蛛粗毒的特征。结果表明雌蛛单次螫毒量为 26.52.47l，冻干后粗毒质量为 5.010.78mg，明显高于雄蛛单次螫毒量 10.831.35l，冻干后粗毒质量为 2.050.17mg；用 Lowry法和 Bradford 法测定雌蛛和雄蛛粗毒的蛋白质含量，两种方法均表明等量粗毒中雄蛛蛋白10总含量比雌蛛高。用反相高效液相色谱分离雌蛛和雄蛛粗毒

2、蛋白，215nm 紫外扫描结果表明 大部分主峰重叠，雌蛛峰面积大，而雄蛛色谱图中多两个主峰。Tricine SDS-PAGE 电泳结 果表明雌蛛粗毒分子量小于 10kDa 的蛋白质含量偏高；而 Tris SDS-PAGE 电泳结果表明雌蛛粗毒分子量大于 10kDa 的蛋白质含量偏低，这也许是雌蛛总蛋白含量偏低的主要原因。研究结果提示了对雌、雄蛛粗毒独立研究的重要性。15关键词：蛋白质；虎纹捕鸟蛛；雌蛛；雄蛛中图分类号：Q512Female and male Ornithoctonus huwena crude venom protein content comparison analysis2

3、0Wang Meichi, Duan Zhigui, Hu Zhaotun, Liu Zhen(Key laboratory of protein chemistry and developmental biology of the ministry of education, the college of life science, Hunan normal university, Changsha 410081)Abstract: The number of female spiders Selenocosmia huwena is greater than that of male sp

4、idersin nature, and we study the different characteristics of their venom using different methods. The25results show that female single sting venom quantity is 26.5 2.47 L, is significantly higher than that of males,which is 10.83 1.35 L; freeze-dried crude venom quality of females was5.01 0.78mg, t

5、he male spiders is 2.05 0.17mg; Using Lowry and Bradford methods to test the protein content, the results show that protein content of male spider was greater than that of female spider. We also seperate the female and male spider venom using reversed phase high30performance liquid chromatography at

6、 215nm UV scanning, the results show that most of thepeaks are overlapped, two peaks are unique in males chromatogram. The results of tricine SDS-PAGE electrophoresis show that protein content of the female spider venom is more than that of male spider when molecular weight of proteins are less than

7、 10kDa; it is converse in tris SDS-PAGE electrophoresis when molecular weight of proteins are more than 10kDa. Results35suggest that the crude toxin of males should be studied independentlyIn this paper.Keywords: Protein; Selenocosmia huwena; female spider; male spider0引言虎纹捕鸟蛛（Ornithoctonushuwena）是一

8、种大型有毒的穴居蜘蛛，主要分布在我国北40回归线以南的热带季风区域内，因其身体多毛，腹部背面有虎皮状花纹而得名1 。成年雌 蛛较雄蛛个体大，成年代表性雌蛛长约 50mm，而雄蛛约 44mm2,3。颜亨梅等对虎纹捕鸟蛛 的生物生态学特征进行了系统的研究，统计雌性成体平均体重为 32.17 g ，雄性成体平均体基金项目：国家自然科学青年基金(31000477)；高等学校博士学科点专项科研基金资助课题： (20104306120005)；湖南省教育厅基金(10C0961，09C756)；湖南师范大学蛋白质化学与发育生物学教育部 重点实验室开放基金课题：(DF1111，DF1104)；湖南师范大学青年

9、科学基金项目：(110634)。 作者简介：王美迟，（1977-），女， 湖南株洲人， 博士，讲师， 主要从事蜘蛛毒素的结构与功能的研 究. E-mail: wangmeichi- 7 -重为 11.31 g1。本研究室从 20 世纪 90 年代初开始对虎纹捕鸟蛛毒液中毒素的结构和功能进 行深入的研究,发现了数十种有生物活性的多肽成分4-10。这些多肽功能复杂多样，有钠离子45通道抑制剂8,11,12，有钙离子通道抑制剂10,11；有些是对昆虫有选择性作用6,9,有的对昆虫和 哺乳动物都有作用12。袁春华等也通过蛋白质组分析方法结合多维色谱技术对虎纹捕鸟蛛 粗毒进行了一个系统、全面的毒素组学分

10、析，对 10 kD a 以下的多肽组分进行纯化， MALDI-TOF 质谱鉴定到 133 种组分，并利用 Edman 降解技术测定了其中 47 种多肽的氨基酸序列。对分子量 10 kDa 以上的蛋白质，利用 2-DE 分离， PDQUEST 软件分析，发现50了大约 300 个蛋白质点，准确鉴定到 90 种蛋白质，包括一些具有重要生物学意义的蛋白酶、 结合蛋白质和调控蛋白质等13。然而购买或采集来的试验所用蜘蛛粗毒是雌蛛和雄蛛的混 合毒液，而且根据自然界雌蛛和雄蛛存在的自然比例大约 90100:1。雌蛛与雄蛛的混合粗 毒往往覆盖了雄蛛粗毒的特征。它们之间是否存在差异仍然未知。从新的视角出发，对

11、虎纹捕鸟蛛雌性和雄性粗毒蛋白质含量进行初步比较。自然采集来55的雌蛛和雄蛛单笼饲养，雌、雄分别编号，每个蜘蛛均采用一次性 EP 管采集毒液，计量体 积、编号分管冻干保存。这样保证了每份试验材料来源于不同的蜘蛛个体。对每份雌蛛和雄 蛛粗毒分别称量，并测定蛋白质含量，统计数据比较雌蛛和雄蛛粗毒蛋白含量的差异；为了 比较雌蛛和雄蛛多肽分布的差别，我们对其进行了反相高效液相色谱；为了分析差异蛋白的 分布区间，对分子量 1 0 kDa 以上的蛋白质和分子量 10 kDa 以下的多肽和蛋白质分别进行60SDS-PAGE 电泳，并进行比较分析。1材料与方法1.1 试验材料与仪器设备虎纹捕鸟蛛雌蛛、雄蛛；丙烯

12、酰胺、N,N-亚甲基双丙烯酰胺、三羟甲基氨基甲烷、十二 烷基硫酸钠、甘油等为 Amresco 公司产品 ；考马斯亮蓝 R-350 染料为 Sigma 公司产品，四65甲基乙二胺（TEMED）为 SERVA 公司产品;甲醇、冰醋酸、醋酸铵、乙腈等其他试剂为国 产分析纯试剂；自制电刺激仪、真空冷冻干燥仪、Bio-Rad 公司电泳槽、清华紫光扫描仪等。 Waters 2695 色谱仪和 Higgins Analytical 的柱子。1.2 试验方法1.2.1蜘蛛毒液的采集及冻干保存70虎纹捕鸟蛛采自广西宁明县桐棉乡的山地和农区，置于肥皂盒内活体带回，置于模仿生 态房饲养，12 天后采集毒液。将一个内

13、径 3CM,高 5cm 的塑料杯固定在铁架台上作为毒液 接收皿，用纱布包好的大镊子从侧面夹住蜘蛛胸部，让蜘蛛张开螯爪并深入杯内，让后用2550 V、1540Hz 的脉冲电流刺激螯爪基部 35 秒，蜘蛛马上将触肢紧紧抱住杯壁， 螯爪用力刺向杯壁并射出微黄透明的毒液。用微量注射器吸取并计量毒液的体积，读数然后75每个蜘蛛的毒液单管收集转移至进口 EP 管里，真空冻干并称重。1.2.2两种不同方法测定蜘蛛粗毒蛋白质含量1.2.2.1 Lowry 法测定蛋白质含量分别称取若干个雌蛛和雄蛛粗毒冻干粉，配成 1g/l。按 Lowry 法进行，以牛血清清 蛋白为标准，测定粗毒溶液的浓度。801.2.2.2

14、Bradford 法测定蛋白质含量分别称取若干个雌蛛和雄蛛粗毒冻干粉，配成 1g/l 的粗毒溶液。采用 Bradford 法测定蛋白质含量，以 BSA 为标准蛋白质制定标准曲线，测定粗毒溶液的浓度。1.2.3粗毒的反相高效液相色谱取等量毒液，稀释在 ddH20 中，上样到 Higgins AnalyticalC4(250X4.6mm)的柱子。两85相流动洗脱系统，A 液为含 0.1% TFA(V/V)的双蒸水，B 液为含 0.1% TFA(V/V)的梯度乙腈 溶液，流速为 1.0ml/min。检测波长为 215 和 280nm。1.2.4粗毒的 SDS 电泳分离蜘蛛粗毒溶于 200l H20

15、水中，转移溶液到专用离心柱，柱内放置 10KDa 的超滤膜，柱 下方套一个离心管，10，000 转离心 15 分钟,离心管内是分子量小于 1 万道尔顿的待测样品，90柱内未离心下去的是分子量大于 1 万道尔顿的待测样品。分子量小于 1 万道尔顿的样品采用 Tricine SDS- PAGE 胶分离。4.8%的浓缩胶,12.5 %的分离胶。电泳完成后考马斯亮兰法显色。 分子量大于 1 万道尔顿的部分参照 Laemmli (1970)的方法用普通的 SDS-PAGE 方法分离。 参照 Bio-Rad 公司方法进行。采用 Tris-甘氨酸不连续凝胶系统,4.8%的浓缩胶,14 %的分离胶。25mA

16、恒流电泳至待溴酚蓝前沿移至分离胶与浓缩胶界面时，调整电流至 50mA，电泳至溴95酚蓝线距胶下沿 1cm 处时停止。将凝胶置于考马斯亮蓝染色液（0.1% 考马斯亮蓝,30%甲醇,10%冰乙酸）中染色约 1h,去掉染色液后，蒸馏水洗一次，随后加脱色液（甲醇： 水： 冰 乙酸 =3： 6： 1）脱色至背景清晰。1002结果图 1 虎纹捕鸟蛛雌蛛（左）和雄蛛（右）Figure1 spider Selenocosmia huwena female（left）and male（right）1052.1 雌、雄蜘蛛的一次毒液体积计量及冻干后的称重分析自然生长的成年雌蛛个体较同龄成年雄蛛个体大，健壮。见图

17、1，左边为成年雌蛛，右 边为成年雄蛛。单个雌蛛螫入管内的毒液体积较雄蛛螫入的量大（见表 1），雌蛛一次螫毒 的平均体积为 26.52.47 微升，而雄蛛一次螫毒的平均体积为 10.830.78 微升(p0.01)。将 以上粗毒分管冻干，雌蛛的粗毒质量为 5.011.35 毫克 ，雄蛛的粗毒质量为 2.050.17 毫 克(p0.01)。 结果表明虎纹捕鸟蛛雄蛛每次螫毒量明显小于雌蛛。表 1.雌、雄蛛毒液的体积及冻干后质量列表Table 1 Female, male spider venom volume and crude quality list110雌蛛编号毒液体积（l）粗毒质量（mg）

18、雄蛛编号毒液体积（l）粗毒质量（mg）F1254.02M161.43F2306.48M281.69F3367.94M3112.11F4264.89M4132.25115F5182.60M5152.46F6244.11M6122.38统计26.52.475.010.7810.81.352.050.171201251302.2 雌、雄蜘蛛粗毒的蛋白质含量测定虽然单个雌蛛的毒液体积及冻干质量都高于雄蛛，但是毒液中蛋白质的含量是否有差异 仍然未知。为此，我们使用两种不同的方法测定了测定了雌蛛和雄蛛的毒液蛋白质含量。根 据图表 2 数据表明，使用 Lowry 法测得雌蛛粗毒中蛋白质含量范围为 50.59

19、%-79.17%之间， 平均含量为 60.999.12%, 雄蛛蛋白质含量范围 65.10%-67.74%之间，平均蛋白质含量为为66.130.82%(p0.01)。Bradford 法测定雌蛛粗毒中蛋白质含量范围为 30.6%-53.9%之间， 平均蛋白含量为 42.836.75%(见图表 3)。雄蛛蛋白质含量范围 48.6%-60.9%之间，雄蛛的 平均含量为 56.273.86%(p0.01)。虽然两种方法测定蛋白的原理不同，但两种方法均表明 雄蛛的蛋白质含量高于雌蛛。表 2. 用 Lowry 法测定雌、雄蛛粗毒的蛋白质含量Table 2 the protein content dete

20、rmination of femalel, males crude toxins by Lowry method雌蛛粗毒蛋白质平均蛋白雄蛛粗毒蛋白质平均蛋白 编号质量（mg）含量（%）含量（%） 编号 质量（mg） 含量（%） 含量（%）HW354.0253.22HW132.2567.74HW247.9450.5960.999.12HW112.2565.5466.130.82HW56.4879.17HW122.4665.10135表 3.用 Bradford 法测定雌、雄蛛粗毒的蛋白质含量Table 3 the protein content determination of female ,

21、 males crude toxins by Bradford method雌蛛粗毒蛋白质平均蛋白雄蛛粗毒蛋白质平均蛋白 编号质量（mg）含量（%）含量（%） 编号质量（mg） 含量（%） 含量（%）140HW392.6044.0HW21.7348.6HW437.4053.942.836.75HW71.8259.356.273.86HW416.0630.6HW82.3860.91452.3 雌、雄蜘蛛毒液的反相高效液相色谱取等体积的雌、雄蜘蛛毒液进行反相高效液相色谱分离，洗脱时间从 0 到 60 分钟，洗 脱液 A 为含 0.1TFA%的 DDH2O,洗脱液 B 中乙腈浓度从 0 逐步上升到

22、60%，洗脱速度为1ml/min。将图 2A 与图 2B 图进行比较发现，大部分主峰出峰时间相同，只是代表多肽或蛋150155160165170白量的峰面积不完全相同。图 2A 图中的峰面积大，说明雌蛛该峰所代表的蛋白质或多肽含量比雄蛛中高。但仔细比较发现，在图 2B 箭头所示的位置，雄蛛的色谱图中多了两个小主 峰，分别在 20 分钟和 31 分钟，此时洗脱乙腈浓度分别是 20%和 31%，暗示了雄蛛毒液中 有不同于雌蛛的独特多肽或蛋白。图 2 雌、雄蛛毒液的反相高效液相色谱A.雌蛛 B.雄蛛 虚线所示为洗脱液中乙腈的浓度，图 B 中箭头所示为雄蛛毒液中独特的两个主峰Figure2. Reve

23、rsed phase high performance liquid chromatography of female and male venomA. male venom B. male venom. The dotted line show the concentration of ACN in elution and the arrows show the unique main peaks in male venom.2.4 雌、雄蜘蛛粗毒的蛋白质电泳分析虽然雌、雄单个蜘蛛蛋白质含量有差异，雄蛛蛋白质含量高，但色谱结果表明多肽或蛋 白在雌蛛中含量高。为此我们使用 SDS 电泳的方法测

24、定了整体蛋白质的差异分布。利用 tricine SDS-PAGE，测定分子量 10k Da 以下多肽和蛋白质的差异，结果如图 3 所示，粗毒中 分子量 10k Da 以下的蛋白质含量有差异，雄蛛蛋白的量比雌蛛含量少，该结果与色谱结果 一致（见图 3）。利用 Tris SDS-PAGE，测定了分子量 10k Da 以上多肽和蛋白质的差异， 结果如图 4 所示：分子量 10k Da 左右的蛋白质雄蛛含量比雌蛛高，而雌蛛和雄蛛毒液中 4k Da 到 5k Da 道尔顿的蛋白质也存在种类的差异。图 3 单个雌、雄蛛粗毒分子量小于 10kDa 的蛋白质组分的 tricine SDS-PAGE 图Figu

25、re 3 Tricine SDS-PAGE diagram of a single female, male spider venom of molecular weight less than 10kDproteins175180185190195200图 4 单只雌、雄蜘蛛毒液分子量大于 10kDa 的蛋白质组分的 Tris SDS-PAGE 图Figure 4 Tris SDS-PAGE diagram of a single female, male spider venom of molecular weight more than 10kDproteins3结论虎纹捕鸟蛛雌、雄蜘蛛

26、采自广西宁明县桐棉乡的山地，带回实验室分笼饲养，可以重复 采毒。但是实验室第一次采集的毒液往往量多且浓度较高，颜色偏黄，质量最好。本论文全 部采用第一次采集毒液的数据及样品。自然界自然生长的成年雌蛛较成年雄蛛数量多。虽然 没有文献报道其确切的存在比例，但我们本批次共采集了 600 只蜘蛛，其中雌蛛 594 只，雄 蛛 6，比例为 99：1。以前采集的不同批次情形类似，雌蛛数量大大超过雄蛛。平时所指的 粗毒是收集雌、雄蜘蛛混合毒液后冻干的粗毒。本研究中单个蜘蛛分开采集毒液并冻干保存 粗毒，保证了试验材料的单一来源及纯度。试验结果表明雌蛛交雄蛛体积大，单次螫毒量多、 冻干后得到的干粉末粗毒也较多。

27、采用两种原理不同的方法分别对粗毒蛋白质进行定量。Lowry 法利用蛋白质在碱性溶液 中其肽键与 Cu2+螯合，形成蛋白质一铜复合物，此复合物使酚试剂的磷钼酸还原，产生蓝 色化合物，利用蓝色深浅与蛋白质浓度的线性关系作标准曲线并测定样品中蛋白质的浓度。 而粗毒中包含大量小分子物质、氨基酸等具有双缩脲反应，可能导致测定结果偏高。为此， 我们又采用了考马斯亮蓝法。该方法利用在酸性溶液中，染料与蛋白质中的碱性氨基酸（特 别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。避免了如干扰 Lowry 法的 K+、Na+、Mg2+离子、 Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等的干扰，测定结果更接近真实数据。

28、但 不是所有的蛋白质均能与染料结合显色，可能导致测定结果偏低。事实也证明蜘蛛粗毒中蛋 白质含量用 Bradford 法比 Lowry 法测定结果偏低。但两种方法的测定结果都表明等量粗毒 中雄蛛毒液的蛋白质含量高于雌蛛的蛋白质含量。也许这弥补了捕食、防御过程中雄蛛总螫 毒量明显小于雌蛛的特点。粗毒中主要包含三类物质：第一类为小分子物质(分子量小于 1k Da)，主要包括有机酸、 生物胺、神经递质等; 第二类为分子量在 1k Da 到 10 kDa 之间的多肽类毒素，其中研究的 最为深入的是第三类多肽毒素，大多为神经毒素，选择性作用于不同亚型的钠、钾、钙离子 通道及其它种类的细胞受体，引发一系列细

29、胞活动从而产生个体中毒现象。第三类为分子量20521021522022523023524010 kDa 以上的蛋白质类，主要是一些高分子量毒素和蛋白酶等。为了解雌蛛和雄蛛毒液中多肽组分的差异，我们对其进行了反相高效液相色谱分离。鉴于试验直接对粗毒进行分离， 分子复杂，我们采用 C4 柱分离。反相高效液相色谱分离得到的主要是第二类物质，反相色 谱结果显示等体积毒液，雌蛛的多肽含量总量高于雄蛛。雄蛛毒液中有独特的主峰，暗示存 在独特的多肽类毒素。是否这些独特的多肽类物质对雄蛛的捕食和防御具有独特的意义？为了知道雌性蜘蛛和雄性蜘蛛粗毒总蛋白质分布的差异。我们对分子量大于 10 kDa 和 小于 10

30、 kDa 的蛋白质分别进行了电泳。结果表明雌蛛和雄蛛的蛋白质分布确实存在一定的 差异。分子量小于 10 kDa 的蛋白质，雄性蜘蛛毒液组分比较少；而分子量大于 10 kDa 的蛋 白质，雄蛛的蛋白质量偏高，主要集中在分子量 10 kDa 左右的蛋白量明显高。以上结果表明雌蛛毒液和雄蛛毒液的量确实有差异，所含蛋白质的分布也存在差异，暗 示了我们雄蛛毒液有单独研究的必要性。参考文献(References)1 颜亨梅, 王洪全, 卢岚,等.中国虎纹捕鸟蛛的生态学J.动物学报,2000,46(1)：4451.2 王智, 颜亨梅, 王洪全.虎纹捕鸟蛛的饲养与繁殖技术J.激光生物学报, 1999,8（4）

31、：312-315. 3 尹长民, 鲍幼惠.虎纹捕鸟蛛雄蛛的修订（蜘蛛目：捕鸟蛛科）J.蛛形学报,1995, 4(2) :131133.4 LIANG S. An overview of peptide toxins from the venom of the Chinese bird spider Selenocosmia huwenaWang =Ornithoctonus huwena(Wang) J.Toxicon ,2004, 43(5): 575 585.5 LIANG S P, ZHANG DY, PAN X, et al. Properties and amino acid seq

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