Akt基因沉默降低小鼠乳腺癌细胞肺转移能力实用教案

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1、立项立项(l xin)依据依据 Akt1是一种丝氨酸苏氨酸蛋白激酶，可通过磷脂酰肌醇激酶(PI3K)依赖的机制被胞外信号激活。目前发现Akt有三个家族成员Akt1PKB、AktPKB、AktPKB。它们的氨基端含有个血小板白细胞激酶底物同源结构区域(PH)可介导脂质蛋白质和（或）蛋白质蛋白质之间的相互作用。Akt通过区特异性与PI3K的类脂产物磷酯酰肌醇3,4,5-三磷酸结合募集到细胞膜上，并通过上游磷脂酰肌醇依赖性激酶1,2(PDK1、PDK2）磷酸化进入活化状态。激活的Akt重新定位到胞质、核内或细胞内的其他部位(bwi)，磷酸化大量的底物蛋白，最终调节细胞的增殖、分化、存活和迁移等。第1

2、页/共19页第一页，共20页。 近年来研究发现，Akt1不但影响肿瘤细胞的增殖、凋亡，而且对许多肿瘤的侵袭和转移也有影响。Akt1基因在人胃癌中表达增加；活化的Akt1促进(cjn)人类胰腺癌细胞、纤维肉瘤细胞和成纤维细胞的侵袭能力，但可抑制MDA-MB-2细胞的迁移能力。在乳腺癌中也发现Akt1异常表达和活性改变，并在乳腺癌的转移过程中发挥重要的作用。降低Akt1水平抑制Erb-2介导的乳腺癌体内转移；而过表达myr-Akt1可抑制人乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力。Akt1活化还可促进(cjn)Erb-2介导的乳腺肿瘤发生但抑制其侵袭能力。这些结果表明，Akt1在不同的细胞型或肿瘤的不同发展阶段

3、所起的作用也不同。第2页/共19页第二页，共20页。研究研究(ynji)目标和内容目标和内容 作为一种原癌基因,Akt1在许多人类肿瘤中表达显著增高，促进肿瘤转移；但也有研究表明， Akt1的活化可抑制乳腺癌细胞的侵袭和转移。为了深入探讨Akt1在肿瘤发生发展过程中的作用，采用RNA干扰技术沉默了高转移小鼠乳腺癌细胞4T1中Akt1的表达。MTT法检测发现,Akt1沉默不影响4T1细胞的增殖能力(nngl)。Tr-answell法检测证明,Akt1沉默可降低4T1细胞的迁移能力(nngl)。与以上结果相一致,Akt1沉默不影响乳腺癌形成原位瘤的能力(nngl)，但显著降低其体内肺转移能力(nn

4、gl)。结果表明,Akt1在小鼠乳腺癌细胞转移过程中发挥重要作用，并提示Akt1可能成为乳腺癌治疗的靶点。第3页/共19页第三页，共20页。计划计划(jhu)和方案设计和方案设计一、细胞株与培养基 小鼠乳腺癌细胞株4T1 细胞培养用培养基为DME-10培养基 培养环境为37培养箱，饱和湿度,5%CO2,0.25%的胰 -酶0.02EDTA消化传代细胞。二、Akt1干扰载体的构建 慢病毒载体plko.1-puro质粒与已设计好的干扰序列 Akt1-1、Akt1-2和小鼠已知基因无同源性的DNA干扰序列为阴性对照（表1)合成的寡核苷酸退火形成双链DNA片断，克隆到U6启动子下游的EcoRI和Age

5、I酶切位点(EcoRI和AgeI酶切位点之间原先存在(cnzi)约1800bp的无关DNA片断），转入大肠杆菌DH5。EcoRI和AgeI双酶切筛选得到阳性克隆pLKO.1-siAkt1-,pLKO.1-siAkt1-1-2和pLKO.1-Control,并测序验证。第4页/共19页第四页，共20页。第5页/共19页第五页，共20页。三、Akt1沉默细胞株的构建:用磷酸钙法转染HEK293T细胞并经过嘌呤霉素筛选获得稳定的细胞株4T1-siAkt1-1、4T1-siAkt1-2和对照细胞株4T1-control.四、定量PCR和免疫印迹分析五、MTT法检测细胞增殖活性:分别将对数生长期的组乳腺

6、癌细胞4T1-Control,4T1-siAkt1-1和4T1-siAkt1-2用0.25%胰酶消化,DMEM配制成单细胞悬液,接种(jizhng)于96孔板中,每组孔,每孔约1104个细胞，体积100l, 置于5%CO2,37培养48h。每孔加入20l MTT溶液(5mg/ml),37孵育4h,吸出培养基上清，150lDMSO充分溶解。酶标仪测定吸光度(A)(测定波长570nm，参比波长630nm)实验重复次。第6页/共19页第六页，共20页。六、六、TranswellTranswell法测定细胞法测定细胞(xbo)(xbo)迁移力迁移力 实验中采用6.5mm直径,10m厚度,8m孔径的聚碳

7、酸酯多孔滤膜。取对数生长期细胞，胰酶-EDTA消化收集细胞，离心(1000r/minx5min)弃上清,血清DMEM洗涤次，加入无血清DMEM，细胞计数，用无血清培养基重悬细胞至5x105个细胞/ml；上室每孔加入10l细胞悬液,下腔室中加入600l含Fn的培养基,37培养箱中培养24；取出Transwell并用PBS洗次，5%戊二醛4固定(gdng)0.5h；PBS洗遍，加入结晶紫(0.1)室温染色0.5h；PBS洗遍，用脱脂棉擦去上表面细胞，显微镜下观察，取个视野照相，计数记录。实验重复至少次，结果相似。第7页/共19页第七页，共20页。七、体内原位瘤生长和肺转移七、体内原位瘤生长和肺转移

8、(zhuny)试验试验 实验用810周龄的雌性BALB/c小鼠。先将4T1-Control，4T1-siAkt1-1和4T1-siAkt1-2细胞(xbo)在指数增长期时消化下来，用PBS充分清洗后用DME-10培养基重悬并计数(5x107/ml)将小鼠分为组，每组11只。用戊巴比妥钠(50mg/kg体重)麻醉小鼠，在每只小鼠的第五对乳腺各接种10l细胞(xbo)。周后，处死并称取原位瘤重量，观察肺表面转移结节数，并作统计学分析。实验重复次。第8页/共19页第八页，共20页。Akt1干扰载体(zit)pLKO.1-Control，pLKO1.1-siAkt1-1 和pLKO.1-siAkt1-

9、2的酶切鉴定电泳图谱第9页/共19页第九页，共20页。定量(dngling)PCR检测4T1-control，4T1-siAkt1-1和 4T1-siAkt1-2细胞中Akt1mRNA表达量第10页/共19页第十页，共20页。免疫(miny)印迹检测4T1-Control，4T1-siAkt1-1和4T1-siAkt1-2细胞中Akt1蛋白表达量第11页/共19页第十一页，共20页。MTT法检测4T1-Control，4T1-siAkt1-1和4T1- siAkt1-2细胞的增殖(zngzh)能力第12页/共19页第十二页，共20页。4T1-Control ，4T1-siAkt1-1和4T1-

10、siAkt1-2细胞(xbo)荷瘤小鼠的原位瘤重量第13页/共19页第十三页，共20页。Transwell法检测(jin c)4T1-Control， 4T1-siAkt1-1和4T1-siAkt1-2的细胞迁移能力第14页/共19页第十四页，共20页。4T1-Control,4T1-siAkt1-1和4T1-siAkt1-2细胞的 肺转移(zhuny)能力第15页/共19页第十五页，共20页。经费经费(jngfi)预算预算 小鼠乳腺癌细胞株4T1 DME-10培养基 干扰(gnro)序列 Transwell板 BALB/c小鼠99只 Trizol试剂盒 抗鼠或兔的IgG二抗(Santa Cr

11、uz)和ECL-detecting reagent第16页/共19页第十六页，共20页。参考文献：中国生物工程杂志(zzh)China，Biotechnology 2009，29(3)：149刘海艳顾玉超宓文义于文功JU X，Katiyar S，Wang C,et al. Akt1 governs breast cancer progression in vivo.Proc Natl Acad Sci USA,2007,104:74387443第17页/共19页第十七页，共20页。谢谢(xi xie)第18页/共19页第十八页，共20页。感谢您的观看(gunkn)！第19页/共19页第十九页，共20页。NoImage内容(nirng)总结立项依据。作为一种原癌基因,Akt1在许多人类肿瘤中表达显著增高(znggo)，促进肿瘤转移。与以上结果相一致,Akt1沉默不影响乳腺癌形成原位瘤的能力，但显著降低其体内肺转移能力。细胞培养用培养基为DME-10培养基。刘海艳顾玉超宓文义于文功。感谢您的观看第二十页，共20页。