改分子生物学实验实验操作

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1、改分子生物学实验实验操作 应掌握的实验技术应掌握的实验技术 酶切酶切,连接连接 凝胶回收凝胶回收 制备感受态细胞制备感受态细胞 质粒提取质粒提取 PCR 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 考察指标考察指标 电泳、蓝白斑数电泳、蓝白斑数量量 电泳电泳 感受态细胞转化感受态细胞转化率率 电泳电泳 电泳电泳 电泳电泳第1页/共36页rhIL-18rhIL-18基因的基因的PCRPCR产物产物质粒质粒pUC18pUC18BglBgl和和PstPst双双酶切酶切BamHBamH和和PstPst双双酶切酶切浓度浓度1%1%琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳凝胶回收与溶液回收凝胶回收与溶液回收电泳检验电泳检验T4T4

2、连接酶连接酶连接过夜连接过夜配制配制 LB LB 液体与固体平板培养基液体与固体平板培养基灭菌灭菌3737过夜培养过夜培养 E .E .colicoli JM109 JM109菌株菌株第2页/共36页CaClCaCl2 2 法制备法制备E.Coli E.Coli JM109JM109感受态细胞感受态细胞实验组连接实验组连接体系体系4242热激转化热激转化90s90s3737温柔孵育温柔孵育45min45min涂布平板涂布平板3737过夜倒置培养过夜倒置培养第3页/共36页观察阴性对照组观察阴性对照组菌落生长情况菌落生长情况有无菌落有无菌落挑取挑取1 1白色单菌落白色单菌落3737液体培养基液体

3、培养基过夜培养过夜培养观察阳性对照组观察阳性对照组菌落生长情况菌落生长情况统计菌落数量统计菌落数量计算感受态细胞计算感受态细胞转化效率转化效率观察实验组菌观察实验组菌落生长情况落生长情况统计蓝斑，白斑统计蓝斑，白斑菌落数量菌落数量观察空菌对照组观察空菌对照组菌落生长情况菌落生长情况统计菌落数量统计菌落数量第4页/共36页提取质粒提取质粒DNADNA浓度浓度1%1%琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳PCRPCR浓度浓度1%1%琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳第5页/共36页L rhIL-18的PCR产物 目 的 基 因 6 . 8 L 无 菌 水 9 L B S A 0 . 2 L B g l 2 L P

4、 s t 2 L 质粒pUC18 质 粒 1 0 L 无 菌 水 6 L B a m H 2 L P s t 2 L37酶切反应3小时。第6页/共36页第7页/共36页 LB液体培养基 每1L配量： 蛋白胨 10g 酵母提取物 5g 氯化钠 5g 滴加0.2mL 5mol/L NaOH ，调节pH值至7.0 LB固体培养基: 每100ml液体培养基添加1.5g琼脂 每组准备： 3个30ml 液体培养基 120ml 固体培养基第8页/共36页灭菌灭菌 5个培养皿 3个30ml LB 液体培养基 1个120ml LB 固体培养基 一个50ml 离心筒 微量移液器枪头第9页/共36页 琼脂糖凝胶电泳

5、是分离鉴定和纯化DNA 片段的标准方法。 DNA 的分子大小 琼脂糖浓度 DNA 分子的构象 电源电压 嵌入染料的存在 离子强度影响 琼脂糖凝胶制作图示第10页/共36页琼脂糖凝胶的配制琼脂糖凝胶的配制 称取0.3g琼脂糖，加入30ml 1TAE缓冲液，于微波炉中加热沸腾3次。 取出稍冷后加入3L基因染料，混匀。 将凝胶倒入调平的凝胶板上，插入梳子。 冷却。第11页/共36页琼脂糖凝胶电泳检验，回收酶切产物：使用UNIQ-10柱式凝胶回收试剂盒柱式凝胶回收试剂盒分别对： 目的基因片段（0.5Kb片段）溶液回收 载体片段（2.7Kb片段）进行凝胶回收第12页/共36页1.柱平衡步骤：向吸附柱CA

6、2中（吸附柱放入收集管中）加入500L平衡液BL，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。2.将单一的质粒条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分）放入干净的离心管中，称取重量。3.向胶块中加入3倍体积胶液PN（如凝胶重为0.1g，其体积可视为100L，依此类推）。50水浴放置10min，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。如果还有未溶的胶块，可再补加一些溶胶液或继续放置几分钟，直至胶块溶解（若胶块的体积过大，可事先将胶块切成碎块）。（将目的基因体积补至50L，由此步平行操作。）注意：胶块完全溶解后最好将胶溶液温度降至室温再上柱，因为吸附柱在较

7、高温度时结合DNA的能力较弱。第13页/共36页4.将上一步所得溶液加入一个吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中），室温放置2min，12000rpm离心30-60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。 注意：吸附柱容积为800L，若样品体积大于800L可分批加入。5.向吸附柱CA2中加入700L漂洗液PW，12000rpm离心30-60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。6.向吸附柱CA2中加入500L漂洗液PW，12000rpm离心30-60s，倒掉废液。第14页/共36页7.将吸附柱CA2放回收集管中，12000rpm离心2min，尽量除尽漂洗液。将吸附柱CA

8、2置于室温放置数分钟，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验。 注意：漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验。8.将吸附柱CA2放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加10L洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12000rpm离心2min收集DNA溶液。再向吸附膜中间位置悬空滴加10L洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12000rpm离心2min收集DNA溶液。 注意:离心管中的EB缓冲液不要倒掉,DNA溶液即为EB缓冲液第15页/共36页平板铺制平板铺制 取出灭菌后的固体培养基 先铺制1个平板(不含Amp)留作空菌对照。 每100ml瓶培养基中加入： IPTG

9、 100ul X-Gal 200ul Amp 100ul 再铺制4个平板第16页/共36页 在灭菌的0.2mL离心管（PCR管）中进行 15L体积反应体系中： 10快速连接缓冲液 1.5L rhIL-18双酶切产物 X L 质粒pUC18双酶切产物 Y L T4-DNA连接酶 0.7L 加水补足15L20连接1h,4连接1h第17页/共36页酶切产物比例换算酶切产物比例换算 连接反应中 目的基因：质粒=3：1 连接反应体系中加入目的基因和质粒酶切片断的体积比=基因的亮度基因的碱基数：质粒的亮度质粒的碱基数基因的摩尔 质粒的摩尔：=基因的体积质粒的体积：3基因的碱基数质粒的亮度基因的亮度质粒的碱

10、基数第18页/共36页（1）E.coli JM109菌株37过夜培养以复苏菌种，取过夜培养的菌液0.5mL加入到30 mL LB培养基中，37，230 r/min振荡培养3 h，至OD600约为0.4左右。（2）无菌条件下，将30mL菌液转移至50mL离心管中，冰上放置10 min，使培养物冷却至0。（3）在预冷4的离心机上以4000r/min离心10min，弃去上清，加入10mL预冷的0.1mol/L CaCl2溶液重悬沉淀，冰浴上放置10 min。（4）以4000r/min在4离心10min，弃去上清，每30mL初始培养物用1.0mL预冷的0.1mol/LCaCl2溶液重悬细胞沉淀，200

11、L/管分装。第19页/共36页（1）向分装有200LE.coli JM109菌株感受态细胞的EP管中加入10L的上步中得到的连接混合物，轻轻旋转以混合内容物，冰浴上放置30 min实验组 10L连接混合物阳性对照 2L pUC18（浓度0.05g/L）阴性对照 10L 无菌水空菌对照 10L 无菌水第20页/共36页（2）将该EP管放入预加温至42的水浴中，放置90s，快速转移到冰浴中，使细胞冷却12 min。 （3）向EP管加入800 L LB培养基，转移至37摇床上，150r/min，温育45 min以复苏菌株。第21页/共36页（4）涂布前将相应培养物进行稀释。每两组共用2个空菌对照，分

12、别稀释10-5 、10-6 ，将上述培养物各200L分别加到不含有氨苄的LB平板上；每组各做2个阳性对照，分别稀释10-2 、10-3，将上述培养物各200L分别加到含有氨苄的LB平板上；每组阴性对照不需稀释，直接将200L上述培养物加到含有氨苄的LB平板上；每组实验组培养物取原液，将上述培养物各200L分别加到含有氨苄的LB平板上。用涂布器将以上转化细胞分别地轻轻涂布于琼脂平板表面。（5）将平板置于室温下至液体被完全吸收，倒置平皿，37过夜培养。第22页/共36页 转化子总数阳性对照阳性对照菌落数稀释倍数转化反应原液总体积涂板菌液体积 转化频率（转化子数每mg质粒DNA）转化子总数质粒DNA

13、加入量(mg) 感受态细胞总数空菌对照空菌对照菌落数稀释倍数菌液总体积涂板菌液体积 感受态细胞转化效率转化子总数感受态细胞总数第23页/共36页1柱平衡步骤：向吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中）加入500l的平衡液BL，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。2.取1.4ml过夜培养的菌液，加入EP管中，12,000rpm离心1min，尽量吸除上清。3.向留有菌体沉淀的离心管中加入250l溶液P1，使用移液器或漩涡振荡器彻底悬浮细菌沉淀。注意：如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。4.向离心管中加入250l溶液P2，温和地上下翻转6-

14、8次使菌体充分裂解。注意：温和地混合，不要剧烈震荡，以免打断基因组DNA，造成提取的质粒中混有基因组DNA片段。此时菌液应变得清亮粘稠，所用时间不应超过5min，以免质粒受到破坏。如果未变清亮，可能由于菌体过多，裂解不够彻底，应减少菌体量。第24页/共36页5.向离心管中加入350l溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。12,000rpm离心10min，此时在离心管底部形成沉淀。注意：P3加入后应立即混匀，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。6.将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中），尽量不要吸出沉

15、淀。12,000rpm离心30-60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。7.向吸附柱CP3中加入600l漂洗液PW，12,000rpm离心30-60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。8.向吸附柱CP3中加入600l漂洗液PW，12,000rpm离心30-60s，倒掉收集管中的废液。第25页/共36页9.将吸附柱CP3放入收集管中，12,000rpm离心2min，将吸附柱中残余的漂洗液去除。 注意：漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验。建议将吸附柱CP3开盖，置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。10.将吸附柱CP3置于一个

16、干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加75l洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12,000rpm离心1min，将质粒溶液收集到离心管中。第26页/共36页第27页/共36页1、调整模板（、调整模板（ 待鉴定质粒）浓度至待鉴定质粒）浓度至 5 ng/ L2、按下列体系配制反应混合液，混匀，、按下列体系配制反应混合液，混匀， Template DNA 1.0 L 10 PCR buffer 2.0 L MgCl2（25mmol/L） 1.5 L M13 Primer M4 (10mol/L) 0.5 L M13 Primer RV(10mol/L) 0.5 L dNTPs （2mmol/L） 2.

17、0 L Taq酶 （5U/L） 0.5L 加ddH2O至 20L外源基因的特异引物：外源基因的特异引物：引物引物M13 Primer M4:（5-GTTTTCCCAGTCACGAC-3） 引物引物M13 Primer RV: （ 5-CAGGAAACAGCTAAC-3）第28页/共36页3PCR 反应循环条件设置 94变性反应30s； 45退火反应30s； 72延伸反应30s。 进行20个循环后，最后一个循环72延长至10min。 4、检测 加 2L 6 Loading Buffer和10L 反应产物，混匀，取15L 反应产物点样电泳。5、成像分析 在 1% 的琼脂糖凝胶上点样电泳0.51h，

18、电泳结束后EB 染色1520min，凝胶成像分析结果。第29页/共36页rhIL-18rhIL-18基因的基因的PCRPCR产物产物质粒质粒pUC18pUC18BglBgl和和PstPst双双酶切酶切BamHBamH和和PstPst双双酶切酶切浓度浓度1%1%琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳凝胶回收与溶液回收凝胶回收与溶液回收电泳检验电泳检验T4T4连接酶连接酶连接过夜连接过夜配制配制 LB LB 液体与固体平板培养基液体与固体平板培养基灭菌灭菌3737过夜培养过夜培养 E .E .colicoli JM109 JM109菌株菌株第30页/共36页 LB液体培养基 每1L配量： 蛋白胨 10g 酵

19、母提取物 5g 氯化钠 5g 滴加0.2mL 5mol/L NaOH ，调节pH值至7.0 LB固体培养基: 每100ml液体培养基添加1.5g琼脂 每组准备： 3个30ml 液体培养基 120ml 固体培养基第31页/共36页琼脂糖凝胶的配制琼脂糖凝胶的配制 称取0.3g琼脂糖，加入30ml 1TAE缓冲液，于微波炉中加热沸腾3次。 取出稍冷后加入3L基因染料，混匀。 将凝胶倒入调平的凝胶板上，插入梳子。 冷却。第32页/共36页平板铺制平板铺制 取出灭菌后的固体培养基 先铺制1个平板(不含Amp)留作空菌对照。 每100ml瓶培养基中加入： IPTG 100ul X-Gal 200ul A

20、mp 100ul 再铺制4个平板第33页/共36页第34页/共36页1、调整模板（、调整模板（ 待鉴定质粒）浓度至待鉴定质粒）浓度至 5 ng/ L2、按下列体系配制反应混合液，混匀，、按下列体系配制反应混合液，混匀， Template DNA 1.0 L 10 PCR buffer 2.0 L MgCl2（25mmol/L） 1.5 L M13 Primer M4 (10mol/L) 0.5 L M13 Primer RV(10mol/L) 0.5 L dNTPs （2mmol/L） 2.0 L Taq酶 （5U/L） 0.5L 加ddH2O至 20L外源基因的特异引物：外源基因的特异引物：引物引物M13 Primer M4:（5-GTTTTCCCAGTCACGAC-3） 引物引物M13 Primer RV: （ 5-CAGGAAACAGCTAAC-3）第35页/共36页