乳酸菌的生理生化特性.

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1、1. 形态和培养特征观察采用牛肉膏蛋白胨培养基 ,将已纯化后的甘油菌种活化后于 37下培养 20 24h , 并进行革兰氏染色及菌体形态和菌落特征的观察。染色方法参照微生物鉴定实验指导2. 生长条件试验(1)耐盐性试验 (NaCl浓度 :0. 85、1.20 和1. 71) (mol/ L) ;(2)耐酸碱试验 (p H :4.3 、5.7、6. 8 、8.4 、8.6 和8.7);(3) 温度梯度试验 ( 温度 : 10 、 30 、 40、 50 、 55、 60和 65 ) 。分别将参试菌接种于以上处理的液体培养基中培养48 h , 记录生长状况。3. 生理生化试验过氧化氢酶测定将实验菌

2、接种于PGY 培养基斜面上 ,37 培养 20h 24h, 取一环接种的培养物 ,涂于干净的载玻片上 ,然后在其上滴加 3% 15% 的过氧化氢 ,有气泡则为阳性反应,无气泡为阴性反应。葡萄糖产酸产气实验在 PY 基础培养基内加入30g 葡萄糖和 5% 吐温 -80,1.6g/100mL的溴甲酚紫 1.4mL 作指示剂 , 在培养基内放置一小倒管 ,分装试管置 37培养 24h, 经培养后 , 指示剂变黄表示产酸,倒管内出现气泡 ,表示产气。淀粉水解实验接种新鲜的菌种于含有0.5g 可溶性淀粉的 PY 基础培养基中 ,取少许培养液于比色盘内,同时取未接种的培养液作对照 ,分别在其中加入卢哥氏碘

3、液.不显色表示淀粉水解 ,显蓝黑色或蓝紫色时 ,表示淀粉未水解或水解不完全。明胶液化实验将实验菌接种于明胶基础培养基中,置 37 培养 ,以一支未接种的试管作为对照。 将接种的和未接种的对照管置于冰箱或冷水中 ,等待对照管凝固后记录实验结果,反复观察对比多次。如对照管凝固时,接种管液化为阳性反应,凝固为阴性反应甲基红（ M.R ）试验接种实验细菌于PYG 培养基，于 37 培养2 天后，于培养物中加入几滴甲基红酒精溶液，如呈红色， 表示阳性。乙酰甲基甲醇V-P 实验接种新鲜的实验菌种于培养基中, 37 培养2 天后 ,取培养液 1mL 在其中加入 1ml 10 的 NaOH ，混匀，再加入 3

4、 4 滴 2% 氯化铁溶液。数小时后，培养基表面的下层出现红色者，为阳性柠檬酸盐取幼龄菌种接种于柠檬酸盐斜面培养基上，适温培养3 7 天，培养基呈碱性（蓝色）者为阳性反应，不变者则为阴性酪素水解试验牛奶平板的制备： 取 5g脱脂奶粉加入 50mL蒸馏水中（或用 50mL 脱脂牛奶） ，另称 1.5g琼脂溶于 50mL蒸馏水中，将两液分开灭菌。待冷至45 50 时，将两液混匀倒平板，即成牛奶平板。将平板倒置过夜，使表面水分干燥，然后将菌种点接在平板上，每皿可点接3 5 株菌。适温培养 1 、3 、5 天，记录菌落周围和下面酪素是否已被分解而呈透明。配制该培养基时，切勿将牛奶和琼脂混合灭菌，以防牛

5、奶凝固厌氧生长测定将菌种接入营养肉汤平板后,用密封带包好放入 CO2 培养箱 37培养 2 天后 , 观察生长情况 ,生长则为阳性(10) 厌氧硝酸盐产气接种封油：以斜面菌种用接种环接种后，用凡士林油（凡士林和液体石蜡为1:1 ）封管，封油的高度约1 厘米。必须同时接种不含有硝酸钾的肉汁胨培养液作对照。观察结果：培养 2 7d，观察在含有硝酸钾的培养基中有否生长和产生气泡。如有气泡产生，表示反硝化作用产生氮气，为阳性反应。但如不含硝酸钾的对照培养基也可产生气泡，则只能按可疑或阴性处理。(11) 石蕊牛奶的反应1牛奶中主要含有乳糖和酪蛋白，在牛奶中加入石蕊是作为酸碱指示剂和氧化还原指示剂。石蕊在

6、中性时呈淡紫色，酸性时呈粉红色， 碱性呈蓝色， 还原时则自上而下地褪色变白。 观察其产酸、 产碱、胨化、酸凝固、 凝乳酶凝固、还原情况(12) 糖发酵实验将需要测定的糖或醇类等碳水化合物加入PY 基础培养基中,按表分装含5mL 培养基的试管.分别取 0.2mL, 被鉴定菌株接到灭菌后的碳水化合物培养基中 37 培养 24h, 振荡培养。 检测时取培养液少许置于比色盘内 ,同时取未加碳水化合物的 PY 培养液作为对照 ,滴加试剂比较颜色的变化 ,记录产酸的强弱 .附一些培养基： PY 培养基（ 100mL ）：蛋白胨 1.0g, 酵母提取物 1.0g, 无机盐溶液 4.0mL 盐溶液成分 : 无

7、水 CaCl20.2g,MgSO420.0g ,K2HPO41.0g, ,KH2PO41.0g,NaHCO3 10.0g,NaCl 2.0g(将 CaCl2 和 MgSO4 一起溶解于 300mL 蒸馏水中 ,再加 500mL 蒸馏水 ,一边搅拌一边缓慢加入其他盐类.继续搅拌直到全部溶解 ,加蒸馏水定容至1000mL,混合后贮备于 4 ) PYG 培养基 :PY 在基础培养液内加入1.0g 葡萄糖营养明胶蛋白胨 5g 、牛肉膏3g、明胶 120g 、蒸馏水 1000mL 、pH6.8 7.0 ；加热溶解、 校正至 pH7.4 7.6 ，分装小管，121 高压灭菌 10min ，取出后迅速冷却，

8、使其凝固。复查最终pH 应为 6.8 7.0柠檬酸盐斜面培养基：柠檬酸钠3gNH4H2PO4 1gMgSO40.2gK2HPO4 1gNaCl 5g琼脂 15 20g水 1000mL 加热溶解后， 调 pH 至 7，再加入 1.6% 溴麝香草酚蓝指示剂10mL, 培养基呈绿色，分装试管，每管5mL ， 121 灭菌 30min含硝酸钾的营养肉汤加入 2g硝酸钾入营养肉汤4.16S rDNA序列分析这个 LZ 另外查好了，很多学问。5. 生长曲线活菌计数方法：采用涂布法, 进行菌落计数，每隔一段时间（2-4 小时）测实验九细菌的生理生化试验 日期： 2009-5-30来源：作者：孔庆学 字体：大

9、中 小实验九细菌的生理生化试验1 目的1.1 了解细菌鉴定中常用的生理生化试验反应原理1.2 掌握测定细菌生理生化反应的技术和方法2 原理各种微生物在代谢类型上表现了很大的差异。 由于细菌特有的单细胞原核生物的特性， 这种差异就表现的更加明显。不同细菌分解、 利用糖类、脂肪类和蛋白类物质的能力不同， 所以其发酵的类型和产物也不相同， 也就是说，不同微生物具有不同的酶系统。 即使在分子生物学技术和手段不断发展的今天，细菌的生理生化反应在菌株的分类鉴定中仍有很大作用。3 材料3.1 菌种大肠埃希氏菌（ Escherichia coli）、产气肠杆菌（ Enterobacter aerogenes）

10、、普通变形杆菌2（ Proteus vulgaris）、枯草芽孢杆菌（ Bacillus subtilis ）的斜面菌种3.2 培养基葡萄糖蛋白胨水培养基、蛋白胨水培养基、糖发酵培养基（葡萄糖、乳糖或蔗糖）3.3 试剂40 NaOH 溶液、肌酸、甲基红试剂、吲哚试剂、乙醚、1.6%溴甲基酚紫指示剂。3.4 器具超净工作台、恒温培养箱、高压灭菌锅、试管、移液管、杜氏小套管。4 流程糖发酵试验 V-P 试验 甲基红试验 吲哚试验5 步骤(一)糖类发酵试验1 目的了解不同细菌分解利用糖的能力及实验原理，并掌握其操作方法2 原理可根据细菌分解利用糖能力的差异表现出是否产酸产气作为鉴定菌种的依据。 是否

11、产酸，可在糖发酵培养基中加入指示剂溴甲酚紫（即 B.C.P 指示剂，其 pH 在 5.2 以下呈黄色， pH 在 6.8 以上呈紫色），经培养后根据指示剂的颜色变化来判断。是否产气， 可在发酵培养基中放入倒置杜氏小管观察。3 材料3.2菌种大肠埃希氏菌（ Escherichia coli）、产气肠杆菌（ Enterobacter aerogenes）、普通变形杆菌（ Proteus vulgaris）的斜面菌种3. 培养基葡萄糖、蔗糖和乳糖发酵培养液试管 流程发酵液试管 标记 接种 培养观察记录5 步骤5.1 试管标记图9-1 糖发酵产气取分别装有葡萄糖、蔗糖和乳糖发酵培养液试管各 不产气；

12、产气4 支，每种糖发酵试管中均分别标记大肠杆菌、产气肠杆菌、普通变形菌和空白对照。5.2 接种培养以无菌操作分别接种少量菌苔至以上各相应试管中， 每种糖发酵培养液的空白对照均不接菌。 将装有培养液的杜氏小管倒置放入试管中（图 9-1），置 37恒温箱中培养，分别在培养 24h、48h、和 72h 观察结果。5.3 观察记录与对照管比较，若接种培养液保持原有颜色， 其反应结果为阴性，表明该菌不能利用该种糖， 记录用“”表示；如培养液呈黄色，反应结果为阳性，表明该菌能分解该种糖产酸，记录用“ ”表示。培养液中的杜氏小管内有气泡为阳性反应， 表明该菌分解糖能产酸并产气，记录用 “”表示； 如杜氏小管

13、内没有气泡为阴性反应，记录用 “”表示。（二） 乙酰甲基甲醇试验 (V P 试验 )1 目的了解鉴别不同肠杆菌科各菌属的乙酰甲基甲醇试验原理，并掌握其操作方法2 原理某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养液中能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸缩合，脱羧成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中氧，氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称V3P（ +）反应。3 材料3.1 菌种大肠埃希氏菌（ Escherichia coli）、产气肠杆菌（ Enterobacter aerogenes）、普通变形杆菌（Proteus vulgaris）、枯草芽孢杆菌（ Bacillus subtilis ）的斜

14、面菌种3.2 培养基葡萄糖蛋白胨培养液的试管 流程培养液试管 标记 接种 培养观察记录5 步骤5.1 标记试管取 5 支装有葡萄糖蛋白胨培养液的试管，分别标记大肠杆菌、 产气肠杆菌、普通变形菌、枯草芽孢杆菌和空白对照。5.2 接种培养以无菌操作分别接种少量菌苔至以上相应试管中， 空白对照管不接菌， 置 37恒温箱中，培养 2448h。5.3 观察记录取出以上试管，振荡 2min。另取 5 支空试管相应标记菌名，分别加入 3 5ml 以上对应管中的培养液，再加入 40 NaOH 溶液 1020 滴，并用牙签挑入约 0.5 1mg 微量肌酸，振荡试管，以使空气中的氧溶入，置 37恒温箱中保温 15

15、30min 后，若培养液呈红色，记录为 V.P.试验阳性反应（用 “ ”表示）；若不呈红色，记录为 V.P.试验阴性反应（用 “”表示）。注意：原试管中留下的培养液用作甲基红试验。（三） 甲基红试验（ M.R. 试验）1 目的了解鉴别肠杆菌科各菌属的甲基红试验原理，并掌握其操作方法2 原理肠杆菌科各菌属都能发酵葡萄糖，在分解葡萄糖过程中产生丙酮酸，进一步分解中， 由于糖代谢的途径不同，可产生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，可使培养基 PH 值下降至 pH4.5 以下，使甲基红指示剂变红。3 材料3.1 菌种同 VP 试验3.2 培养基同 VP 试验4 流程培养液 指示剂 观察 记录结果

16、5 步骤于 V.P.试验留下的培养液中，各加入23 滴甲基红指示剂，注意沿管壁加入，仔细观察培养液上层，若培养液上层变成红色， 即为阳性反应； 若仍呈黄色， 则为阴性反应， 分别用 “”或“”表示。（四）吲哚试验1 目的掌握吲哚试验 (Ehrlich 法)的原理和方法2 原理有些细菌含有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸生成吲哚 (靛基质 )。吲哚本身没有颜色，不能直接看见，但当加入对二甲基氨基苯甲醛试剂时，该试剂与吲哚作用，形成红色的玫瑰吲哚。3 材料43.1菌种测试菌株3.2 培养基蛋白胨水培养基3.3试剂二甲基氨基苯甲醛溶液、乙醚。4 流程标记试管 接种培养观察记录5 步骤5.1试管标记5

17、 支，分别标记大肠杆菌、产气肠杆菌、普通变形菌、 枯草芽孢杆菌取装有蛋白胨水培养液的试管和空白对照。5.2接种培养5 管作空白对照不接种，置 37恒温箱中培以无菌操作分别接种少量菌苔到以上相应试管中，第养 2448h。5.3 观察记录在培养液中加入乙醚 12ml，经充分振荡使吲哚萃取至乙醚中，静置片刻后乙醚层浮于培养液的上面，此时沿管壁缓慢加入 510 滴吲哚试剂（加入吲哚试剂后切勿摇动试管， 以防破坏乙醚层影响结果观察），如有吲哚存在，乙醚层呈现玫瑰红色，此为吲哚试验阳性反应，否则为阴性反应，阳性用 “”、阴性用 “ ”表示。6 结果记录生理生化反应测定结果7 思考1 以上生理生化反应能用于

18、鉴别细菌，其原理是什么？2 细菌生理生化反应试验中为什么要设对照3 试设计一试验方案，鉴别一株肠道细菌5主要参考文献：熊晓辉 , 王晓飞 ,陆利霞 ,熊强 . 泡菜中乳酸菌的分离、鉴定和生产初试J.中国调味品 ,2004,(11)杨春哲,冉艳红. 乳酸菌在泡菜生产中的应用J.中国食物与营养,2003,(01)李幼筠 .泡菜与乳酸菌J.中国酿造,2001,(04)杨晓晖 , 籍保平 ,李博, 何淑玲.泡菜中优良乳酸菌的分离鉴定及其发酵性能的研究J 食品科学 ,2005,(05) .罗珍兰 , 谢继志 , 吴峻宇 , 吴立军 .对引进乳酸菌胶囊菌种的分离、鉴定和某些生长特性的研究J中国乳品工业,1

19、997,(02) .冉艳红,杨春哲,黄雪松.乳酸菌在果蔬加工中的应用现状与前景J中国调味品 ,2000,(06) .赵文红,黄小丹,范敏华,罗勇.自然发酵泡菜中乳酸菌的分离及特性研究( 一)J广州食品工业科技 , 2003,(01) .李幼筠中国泡菜的研究中国调味品, China Condiment,编辑部邮箱2006年01 期刘屹峰.乳酸菌的生理特性和生物学功能J 丹东纺专学报,2002,(02) .吴蕊, 田洪涛,孙纪录 , 马晓燕 ,韩璞 . 泡菜中优良乳酸菌的分离、鉴定及发酵特性J. 生物加工过程,2009,(03)侯红漫, 宋海波, 刘阳, 肖艳.酸菜汁中乳酸菌的分离, 鉴定及应用J食品科学 ,1997,(01)李凤梅王晓张双灵等自然发酵酸菜汁中乳酸菌分离鉴定中国酿造2008 3刘晓辉陈顺高晓梅等酸菜中乳酸菌的分离筛选与鉴定研究中国酿造2009 2李文斌唐中伟宋敏丽等农家泡菜发酵液中乳酸菌的研究食品工程2009 3葛菁萍邹鹏宋刚等酸菜发酵液中乳酸菌的分离与鉴定食品工业科技2007 106