一种快速制备甲胎蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞系的方法

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1、一种快速制备甲胎蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞系的方法 生殖医学杂志 年月第卷第期技术与方法:./.?.一种快速制备甲胎蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞系的方法丁宁,石心泉,郭永,张瑶楠,邹检平国家人口计生委科学技术研究所内分泌室,北京【摘要】 目的建立一种快速制备甲胎蛋白单克隆抗体?杂交瘤细胞系的方法。 方法 以常规和改良两种方式同时免疫周/小鼠,取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞/融合并行次黄嘌呤、氨基蝶呤与胸苷选择性培养。结果用间接酶链免疫吸附试验法。筛选阳性克隆株,并建立细胞系。 在较短时间内,改良法能获得高效价的免疫抗体,与常规免疫法相比有极显著差异.,同时改良法的细胞融合率和抗体阳性率也显著高于常规免疫法

2、结论 新的改良方法优化了.。筛选获得的高效分泌抗人?的阳性杂交瘤细胞珠进行了初步鉴定。常规的制备中动物免疫程序,并能成功筛选出?杂交瘤细胞系。【关键词】 甲胎蛋白; 杂交瘤; 单克隆抗体?, ?, , ?。 ,门行, ? :.? :/ ./. ? 。 . : . .?.: ?.:?;,:;【回复日期 【收稿日期】【基金项目】国家人计生委科学技术研究所中央级公益性科研院所基本科研业务费专项【作者简介】丁宁,女,内蒙古人,硕士,助理研究员,从事生物化学、分子生物学方面的研究.:.通讯作者万方数据生殖医学杂志 年月第卷第期免疫佐剂快速混匀后注射小鼠腹腔加强免疫,融合甲胎蛋白是一种胎儿特异性糖蛋白,分

3、子量约,道尔顿,在胚胎肝脏和卵 前 作腹腔注射加强免疫。黄囊中合成,正常人血中含量甚微。年有人首 .间接酶链免疫吸附试验法。测定血次报道开放性神经管畸形胎儿、羊水中有高水平的 清的抗体效价:将抗血清、,、,倍系列。若胎儿羊水中值高于均值常见于患无 稀释后,用间接。法进行抗体的检测,采用脑儿或脊柱裂的胎儿,亦见于其他多种畸形,如先天 酶标仪,美国测定,判定标准为:样性肾病、食道或肠闭锁、囊性水瘤、骶尾部畸胎瘤、 品孔。/阴性对照孑 矧,一空白孔。,血型不和、先天愚型、先天性性腺发育不全等。 时的抗体的最大稀释度作为抗血清的抗体年发现母体血清水平的降低与唐氏综合 效价一。征有密切关系一。因此制备高

4、效特异的单克 .细胞融合:按常规杂交瘤技术,用免疫小鼠脾细胞和/瘤细胞行融合。隆抗体具有重要的意义。.杂交瘤细胞的筛选和克隆化:用间接。在的研制过程中,动物免疫是制备过程中的关键步骤。但是传统动物免疫方式通常 法检测杂交瘤细胞培养上清中的,从检测阳需要二个月左右,不但耗时长,而且抗原消耗的量 性的瘤细胞中挑选生长快,分泌抗体效价高,形态良好细胞株,用有限稀释法一连续克隆次,直至大、对抗原纯度要求高。本实验试图通过优化传统细胞建株。免疫小鼠的方法,大大缩短动物免疫时间并减少了抗原的消耗量,为进一步组装患者肿瘤组织及血清 .?的效价评估:用间接。法中水平检测的试剂盒打下良好的基础,为临床 测定杂交

5、瘤细胞培养上清和小鼠腹水中的研究、肿瘤的诊治提供更为有效的丁.具。 效价。.的稳定性:以。试验观察材料与方法腹水和纯化在不同保存条件下的活性。一、材料 .杂交瘤细胞染色体观察:按常规方法制备细购自上海领潮公司。/骨髓瘤细胞 胞涂片,染色后镜检。,计数分裂相细胞的中科院上海细胞库。 染色体数。三、统计学方法周龄/小鼠第四军医大学实验动采用生物学 .版统计软物中心。级。二、方法 件,进行两样本测定和 检验,当.时,差.动物免疫:将只周龄/小鼠随 异具显著统计学意义,当.时,差异具有极机分为两组,每组只,分别命名为号和号第 显著统计学意义。一组、号和号第二组。第一组按常规免疫方结 果法进行免疫一?,

6、第二组采用改良的免疫方法进行免疫。免疫前静脉采集少量血液,析出血清作为后续 一、两种免疫方式小鼠血清效价比较对两组试验动物在完成了基础免疫后,尾静脉检测的阴性对照血清。采集少量血液,分离血清,进行间接测定抗第一组:肚与等量福氏完全佐剂体效价,检测结果见图。,美国混合,充分乳化后注入周龄/小鼠腹腔,周后用同量抗原加不完全福氏 由图中数据可知,新的改良免疫方法,在第二次免疫后,抗体效价即达到:。两组数据经生物佐剂,美国腹腔注射,周后用同量抗原加学统计软件 .版进行检验,不完全福氏佐剂腹腔注射,融合前 作腹腔注射统计结果差异极显著.。加强免疫。二、两种免疫方式小鼠融合率比较第二组:取“ 以稀释至肛,

7、取在细胞融合后约 可见孔内杂交瘤细胞肚免疫佐剂北京康碧生物科技有限公司快速混匀后,注射于周龄的/小鼠腹腔,完 生长,当细胞融合成片达孔底面积的%/只的剂量与” 时,用检测特异性抗体。两组免疫小鼠细胞成初次免疫;周后以/万方数据生殖医学杂志年月第卷第期著。改良法耗费时间短,但获得的抗体效价更高。由于改良免疫法只需二次基础免疫而常规免疫四 九法则需要倍于改良法的免疫次数,所以改良法抗原用量明显少于常规法,从而大大减少了实验成本的消耗。此外,本实验通过对比两种免疫方法的细胞融. 几五?九山?凼几悯悟 几?旧合率及抗体阳性率,发现改良免疫法均显著高于常厂一一阴性 弓阳性 号 号 譬规免疫法。血清血清经

8、过后续实验,证明改良法免疫小鼠的杂交瘤、号小鼠为常规免疫,、号小鼠为改良免疫图 间接测定血清抗体效价耽。 细胞经二次克隆化后,抗体阳性率可达检测孔的%以上。杂交瘤细胞体外连续传代培养,并冻存融合结果见表。复苏后仍具有分泌?的能力,并经染色体两组小鼠的细胞融合率和抗体阳性率经统计学计数结果表明已成功获得一株?细胞株。检验,差异极显著.。这表明改良法与常规方法具有同样的有效性和稳定性。表两组细胞融合率及抗体阳性率综上所述,新的改良的小鼠免疫方法具有很好实验效果。孕妇血清水平的变化与唐氏综合征有密切关系。目前孕中期人绒毛膜促性腺激素联合筛查唐氏综合征胎儿已成为欧美亚许多国家常规服务项目之一,在假阳性

9、率为%左右情况下,这种筛查方案对唐氏综合征的检出率注:与第一组比较,.可以达%。因而免疫方法测定血清中浓度已在临床得到广泛应用。羊水和母三、杂交瘤分泌的稳定性体血清中浓度的升高,对胎儿神经管缺陷和杂交瘤细胞体外连续传代培养了个月,培养其他遗传缺陷的产前诊断,也具有应用价值。在上清经检测能持续分泌抗?,杂大多数原发性肝细胞癌和内胚窦癌患者血清中交细胞经液氮冻存一年后细胞复苏培养生长良好,浓度升高,检测有助于肿瘤的早期诊仍能保持分泌抗?的能力。断,也是在治疗过程中观察疗效的一项指标。采四、杂交瘤细胞染色体计数用本实验新改进的方法制备?,对胚胎杂交瘤细胞染色体总数为条,发育、癌变过程中基因表达、的纯

10、化、肝癌的/骨髓瘤细胞染色体总数为条,/小导向治疗以及提供诊断试剂等都有重要的实际应鼠脾细胞染色体总数为条,符合杂交瘤特征。用意义 。讨 论【参 考 文 献】动物免疫方法对于的制备具有重要的刘继洪,朱海红,陈智,等.人甲胎蛋白基因的克隆和表达意义。本试验在免疫动物时,采用了两种不同的免.科技通报,:卜.疫方法,第一种为常规免疫方法,第二种为参考相关张国英,梁建芳,赵龙凤.检测的临床意义及生物学作用文献后对常规免疫方法加以改进并重新设计的一研究新发现.中国科技论文,:一.种改良免疫方法。邬晋芳,张豫燕,蔡晓宁,等.孕妇血清绒毛膜促性腺激素联合甲胎蛋白产前筛查唐氏综合征的研究.中国儿童保健杂通过动物试验的初步验证,改良免疫方法在免志,:?.疫动物后一个月左右即可获得理想的抗体效价,而吴萌.抗甲胎蛋白单克隆抗体的研制及其在免疫组化中的应常规免疫法则最短需要二个月左右时间才能获得理用.河北省科学院学报,:?.想的抗体效价。经生物学统计软件统计后表明,改邓光荣,蔡中祥.、及法测定的比良免疫法与常规免疫方法获得的抗体效价差异极显 较.长江大学学报,:?.万方数据