胸苷激酶系统血管靶向抗肝癌效应的机制(一)

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1、胸苷激酶系统血管靶向抗肝癌效应的机制(一 )作者：李宝金，张超，周玉梅，郝颖，刘晓平，区庆嘉【关键词】肝肿瘤；KDR 启动子；基因治疗;重组腺病毒；胸苷激酶系统；HepG2 细胞；裸鼠,Balb/c【Abstract】AIM:ToexplorethetherapeuticefficacyandmechanismofHSVtkfortargetingangiogenesisagainsthepatocellularcarcinoma.METHODS:ByusingpAdeasysystem,recombinantadenoviruscontainingkinasedomainreceptor(K

2、DR)orcytomegalovirus(CMV)promotercontrolledHSVtkgene(AdKDRtkandAdCMVtk)wasconstructed.TheviruswasusedtoinfectKDRexpressedhumanumbilicalvenousendothelialcells (HUVEC)andKDRunexpressedHepG2.Followingadministrationofganciclovir(GCV),thesurvivalrateof genetransfectedHUVECandHepG2wasevaluatedbyusingMTTme

3、thod.Hepatocarcinomasweretrans plantedin32Balb/cmicewithHepG2cells,whichweresubsequentlydividedinto4groups:GCVgroup( ),Adgroup(II),AdCMVtkgroup(III)andAdKDRtkgroup(IV).ThenselectiveadministrationofrecombinantadenovirusorAdintratumorallywasperformedinallrats.GCVwasgivenatadoseof100mg/(kg?d)ipinthefol

4、lowingdaysandfor10d.Microvesseldensity(MVD)oftumorinallthetreatedanimalswasch eckedwiththeimmunohistochemicalmethodsandtumorburdenwasassessed10dbeforeandafterthel astGCVadministration.RESULTS:ThepAdeasysystemproducedahightiteroftherecombinantadenovir us (1 1013)pfu/L .Whenthemultiplicityofinfection(

5、MOI)was100,withincreasingGCVconcentrationfrom0upto50mg/L,thesurvivalrateofAdKDRtktransfectedHUVECandHepG2decreasedfrom(90.74.5)%and(91.8 4.3)%to(28.9 5.7)%and(75.4 2.9)%,respectively(P0.01),whilethesurvivalrateofAdCMVtktransfectedHUVECandHepG2declinedfrom100%to(17.6 2.5)%and(23.2 5.7)%,respectively(

6、P0.05).Comparedwithgroup ,therewasadecreaseoftumorweightby(14.7 3.2)%ingroupIIIand(23.6 5.6)%ingroupIV,respectively;andtherewasadistinctdifferencebetweengroupIIIandIV(P0.05).ThemedianMVDwas37.4 8.6，30.6 7.8，27.6 7.1，10.7 4.1(microvessels/mm2)ingroupI,II,IIIandIV,respectively;andthereweresignificentd

7、ifferencesbetweengroupIIIandII(P0.05)，IVandII(P0.01)，IVandIII(P0.01).CONCLUSION:KDRpromoterHSVtkgenemayeffectuallyrestrainthegrowthoftumorvi atargetingangiogenesisofhepatocellularcarcinomawithtreatmentofGCV.【Keywords】liverneoplasms;KDRpromoter;genetherapy;herpesSimplexvirusthymidinekinase;HepG2cells

8、;Mice,Balb/c【摘要】目的：探讨KDR 为启动子的HSVtk 重组腺病毒对肿瘤血管内皮细胞的特异性杀伤效能及机制 .方法： 采用 pAdeasy 系统，构建受 KDR启动子或巨细胞病毒(CMV)启动子调控并可表达 HSVtk 基因的重组腺病毒，体外分别感染人脐静脉血管内皮细胞系（HUVEC）和肝癌细胞系 HepG2，并以 MTT 法检测其细胞增殖情况 .人肝癌皮下移植瘤裸鼠随机分成更昔洛韦组(I)，空载体病毒组 (II) ，重组腺病毒CMVtk 组 (III)及重组腺病毒 AdKDRtk 组(IV).各治疗组瘤内分别注入重组腺病毒液及空载体病毒液.重组腺病毒治疗组在病毒给予24h 后

9、分别 ipGCV，连续 10d.对照组， ipGCV.观察瘤体大小及免疫组化法定量测定肿瘤微血管密度.结果：病毒滴度均为 11013pfu/L.感染复数（ MOI ）为 100 的条件下， GCV浓度由 0 增至 50mg/L 时感染含 AdKDRtk 的 HUVEC 细胞和 HepG2 细胞存活率由 (90.7 4.5)%和 (91.8 4.3)%分别下降至(28.9 5.7)%和(75.4 2.9)%（P0.01），而感染含AdCMVtk 的 HUVEC细胞和 HepG2 细胞存活率分别下降至 (17.6 2.5)%和 (23.2 5.7)%（ P0.05） .体内试验中，与对照组比较，

10、,IV 组经治疗后肿瘤的生长均受到了明显的抑制，其抑瘤率分别为 (14.7 3.2)%和 (23.6 5.6)%（ P0.05） .组织内的平均血管密度（ MVD），组为 37.4 8.，6组为 30.6 7.，8组为 27.6 7.1， IV 组为 10.7 4.1其.中，组与组 (P0.05)，IV 组与组 (P0.01)，IV 组与组 (P0.01)之间比较均有统计学差异 .结论： KDR启动子介导的 HSVtk 具有特异性杀伤肿瘤血管内皮细胞的作用 . 【关键词】肝肿瘤； KDR 启动子；基因治疗 ;重组腺病毒；胸苷激酶系统； HepG2 细胞；裸鼠， Balb/c0 引言1971 年

11、，Folkman 提出肿瘤生长和转移依赖于血管，认为阻断肿瘤血管生成可以成为一种抑制肿瘤生长的方法.原发性肝癌是一种多血管性的肿瘤，因此，抗血管生成对其的治疗有着尤为重要的意义1.血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor ， VEGF)是目前所知最重要的血管形成促进因子，能特异地作用于血管内皮细胞，诱导肿瘤的血管形成.KDR(kinasedomaininsertcontainingreceptor) 是 VEGF两种高亲和力的酪氨酸激酶受体之一，是 VEGF发挥功能的主要受体，它在正常血管内皮细胞中低表达，而在肿瘤血管内皮细胞中高表达 2.因而 KDR

12、是一个具有高度特异性的肿瘤治疗靶点3.利用 KDR启动子在组织中的差异性表达，我们设计由KDR 启动子驱动HSVTK基因靶向特异表达于肝癌血管内皮细胞，通过给予GCV可特异地破坏肝癌血管，达到靶向血管治疗肝肿瘤的目的.1 材料和方法1.1 材料限制性内切酶、T4DNA 连接酶购自Takara公司及 NEC公司 .DMEM 、胎牛血清、 琼脂糖和 Lipofectamine2000 转染试剂盒购自Gibco 公司 .丙氧鸟苷 (ganciclovir,GCV)购自 Roche 公司.抗 KDR抗体、SABCCy3试剂盒及兔抗小鼠CD31 多克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司 .质粒pBlue

13、script KDRtk 来自于第二军医大学东方肝胆医院殷正丰教授实验室.腺病毒系统 pAdeasy 穿梭质粒ptrack ，ptrackCMV 及 pAdeasy 由 JohnHopkins 肿瘤中心BertVogelstein教授惠赠 .人脐静脉血管内皮细胞（ humanumbilicalvenousendothelialcells ，HUVEC）由广州医学院第一附属医院汤庆博士惠赠.人胚胎肾细胞系 HEK293 细胞及肝癌细胞系 HepG2 由本实验室保存 .Balb/c 裸鼠购自南方大学动物实验中心.1.2 方法用 Xho/Sal及 Xho /Hind 两组内切酶分别酶切pBluesc

14、ript KDRtk，各得到一KDRtk 片段和 tk 片段 .然后将其中的KDRtk 及 tk 片段，分别以相同克隆位点插入到穿梭载体ptrack 及 ptrackCMV 中，构建成ptrackKDRtk 与 ptrackCMVtk. 用 Pme酶切使穿梭载体ptrackKDRtk 和 ptrackCMVtk 线性化，然后其转化大肠杆菌BJ5183，与其中预先转入的腺病毒载体 pAdeasy 进行重源重组，分别称为pAdKDRtk 和 pAdCMVtk. 用线性化 (经 Pac酶切 )重组腺病毒AdKDRtk 和 AdCMVtk 质粒分别转染293 细胞，操作步骤按Lipofectamine

15、2000 产品说明书进行 .尔后，收集细胞，反复冻融，遂收集病毒液.最后，病毒液离心纯化并检测其滴度.1.2.1 细胞系血管内皮生长因子受体（KDR）表达的检测将HepG2 或 HUVEC细胞系的细胞悬液，分别滴于培养皿中的盖玻片上培养4h.取出盖玻片， PBS 冲洗，再用乙醇固定 .40g/L 多聚甲醛固定， PBS洗涤 .参照 SABCCY3试剂盒中的说明书，分别进行KDR抗体免疫组化染色 .1.2.2 体外 GCV 敏感实验在96 孔板中分别接种 HUVEC或 HepG2 细胞 (2 103个 / 孔 )，次日加入不同感染复数（ multiplicityofinfection， MOI

16、） (0，1， 10， 100)的 AdKDRtk 或 AdCMVtk 病毒系列稀释溶液 .培养 16后 ,吸尽培养液，实验孔换之以含0，1， 10 或 50mg/LGCV 的新鲜培养液，而对照孔换之以不含GCV的新鲜培养液， 37继续培养5d.采用 MTT 法检测细胞增殖指数 .1.2.3Balb/c 移植瘤模型的治疗调节瘤细胞悬液浓度为5 1010/L每.只小鼠左侧腋部皮下接种HepG2 细胞 0.2mL（瘤细胞1 107） .当肿瘤长至100mm3 时，裸鼠随机分成 4 组（组：GCV；组：空载体病毒；组：pAdCMVTK+GCV；IV 组： pAdKDRTK+GCV），每组 8 只.治

17、疗组瘤体内分别注入重组腺病毒液及空载体病毒液各0.1mL，连用2d.重组腺病毒液治疗的组在 24h 后分别 ipGCV100mg/(kg? d)，连续 10d.对照组， ipGCV100mg/（ kg? d），连续 10d，11d 处死小鼠，取出瘤块，称瘤质量，计算瘤质量抑制率：抑瘤率=(对照组平均瘤质量-治疗组平均瘤质量 )/ 对照组平均瘤质量100%另. CD31 免疫组织化学检测肿瘤微血管密度.微血管计数的方法采用Weidner 方法 .统计学处理： 结果以 xs表示， 采用方差分析比较多组间均数差异，两两比较行LSDt检验，以双侧 P0.05 为有统计学意义.2 结果经 Xho /Sa

18、l， Hind /Xho二组酶切后，各显 2 条片段，分别为 2.2kb 和 3.0kb ；1.8kb和 3.0kb，大小及测序结果与提供资料相符（图 1）.重组 pAdKDRtk 和 pAdCMVtk 经 Pac酶切，显示的2 个片段大小与预期值(4.5kb 和 37.0kb)一致（图2） .重组腺病毒质粒转染293细胞后荧光显微镜下可见细胞有 GFP表达（图 3） .经 3 次 293 细胞内的扩增、 CsCl梯度离心后， 测定病毒滴度为 11013pfu/L.根据免疫组化染色结果可知， HUVEC免疫组化染色阳性的结果， 胞质棕黄染色表达， 而空白对照组阴性表达 （图 4）.HepG2 细胞荧光显微镜下未见荧光表现（图 5） .图 1pBluescript KSKDRtk酶切鉴定图图 2 重组腺病毒质粒 pAdKDRtk 及 pAdCMVtk 酶切鉴定图图 3AdKDRtk 感染 293 细胞 GFP的表达 SP100