10-液相色谱串联质谱联用技术-实验指导

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1、-WORD完美格式编辑液相色谱串联质谱联用仪检测技术实验指导2021、2021 级课程内容一个实验8 学时：1AB Sciex Qtrap 4500三重四级杆/离子阱液相色谱串联质谱联用仪的构造原理、操作及定性定量应用。2利用液相色谱串联质谱联用仪快速测定水果中7 种农药的残留量。XX农业大学农业部参茸质检中心2021.03专业资料整理-WORD完美格式编辑实验一AB Sciex Qtrap 4500三重四级杆/离子阱液相色谱串联质谱联用仪的构造原理、操作及定性定量应用一.实验目的和意义通过学习液质联用仪的构成和使用方法，及其在定性、定量分析中的应用，培养学生使用液质联用仪进展仪器分析的能力，

2、并培养学生严谨的科学态度、细致的工作作风、实事求是的数据报告和良好的实验习惯准备充分、操作规X，记录简明，台面整洁、实验有序，良好的环保和公德意识。培养培养学生的动手能力、理论联系实际的能力、统筹思维能力、创新能力、独立分析解决实际问题的能力、查阅手册资料并运用其数据资料的能力以及归纳总结的能力等。一检测仪器1、仪器名称高效液相色谱串联质谱联用仪简称LC-MS-MS。型号：4500 QTRAP美国Applied Biosystems公司。2、仪器组成液相色谱局部：岛津LC-30A，配有在线脱气机、超高压二元泵、自动进样器；串联质谱局部：QTRAP4500，配有ESI离子源、串联四级杆/线性离子

3、阱。3、主要性能指标离子化方式：ESI电离质量X围：5 1700amu分辨率： 6900质量稳定性：0.1 amu/12h灵敏度：1pg reserpine, ESI+, MRM扫描m/z : 609/195，信噪比S/N 120:1扫描速度：4000 amu/sec质量准确度： 0.01%全质量数X围4、方法原理高效液相色谱二元泵将流动相泵人系统并混合，自动进样器将待测样品注入流动相中，随流动相进入色谱柱，由于样品不同组分在色谱柱中保存时间不同，各组分被分开，依次进入离子源。在离子源中，各组分以ESI或APCI方式电离，被加速后进入质量分析器。4500QTRAP的质量分析器主要由Q1、Q2、

4、Q3三组四级杆串联组成。Q1可将分子离子按质荷比m/z大小分开；Q2是碰撞室，可将母离子进一步破碎为碎片离子；Q3具有四级杆和线性离子阱两种功能，作为四级杆时可将分子离子或碎片离子按质荷比大小分开，作为离子阱还可富集离子从而提高检测灵敏度。各组分的不同离子在质量分析器中被破碎、别离，并按质荷比大小依次抵达监测器，经记录即得到按不同质荷比排列的离子质谱图。4500QTRAP通过串联四级杆/线性离子阱两种不同质谱技术的结合，可以在单次分析中对复杂样本中的单个成分同时进展定性和定量，也可以对多个化合物进展定量分析。整台仪器的控制、数据采集、数据处理、结果输出均由PC计算机Windows操作系专业资料

5、整理-WORD完美格式编辑统支持下的Analyst软件控制完成。二样品1、样品要求本仪器适合分子量在5 1700 amuX围内的有机样品的定性及定量分析。待测样品必须能溶解于水或其它有机溶剂中。假设样品或配制的样品溶液发生沉淀、挥发、变质等异常现象时，应重新取样或重新配制溶液。2、试剂要求所有的试剂均选用色谱纯级，所用水的电导率应大于18K。流动相必须用0.2m或0.45m滤膜过滤前方可使用。3、别离条件要求在液相色谱仪上确定别离条件，使待测组分能完全别离，且该色谱条件中流动相不应含有不挥发性盐，如磷酸盐。三、操作步骤实施检测操作的人员，必须熟悉该仪器的操作规程，仪器的工作状态、包括检测灵敏度

6、和分辨率，必须满足检测工程的要求。1、开机前准备开机前应检查仪器室内电、气的供给情况及空调机的工作状态是否稳定，检查真空机械泵泵油是否需要更换。只有当UPS工作正常，Gas1/Gas2、Curtain Gas和Exhaust Gas的压力分别稳定在0.35、0.35和0.7 Mpa，环境温度为1030，相对湿度小于70%时才能开机。2、开机1)翻开真空机械泵上的电源开关。2)真空机械泵继续工作至少15分钟后，翻开MS电源主开关。3)等真空度到达210-5Torr绿色指示灯不闪后，翻开PC计算机电源3、仪器调谐四、方法建立1.在Analyst软件Tools菜单中选择ProjectCreate P

7、roje。c在tProject name项下输入新建的Project名称。注意，不要点选窗口中的其他按钮！点击OK，确认新建Project。2.在Analyst软件界面下，双击导航栏内Hardware Configuration。在弹出窗口中选择MassOnly，点击Activate Profile，激活MassOnly只联接质谱主机。3.在导航栏内单击Tune and Calibrate，进入调谐模式。点击上方工具条中的T钮。此时，应注意到主机有“扑声音，说明进入调谐状态。此时右下角质谱状态显示绿色。双击Manual Tuning，进入质谱参数设置及运行窗口。4.使用1mL玻璃进样针吸取适当

8、标准溶液，置于进样针座上。点击MS Method下拉菜单，选择Syringe Pump Method，设定针泵流速Flow Rate为10L/min。5.点击Start Syringe Pump按钮开针泵进样。6.返回MS Method，选择扫描模式Scan Type为Q1 MS，设定扫描速度Scan Rate为10Da/s，设定扫描X围StartStop设定为50化合物分子量。DP预输入60。专业资料整理-WORD完美格式编辑7.点击start开场采集数据。运行稳定后，注意观察是否有预期的母离子出现，并控制其响应值在约E4以下。点击stop，选择第一个峰后面是同位素峰的平稳段，双击，选中母离

9、子。点击右键，选择Delete Pane。8.设定Scan type为产物离子扫描Product IonMs2，扫描速度200Da/s，选择扫描正/负离子，输入母离子product of，设定扫描X围startstop为50MW+20，覆盖可能的子离子质量X围，点击compoud标签，设定DP60，CE5。9.点击start，开场采集数据，注意观察是否有预期的母离子出现。手动调节CE，以5eV为步长，逐渐增加。每次增加后稍作等待，直至目标化合物的子离子清晰看见。选择平稳的一段，双击，选择子离子。10.选择Scan Type为MRM。设定参数表格中的Q1对应的母离子，Q3对应的子离子，timem

10、s为50，ID值设为名称1定量，名称2定性。11.点击Edit Ramp，在Parameter下选择Collision Energy，点击OK。点击start开场采集数据，记录每个MRM通道的最正确CE电压。在MRM参数设定表中，右键点击。选择Collision Energy CE，调出表格中的CE列，输入每个MRM通道的最正确CE电压值，准确到个位数。重复以上步骤，在Parameter项下选择Declustering Potential，优化并保存DP。完成后选择菜单File/Save保存采样方法，文件名.dam。五LCMS方法的建立：1、连接仪器：翻开HPLC质谱电源，将HPLC系统接上柱

11、子，将6号出口管线与离子源连好。调离子源喷雾针位置到2mm处，双击Hardware Configure，在硬件配置菜单下单击LCMS (液相与质谱联用)，单击Activate profile激活仪器，会听到笛的一声，说明仪器已经连接上。2、确认液质同步：选择工程之前优化方法的时候已经建立的工程；双击Build acquisitionmethod新建方法，弹出新建方法模板。在模板左侧点击acquisition method，模板右边显示对应的参数，确认synchronization mode选择LC Sync,表示液质同步。3、设置MRM参数：点击方法模板左侧的MRM,在模板右侧Scan Typ

12、e下选择MRM；在polarity下选择化合物极性：Positive(正离子)、Negative负离子；Duration为15min(与液相别离一样的时间)；表格中Q1：母离子分子量，Q3(Da)：子离子分子量，Timemsec：50，ID栏：化合物名称离子对名称后空格加1为定量，空格加2为定性，在表格中右键分别单击DP、CE，点击工具栏的OPEN翻开之前优化的方法参数，调出DP,CE值，选中整行，Ctrl+c(复制)参数，关闭窗口，再Ctrl+v(粘贴)参数；最后点击Edit parameter设置离子源参数：Source/Gas项用以下推荐值：CUR 35，IS:5500(正离子)或-45

13、00负离子，TEM 600，GS1 60，GS270，点击OK。专业资料整理-WORD完美格式编辑4、设置液相参数：点击模板左边的shimadzu LC system，在右边的pumps栏下，设置stop time运行时间为15min，flow流速为1mL/min，A为水相设为95%，B为有机相设为5%设置时改B，A自动，泵最大压力为50；点击time program设置液相梯度：例咪唑类梯度设置：Time(min)AB-95%5%55%95%105%95%10.195%5%1595%5%接着在右边的Auto sampler栏下，设置清洗时间，在Rinse mode下选择Before and

14、after(前后都洗)，并设置清洗时间为5s，清洗液用50%甲醇水。最后点击保存按钮,在保存窗口输入该方法的名称。五数据处理双击翻开Multiquilt，选择工程，点击File下的荧光棒型图标，点击sample，选择需要的标准品和样品数据，点击next，create new method，为方法命名，点击next，选择一个有代表性的样品一般选择浓度较大的标品数据，设置分组同一物质定量离子和定性离子设置为一组，并指定内标，next，对每个物质进展积分。设置积分参数：CausianSmoth平滑：一般是0，如有毛刺可改成1或2；Expeceted Time保存时间:一般不动Expected tim

15、eX围：一般30s，表示在保存时间15sX围最小峰宽最小峰高背景噪音扣除：可调整目标峰基线以下被积分的面积，比例越高积分越往下，必要时调整。分峰因子：峰有分叉时设置，如有两个分叉，设置为2，峰分叉不能大于2单位：设置单位，勾选Apply units to all可将此单位用于所有化合物点击next，点击finish。在新跳出窗口内将标准品选定，输入浓度。查看各化合物积分是否正常，点击第三个图标查看标准曲线。专业资料整理-WORD完美格式编辑实验二利用液相色谱串联质谱联用仪快速测定水果中7种农药的残留量1实验目的：1.1让学生了解利用液相色谱质谱联用仪测定食品、农产品中农药残留等有害化合物的分析

16、流程。1.2利用前2节课所学内容实际处理样品，增强学生实践能力。1.3进一步加强液相色谱质谱联用仪的操作和数据处理。2试剂或材料除非另有说明，仅使用分析纯试剂，水为GB/T 6682规定的二级水。2.1乙腈(C2H3N) ：色谱纯。2.2氯化钠(NaCl)：140枯燥4 h。2.3氨基固相萃取小柱：500 mg/6 mL(或性能相当的其它固相萃取柱)。2.4二氯甲烷-甲醇混合液:二氯甲烷+甲醇体积比= 95 + 5。2.5标准品：见表1。2.6农药标准溶液配制2.6.1标准储藏溶液分别准确称取一定量准确至0.1mg农药标准品，用甲醇溶解，逐一配成1000mg/L的单一农药标准储藏液，密封贮存在

17、-18冰箱中，使用期为6个月。表19种农药标准品农药名称纯度%多菌灵98吡虫啉98啶虫脒98辛硫磷98阿维菌素98克百威98嘧霉胺982.6.2混合农药标准溶液分别准确吸取一定体积的9种农药标准储藏溶液4.8.1注入同一容量瓶中，用甲醇稀释至刻度配制成100 mg/L的混合标准储藏液，-18冰箱中密封闭光保存，使用期为3个月。2.6.3混合标准工作液专业资料整理-WORD完美格式编辑吸取一定体积的混合农药标准储藏液，用甲醇配制成0.01mg/L、0.05 mg/L、0.1 mg/L、0.2 mg/L、1.0 mg/L、5.0 mg/L的7种农药混合标准工作液，贮于4以下冰箱中，需现用现配。3仪

18、器设备3.1电子天平：感量0.01 g；3.2破壁食物料理机：不低于20000 r/min；3.3均质机：不低于20000 r/min；3.4恒温水浴锅；3.5旋转蒸发仪；3.6氮吹仪。4试验步骤4.1样品制备4.1.1鲜人参取不少于500 g水果于破壁食物料理机中，以不低于20000 r/min的转速将样品制成糊浆状，充分混匀后装入样品密封盒中直接测定或-18保存，备用。4.2样品预处理4.2.1提取称取25 g水果样品水果品种当季待定，准确至0.01 g，于100 mL具塞离心管中，参加50mL乙腈，于匀质机中高速匀质1min，过滤至装有7g氯化钠的比色管中，振荡200下，静止分层，吸取1

19、0mL上层有机相于50mL浓缩管中，60水浴中氮气吹至近干，用2mL二氯甲烷甲醇混合液溶解残渣，待净化。4.2.2净化氨基柱用5 mL二氯甲烷甲醇混合液溶解进展预处理，当溶剂液面达上层筛板外表时，再倒入上述浓缩管中待净化溶液，用浓缩瓶接收，待液面下降至上层筛板外表，用8 mL二氯甲烷甲醇混合液溶解分2次冲洗浓缩管并洗脱小柱，将浓缩瓶中洗脱液于40水浴中旋转浓缩至尽干，氮气吹干后用2.5 mL甲醇和2.5 mL水定容，过0.22m滤膜待测。4.3仪器参考条件4.3.1液相色谱串联质谱联用仪:Qtrap 4500三重四级杆/离子阱质谱仪(配岛津30A超高效液相色谱仪)，电喷雾离子源,美国AB SC

20、IEX公司。4.3.2色谱柱：Kinetex XB-C18，2.1 mm150 mm2.6m4.3.3流动相及流速见表14.3.4色谱柱箱温度：404.3.5进样体积：5.0L专业资料整理-WORD完美格式编辑表1流动相梯度及流速步骤总时间/min流速/l/min0.1%甲酸铵水溶液/%甲醇/%10.0400901026400208036.14005954840059559400901061140090104.4质谱条件：4.4.1扫描方式：正离子扫描，多反响监测MRM；4.4.2离子源温度TEM：5504.4.3电离方式：电喷雾ESI；4.4.4电喷雾电压：5500 V；4.4.5雾化气压力

21、：60 PSI；4.4.6气帘气压力：30 PSI；4.4.7辅助加热气压力：70 PSI；4.4.8标准曲线的绘制分别吸取1.0L 0.02 mg/L、0.05 mg/L、0.1 mg/L、0.5 mg/L、1.0 mg/L混合标准工作液按照仪器参考条件，由低浓度到高浓度依次进展测定。分别以9种农药的质量浓度mg/L为横坐标，以9种农药的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。4.5定性分析根据样液中被测物含量情况，选定浓度相近的标准工作溶液，标准工作溶液和待测农药的响应值均在仪器检测的线性X围内。标准工作溶液与样液等体积参差进样测定。4.6定量计算试料中7种农药的残留量以质量分数计,数值以毫克每千克(

22、mg/kg)表示,结果保存3位有效数字，按公式(1)计算：VV13(Vm21)式中:标准曲线校正后所测定该种农药的质量浓度，单位为毫克每升mg/L；V1提取液中有机溶剂总体积，单位为毫升mL；V2吸取出用于检测的提取溶液的体积，单位为毫升mL；V3样品溶液定容体积,单位为毫升mL；m称取试料的质量，单位为克g。专业资料整理-WORD完美格式编辑1、尊老爱幼是每一个人都应该去做的,让我们大家要从现在做起，从自己做起，从身边的每一件小事做起，做一个尊老爱幼的模X；积极、勇敢地接过先辈们尊老爱幼的接力棒，把祖祖辈辈这一荣耀传统，一代一代传下去在这天高云淡、秋风飒爽的季节，让我们共同祝愿天下所有的老人都能幸福、XX，让我们共同祝愿天下所有的少年儿童都能安康、快乐！谢谢大家专业资料整理-