RhD阳性血影细胞的制备及应用

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1、文档来源为 :从网络收集整理.word 版本可编辑 .欢迎下载支持 .RhD阳性血影细胞的制备及应用作者：石明隽，肖瑛，桂华珍，张国忠【摘要】目的： 探讨用不同渗透浓度磷酸盐液（PB）制备的 RhD阳性血影细胞的抗原性及其在抗 -D 抗体分离中的作用。方法：用不同渗透浓度 PB作为裂解液，将遗传表现型为 CCDee的 RhD阳性 O型红细胞制备成血影细胞，观察其抗原性；以血影细胞为固相抗原，用亲和层析法从抗D 含量为 0.814 mg/L 的健康人血浆中分离抗 -D 抗体，检测相关指标。结果：pH7.4 、30 mmol/L PB制备的血影细胞形态完整，保持较强的抗原性；成功获得抗-D 抗体，

2、回收率达到84.65 ， IgG 单体加二聚体含量为99.3 %，不含抗 A、抗 B 血型抗体以及 IgA 、IgM 和血红蛋白。结论：用 pH7.4、30 mmol/L PB 制备的血影细胞可作为固相抗原，并能从低效价血浆中分离纯化抗-D 抗体。【关键词】 RhD 抗原 抗-D 抗体 血影细胞血浆Abstract Objective:To investigatethe antigenicityof RhD ghost cells prepared with different concentrations ofphosphate solution (PB) and its applicati

3、on in the separationof anti D antibodyfromplasmawithlowantibodytiter.Methods：Red blood cells of O group withpositiveRhD(genotypeCCDee) wereemployed toprepareghostcellsusingPB withconcentrationsof40,30and20mmol/Lrespectively.Antigenicityof thesecellswas examined. AntiD antibody was1文档来源为 :从网络收集整理.wor

4、d 版本可编辑 .欢迎下载支持 .separated from the plasma containing 0.814 mg/L of antiD byusing affinitychromatography (AC) with the ghostcells as solidantigen. Results ： 1.The ghost cellspreparedwith PB (pH 7.4,30 mmol/L) kept complete cell morphology and strongantigenicity;2. The antiD antibody was separated su

5、ccessfully using ACmethod from plasma. The recovery rateof antiD was 84.65%, andcontents of monomer and dimmer reached 99.3% of total IgG. NoIgA, IgM or hemoglobin was found in thepreparation.Conclusion ：The ghost cells prepared by PB (pH 7.4, 30 mmol/L) can be usedas solid antigen to separate and p

6、urify antiD antibody fromplasma with low antiD titter.Key wordsRhD antigen ，antiD antibody;ghost cells;plasma抗-D 抗体被广泛用于防止 RhD同种免疫 1,2 ，同时也用于治疗特发性血小板减少性紫癜 3,4 。目前临床使用的抗 -D 抗体均为人为免疫而得的血源制剂 5 ，而因妊娠等自然免疫而产生的获得性抗D抗体，由于其血液中含量少，没有受到重视而得到利用。2006 年用不同渗透浓度的磷酸盐液（PB）制备 RhD阳性血影细胞，并探讨其对血影细胞抗原性的影响， 探索用血影细胞从含低效价抗-

7、D 抗体的血浆中分离纯化抗体的方法及其可用性。1 材料和方法1.1 材料2文档来源为 :从网络收集整理.word 版本可编辑 .欢迎下载支持 .健康人血浆（抗D为 0.814 mg/L，IgG 含量 9.63 g/L ，贵州省血液中心），Rh表型 CCDee的 O型红细胞（贵州省血液中心） ，效价为 1256 的抗 D（IgG）血型抗体标准品（上海市血液中心） ，溶血素（中国生物制品质量检测所） ，FITC- 兔抗人免疫球蛋白（晶美公司） ，MININEPHTMIgG抗血清（英国 The Binding site公司），99/728 抗-D抗体标准品 ( 英国 The NationalInst

8、itutefor BiologicalStandardsand Control ， NIBSC) ，免疫单扩散板（上海捷门生物技术合作公司） 。8200 型超滤器、截留分子量30 kD 的超滤膜（美国Millipore公司），3K30型低温高速离心机（德国 Sigma 公司），FACSCabiber式细胞仪（美国 Becton Dickinson 公司），高效液相色谱仪（美国 Waters 公司），MININEPSAN散射比浊仪（英国The Bingding Site公司）。1.2 血影细胞的制备O型 Rh表型 CCDee的红细胞，等体积生理盐水洗涤 3 次（1 000 r/min 5 min

9、，4 ），pH7.4，渗透浓度分别为 40、30 和 20 mmol/L的 PB多次洗涤离心（ 20 000 r/min 15 min ，4 ）至上清液无色，沉淀即为含 D抗原的血影细胞。1.3 血影细胞形态和抗原性检测在光镜下观察血影细胞的形态。将血影细胞与标准抗 -D 抗体37 孵育 30 min，离心取上清液，用RhD筛选细胞测定其抗体效价，标准抗 -D 抗体效价减去上清液效价反映血影细胞的抗原性，相同条件重复5次。1.4 血浆抗 D-抗体的分离纯化3文档来源为 :从网络收集整理.word 版本可编辑 .欢迎下载支持 .血影细胞用 2%戊二醛 21 的体积比固定 30 min 后与血浆按

10、12 的体积比例混合， 37 轻柔搅拌 2 h，离心（1 000 r/min 5 min，4 ）弃上清，沉淀的细胞用 10 倍体积的 pH2.8，0.2 mol/L 的甘氨酸盐酸缓冲液洗脱，离心（ 1 000 r/min 3 min ），洗脱液用 0.05 mol/L NaOH 调 pH至 6.0 6.5 ，重复两次，合并洗脱液，超滤浓缩至原血浆体积的 1/5 ，过滤除菌，冷冻干燥， 4 保存。 相同条件重复 7次。1.5 抗体测定终点散射比浊法测定IgG 含量，免疫单扩散法检测IgA 和 IgM含量，高效液相色谱法测定IgG 单体加二聚体含量，流式细胞术测定抗-D 抗体含量，邻甲联苯胺法行血

11、红蛋白定性测定，试管法测定抗 A、抗 B 血型抗体。2 结果2.1 血影细胞的形态用渗透浓度为 20 mmol/L 的 PB制备的血影细胞形态不规则，混有较多细胞碎片；用30 和 40 mmol/L 的 PB制备的血影细胞呈透明圆形，未见明显细胞碎片， 但 40 mmol/L 的 PB制备的血影细胞内含有少量血红蛋白，细胞中心可见红色。2.2 血影细胞的抗原性抗-D 标准品效价为 1256，表 1 显示血影细胞与抗 -D 抗体标准品孵育后，重复 5 次的结果。用 20 mmol/L 的 PB制备的血影细胞与抗 -D 抗体标准品孵育后， 四次上清液中的抗体效价为 1128；而用 30 和 40

12、mmol/L 的 PB制备的血影细胞与抗 -D 抗体标准品孵育后，4文档来源为 :从网络收集整理.word 版本可编辑 .欢迎下载支持 .上清液中的抗体效价在116 与 132 之间。表 1 标准抗体与血影细胞孵育后上清液的抗体效价（略）2.3 IgG含量、抗 -D 抗体含量和回收率用 30 mmol/L PB制备的血影细胞对血浆进行亲和层析得到的制剂中， IgG 含量为（ 4.24 1.53 ）g/L （n=7），其中单体加二聚体占（ 99.9 0.25 ）（n=7）；抗-D 抗体的含量为（3.45 0.31 ）mg/L（n=7），回收率为（84.65 7.85 ）（n=7）；7 次重复得到

13、的制剂均不含抗A、抗 B 血型抗体以及 IgA 、IgM 和血红蛋白。 2.4 分离纯化过程对血影细胞的影响用 30 mmol/L PB 制备的血影细胞在 2%戊二醛固定后和亲和层析后细胞形态略变小，而经过洗脱液洗脱的血影细胞比固定后的细胞形体稍大，但细胞仍然呈完整圆形，细胞涂片光镜下未观察到细胞膜的碎片。见图 1。3 讨论本课题组曾用柱层析法从低效价血浆中分离得到含抗-D 抗体的 IgG6 ，再用经 2 戊二醛固定的 RhD阳性红细胞从 IgG 中纯化抗-D 抗体。为提高抗 -D 抗体的回收率，设想直接用 RhD阳性红细胞从含抗-D 抗体的血浆中分离纯化该抗体。实验发现，戊二醛固定 30 m

14、in 的红细胞与血浆接触后出现血红蛋白溢出现象，延长红细胞固定时间和灭活血浆补体仍不能改善。鉴于 RhD抗原仅位于红细胞膜上，参考 Litten 等7 ，8 方法，利用低渗的裂解液将血红蛋白从红细胞中释放5文档来源为 :从网络收集整理.word 版本可编辑 .欢迎下载支持 .出来。结果表明，渗透浓度分别为 40、30 和 20 mmol/L 的 PB均可使红细胞裂解而释出 Hb，成为具有 D抗原性的血影细胞。 光镜下，用 40 和 30 mmol/L 的 PB制备的血影细胞呈光滑圆形， 未见细胞膜碎片； 40 mmol/L PB 制备的血影细胞在细胞中心仍有少许 Hb，30 mmol/L PB

15、 制备的血影细胞内不含 Hb。用 20 mmol/L PB 制备的部分血影细胞形态不规则，可见散在的膜碎片。抗原性检测显示，用40 和 30 mmol/L PB制备的血影细胞的抗原性明显强于用20 mmol/L PB 制备的血影细胞。鉴于 30 mmol/L PB 制备的血影细胞保持了较强的抗原性并且不带有Hb，应用此血影细胞与含低效价抗-D 抗体的血浆进行亲和层析， 成功分离了抗 -D 抗体，抗 -D 抗体回收率提高到84.65%。同时制剂总 IgG量明显低于血浆中的含量，不含A、B 血型抗体以及 IgM、IgA 和 Hb。结果还表明，经过亲和层析，血影细胞的形态没有发生明显变化，提示有再利

16、用的可能性。因此，用 30 mmol/L PB将遗传表型为 CCDee的 O型红细胞制备为具有完整 D抗原性的血影细胞，以此作为固相抗原与血浆进行亲和层析，可以从低效价血浆中分离纯化抗-D 抗体，操作步骤简单，抗-D 抗体的回收率较高。【参考文献】1JabaraS,BarnhartKT. Is Rh immune globulinneed inearly firsttrimester abortion A reviewJ. Am J ObstetGynecol, 2003(3):623-627.2Augustson BM, Fong EA, Grey DE, et al. Postpartum

17、6文档来源为 :从网络收集整理.word 版本可编辑 .欢迎下载支持 .antiD:canwe safelyreducethedoseJ.MedJAust,2006(12):611-613.3Fung KF, Eason E, Crane J, et al. Prevention of Rh alloimmunizationJ. J Obstet Gynaecol Can, 2003(9):765-773.4Ambriz Fernandez R, Martinez Murillo C, Quintana Gonzalez S, et al.Fc recepteor blockade in pa

18、tients withrefractory chronic immune thrombocytopenic purpura with anti D IgGJ. Arch Med Res, 2002(6):536 -540.5Kumar M, Vil TA, Johnson CS, et al. Treatment, outcome and cost of care in children with idiopathic thrombocytopenic purpuraJ. Am J Hematol, 2005(3):181-187.6 谢竞，石明隽，张国忠 , 等. 抗 D抗体的提取工艺研究

19、J.中国生化药物杂志， 2005(4):208-210.7Litten J, Culpepper R, Bakerman S. Studies on thecharacterization of the RhO(D) antigenJ. Biochimica Biophysica Acta, 1978(2):226-234.8Tan Y，Qiu Y，Xu H，et al.Decreased immunorejectionin unmatched blood transfusions by attachment of methoxypolyethylene glycol on human red blood cells and the effect on D antigenJ. Transfusion, 2006(12):2122-2127.7