细胞形态结构观察

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1、第三章第三章 细胞形态结构观察技术细胞形态结构观察技术一、活体细胞的观察和摄影技术一、活体细胞的观察和摄影技术1.倒置显微镜倒置显微镜：P60图图3-3（提问光镜使用注意）（提问光镜使用注意） 适用适用：观察贴壁生长的培养中细胞：观察贴壁生长的培养中细胞 构造特点构造特点：因物镜置于观察标本下方而得名：因物镜置于观察标本下方而得名 技巧技巧：调弱光亮度，集光器稍远些，：调弱光亮度，集光器稍远些， 增大光线反差，对正光轴；增大光线反差，对正光轴； 摄影时，使观察物稍偏远离焦点，照片摄影时，使观察物稍偏远离焦点，照片 会更清晰。会更清晰。 底片选用正片，反差大底片选用正片，反差大2.相差显微镜相差

2、显微镜 P62图图3-4 适用适用：可增强活细胞同背底反差，帮助看清：可增强活细胞同背底反差，帮助看清 细胞的轮廓和细胞内细微结构，如：细胞的轮廓和细胞内细微结构，如： 核仁、染色质、线粒体等。核仁、染色质、线粒体等。 构造特点构造特点：有两个附加构件：有两个附加构件： 相差接物镜：其光学系统中有一个光环透镜相差接物镜：其光学系统中有一个光环透镜 相差聚光器：内有数个相位板，使用时与物相差聚光器：内有数个相位板，使用时与物 镜倍数一致镜倍数一致 技巧技巧：细胞培养瓶质地均匀透明较好，最好用塑：细胞培养瓶质地均匀透明较好，最好用塑 料瓶；观察摄影时，瓶壁要擦净；光轴对料瓶；观察摄影时，瓶壁要擦净

3、；光轴对 正，照明度适宜，摸索试调至最佳正，照明度适宜，摸索试调至最佳3.荧光显微镜荧光显微镜 P67图图3-6 适用适用：观察细胞内天然的荧光物质，如维生：观察细胞内天然的荧光物质，如维生 素、脂褐素、核黄素等，也可观察可与素、脂褐素、核黄素等，也可观察可与 荧光染料结合的细胞组分。荧光染料结合的细胞组分。 构造特点构造特点：与普通光镜比，区别在于用高压汞灯光：与普通光镜比，区别在于用高压汞灯光源，波长可激发荧光物质产生荧光；滤光片不同。源，波长可激发荧光物质产生荧光；滤光片不同。 技巧技巧：观察必须是自发荧光或经荧光染色的标本；：观察必须是自发荧光或经荧光染色的标本；选用效果最好的滤光片；

4、荧光标本易褪色，不能长选用效果最好的滤光片；荧光标本易褪色，不能长期保存，观察操作要迅速，作好记录；仪器的高压期保存，观察操作要迅速，作好记录；仪器的高压汞灯光源启动后汞灯光源启动后15分钟内不得关闭，关闭后，灯冷分钟内不得关闭，关闭后，灯冷却后方可再起动，否则寿命大减，长时间观察标本却后方可再起动，否则寿命大减，长时间观察标本时，需带护目镜。时，需带护目镜。 4.暗视野显微镜暗视野显微镜 P64图图3-5 适用适用：观察记录活细胞或细胞器的运动轨迹，：观察记录活细胞或细胞器的运动轨迹， 提高分辨率提高分辨率 构造特点构造特点：只有聚光器不同于普通显微镜，设：只有聚光器不同于普通显微镜，设 有

5、一个中央遮光板使照明光线不能直射。有一个中央遮光板使照明光线不能直射。 标本进入目镜，只许标本散射光进入目标本进入目镜，只许标本散射光进入目 镜镜 技巧技巧：物镜的数值孔径必小于聚光器的数值孔：物镜的数值孔径必小于聚光器的数值孔 径；盖玻片，载玻片应清洁无痕；聚光径；盖玻片，载玻片应清洁无痕；聚光 镜和载玻片之间加香柏油，保证效果。镜和载玻片之间加香柏油，保证效果。二.显微摄影技术 p68n1.概念：显微摄影术是利用显微摄影装置拍摄n 显微镜视野的物象的技术。n2.技术类型：胶片相机摄像n 数码相机摄像n CCD图像采集n 三者前期操作一致，但成像和图像存储n原理不同。n3.图像记录原理：n

6、胶片相机摄像：显微摄影时，光线自标本n片的微小物件射入物镜后，造成一个倒立的放大实像，经目镜进一步放大后，投射在照相底片上，使底片感光而记录下显微镜视野下物象。n 数码相机摄像：是以数字的形式用电子设备储存图像。拍照后，可通过数据线将所拍摄图像传输到电脑，也可将相机的存储卡取出，通过读卡器将拍摄的图像传输到电脑上。n 数码相机摄像原理与CCD图像采集器相同。n CCD图像传感器：即CCD(charge coplednDevice, 感光耦合组件）n CCD的组成结构有三个层次：n 上层：聚光镜片（增光镜片）n 中层：一个类似马赛克的网络（分色网络）n 下层：垫在下层的电子线路矩阵（感应线路n

7、是可记录光线变化的半导体）n CCD工作方式之一：n 当数码相机的快门开启，来自影像的光线穿过，这些马赛克会让感光点的=氧化硅材料释放出电子（正电）与电洞（负电）。经由外部加入电压，这些电子和电洞会被转移到不同极性的另一个硅区暂存。电子数的多寡和曝光点所接受的光量成正比。在一个影像最明亮部位，可有十万电子被积存起来。CCD IMAGE SENSOR外形外形彩色彩色CCD的组成结构分图的组成结构分图nCCD 的三层结构：上：增光镜片、中：色块网格 下：感应线路 n由微型镜头、马赛克分色网格，及垫于最底层的电子线路矩阵所组成 n4.拍摄技术步骤：n 胶片相机拍摄：p69-74(生物教研室李相伟）n

8、 数码相机拍摄：p74-75(同上）n CCD图像采集： （病理教研室姚海涛n （实验中心刘君星）5.缩时显微摄影术缩时显微摄影术 适用适用：记录细胞或细胞器连续动态变化过程：记录细胞或细胞器连续动态变化过程 正常时态连续拍照正常时态连续拍照 缩时逐格拍照缩时逐格拍照n主要装备主要装备：倒置显微镜，：倒置显微镜，16mm摄影机，自控摄影机，自控 缩时启动拍摄装置。缩时启动拍摄装置。n原理：原理：缩时间隔时间：缩时间隔时间：目标物实际活动时间目标物实际活动时间 X 1/24 影片排成后要求放镜时间影片排成后要求放镜时间 =3600秒秒 10秒秒 x 124=15秒秒 所以，每隔所以，每隔15秒摄

9、取秒摄取1张照片。张照片。三、光镜下的固定细胞观察法（组胚，病理）三、光镜下的固定细胞观察法（组胚，病理） 细胞器培养皿内铺盖片单层培养细胞器培养皿内铺盖片单层培养 取盖片取盖片细胞悬液细胞悬液 离心沉淀离心沉淀 涂片涂片 固定固定染色染色 观察观察 拍照拍照 （固定剂，染色剂知识介绍）（固定剂，染色剂知识介绍）固定剂的作用：穿透，固定，保形，防腐固定剂的作用：穿透，固定，保形，防腐固定剂的选择：固定剂的选择：P83n细胞内组分的差异染色。n染色剂的选择：nGiemsa染色体桃红色。 本书P84nFeulgenDNA紫红色，细胞质绿色。鄂P141n吖啶橙RNA红色，DNA亮绿色。本书P86n苏

10、木精-伊红（HE)细胞核蓝色，细胞质红色n 本书P85n过碘酸席夫细胞内含糖原区紫红色。章P58n苏丹红III细胞内含脂肪区橘红色。章P59n鬼笔环肽溦丝染色。章P59n免疫荧光法溦管染色。章P60n联苯胺+H2O2过氧化氢体染色。小章P37n詹纳斯绿B活体细胞线粒体。小章P43n 四、激光扫描共聚焦显微镜技术（实验中心）四、激光扫描共聚焦显微镜技术（实验中心）1.概念和原理概念和原理 P76 laster scanning confocal microscope LSCM激光共聚焦显微镜是激光共聚焦显微镜是20世纪世纪80年代以来发展起来的年代以来发展起来的一项细胞生物学和高分子材料科学领域

11、的高科技分一项细胞生物学和高分子材料科学领域的高科技分析仪器。析仪器。 其在传统光学显微镜基础上，利用激光作其在传统光学显微镜基础上，利用激光作为光源，经照明针孔可形成点光源照射荧光样品，为光源，经照明针孔可形成点光源照射荧光样品，所产生的激发光斑被探测器针孔以共轭的形式接收所产生的激发光斑被探测器针孔以共轭的形式接收于同一焦平面上，可通过计算机控制显微镜移动，于同一焦平面上，可通过计算机控制显微镜移动，以实现在同一焦平面（以实现在同一焦平面（x-y)上的逐点扫描。计算机上的逐点扫描。计算机以像点的方式在计算机屏幕上形成图像。以像点的方式在计算机屏幕上形成图像。 同时，也可沿同时，也可沿z轴方

12、向逐渐改变焦平面，完轴方向逐渐改变焦平面，完成对样品厚片不同层面的扫描，进行类似成对样品厚片不同层面的扫描，进行类似CT断断层扫描的无损伤连续光学切片，经计算机三维重层扫描的无损伤连续光学切片，经计算机三维重建处理，可形成观察标本的三维结构图形。建处理，可形成观察标本的三维结构图形。2.LSCM的主要组成部分及工作原理的主要组成部分及工作原理激光光源激光光源:氢离子激光氢离子激光,能同时能同时 / 顺序顺序 / 分别输出紫分别输出紫外光和可见光外光和可见光照明针孔照明针孔:使激光通过照明针孔后形成点光源使激光通过照明针孔后形成点光源,点光源具有方向性强点光源具有方向性强,发散小、亮度高等优点发

13、散小、亮度高等优点光束分离器：可将样品经点光源照射所激发的光束分离器：可将样品经点光源照射所激发的荧光与其它非信号光线分开，排除非信号光线荧光与其它非信号光线分开，排除非信号光线干扰，提高分辨率和清晰度。干扰，提高分辨率和清晰度。物镜物镜焦平面：激光点光源照射标本样品，激发样品焦平面：激光点光源照射标本样品，激发样品发射荧光，形成焦点光斑，在焦平面处聚焦成发射荧光，形成焦点光斑，在焦平面处聚焦成像。像。探测器针孔：起到空间滤波器作用。阻断非聚焦探测器针孔：起到空间滤波器作用。阻断非聚焦平面散色光和焦平面上非焦点光斑散色光。保证平面散色光和焦平面上非焦点光斑散色光。保证样品所衍射的聚焦光斑和探测

14、器针孔的成像光斑，样品所衍射的聚焦光斑和探测器针孔的成像光斑，包含相同信息。（两点共扼聚焦）包含相同信息。（两点共扼聚焦）光电倍增器：接受通过探测器针孔的光信号，转光电倍增器：接受通过探测器针孔的光信号，转换成电信号后转输至计算机，在屏幕上形成焦平换成电信号后转输至计算机，在屏幕上形成焦平面图形面图形多荧光通道多荧光通道:可以同时对样品进行多种荧光标记的可以同时对样品进行多种荧光标记的信号检测信号检测计算机控制系统：控制步动电动机带动显微镜计算机控制系统：控制步动电动机带动显微镜移动，实现在同一焦面移动，实现在同一焦面(x-y轴轴)上逐点扫描；控上逐点扫描；控制共聚焦系统；控制沿制共聚焦系统；

15、控制沿z轴改变焦平面，进行轴改变焦平面，进行对样品厚度的连续光学切片和对样品结构的三对样品厚度的连续光学切片和对样品结构的三维重建；控制信号的采集、转输、分析。维重建；控制信号的采集、转输、分析。3.LSCM相对光学显微镜的优点相对光学显微镜的优点LSCM的图像是以电信号形式记录下来的，可用的图像是以电信号形式记录下来的，可用电子计算机技术模拟数字化处理电子计算机技术模拟数字化处理利用共聚焦系统有效排除了焦点外信号干扰，利用共聚焦系统有效排除了焦点外信号干扰，不仅提高了不仅提高了x-y轴焦平面分辨率和清晰度，而轴焦平面分辨率和清晰度，而且可对观察样品进行且可对观察样品进行z轴无损伤光切片，实现

16、轴无损伤光切片，实现三维结构的定位成像三维结构的定位成像可广泛应用于活细胞的形态、结构，定量、定可广泛应用于活细胞的形态、结构，定量、定性、定位分析。与荧光探针技术结合，可进行性、定位分析。与荧光探针技术结合，可进行单细胞分选和多种细胞分子生物学研究及细胞单细胞分选和多种细胞分子生物学研究及细胞机能学研究机能学研究4.LSCM的应用的应用贴壁细胞的分选贴壁细胞的分选n数量较多细胞群的分选数量较多细胞群的分选:在特别培养皿上一类细胞在特别培养皿上一类细胞群经荧光染色，另一类细胞群未经染色，可用高群经荧光染色，另一类细胞群未经染色，可用高能激光把荧光染色的细胞群杀死，而另一类保存，能激光把荧光染色

17、的细胞群杀死，而另一类保存，可继续培养。可继续培养。n少量或单克隆细胞的分选：对于选中的突变细胞、少量或单克隆细胞的分选：对于选中的突变细胞、杂交细胞或肿瘤转移细胞，可利用铺有特制膜的杂交细胞或肿瘤转移细胞，可利用铺有特制膜的培养皿上，在选中的细胞克隆周围切割成八角带，培养皿上，在选中的细胞克隆周围切割成八角带，再用高能激光杀伤八角带之外的细胞。再用高能激光杀伤八角带之外的细胞。细胞形态学研究：可行细胞形态学研究：可行X-Y焦平面形态研究，尤其焦平面形态研究，尤其是可行工是可行工z轴三维形态结构研究。可对细胞形状，轴三维形态结构研究。可对细胞形状，周长，面积，平均荧光强度，也可对细胞内溶酶体，

18、周长，面积，平均荧光强度，也可对细胞内溶酶体，线粒体，内质网，细胞骨架，结构性蛋白形态、数线粒体，内质网，细胞骨架，结构性蛋白形态、数量、位置的描述。量、位置的描述。细胞内某些大分子组分分析：与免疫荧光技术和荧细胞内某些大分子组分分析：与免疫荧光技术和荧光探针技术相结合，可对细胞内蛋白、光探针技术相结合，可对细胞内蛋白、DNA、RNA、酶、受体等组份进行定性定量定时定位分析，以及酶、受体等组份进行定性定量定时定位分析，以及细胞内细胞内PH和细胞内某些离子进行分析。用于细胞机和细胞内某些离子进行分析。用于细胞机能学研究。细胞通讯研究。能学研究。细胞通讯研究。细胞机能学研究及细胞通讯研究细胞机能学

19、研究及细胞通讯研究细胞显微外科手术：在细胞显微外科手术：在LSCM镜下可将激光作镜下可将激光作光子刀使用进行细胞穿孔、染色体精切，细胞光子刀使用进行细胞穿孔、染色体精切，细胞器烧灼，神经元突触切除，细胞器转移等手术。器烧灼，神经元突触切除，细胞器转移等手术。五、电镜观察法五、电镜观察法 P78n分辨率分辨率：肉眼：肉眼0.1mm 光镜（油镜）光镜（油镜）0.2um 电镜可达电镜可达0.08nmn培养细胞的电镜观察途径培养细胞的电镜观察途径 透射电镜观察透射电镜观察 内部结构内部结构 原位切片原位切片 组织消化分离后切组织消化分离后切 扫描电镜观察扫描电镜观察 c表面结构表面结构 原位扫描观察原位扫描观察 消化分离观察消化分离观察n锇酸固定剂的发现锇酸固定剂的发现：锇酸用量很少，但代价昂贵，：锇酸用量很少，但代价昂贵，事先同电镜室商量。事先同电镜室商量。n（研究生课程专设有电镜课）（研究生课程专设有电镜课）n用途用途： 观察细胞的亚微结构，进行生理、药理、病观察细胞的亚微结构，进行生理、药理、病理学研究。理学研究。n如：核糖体分布与脱粒如：核糖体分布与脱粒 线粒体变形线粒体变形 溶酶体异常溶酶体异常 细胞膜表面结构和吞饮作用，微绒毛变异细胞膜表面结构和吞饮作用，微绒毛变异 细胞骨架紊乱细胞骨架紊乱 精子结构异常精子结构异常 （见（见P82电镜照片）电镜照片）