绿豆促进拟茎点霉代谢合成松脂醇二葡萄糖苷的作用机制解析

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1、绿豆促进拟茎点霉代谢合成松脂醇二葡萄糖苷的作用机制解析松脂醇二葡萄糖苷 (+)-1-pinoresinol 4,4-di-O- -D-glucopyranoside(PDG)是杜仲 (E.ulmoides Oliver)中主要的降血压成分 ,具有多种生物活性 , 通常由杜仲皮中提取而得, 但提取存在量少、周期长等问题,所以微生物发酵合成PDG具有很好的应用前景。前期研究发现, 杜仲内生真菌拟茎点霉 XP-8 能够代谢合成 PDG,然而产量很低。本研究发现 , 绿豆能够有效促进该菌合成PDG;绿豆水溶性多糖和绿豆淀粉是其中主要的有效成分 , 绿豆水溶性多糖的单糖组份对该菌合成PDG及其相关产物松

2、脂醇单葡萄糖苷 (+)-pinoresinol-4-O-Dglucopyranoside(PMG)和松脂醇 (+)-pinoresinol(Pin)具有不同的促进作用。 分析该菌转化绿豆水溶性多糖和绿豆淀粉合成PDG,Pin 和/ 或 PMG的过程中物质积累与相关酶类的活性变化发现 , 绿豆淀粉和绿豆水溶性多糖主要是通过促进苯丙烷途径中相关中间物质和前体的积累量 , 增加了这些产物的合成。综合前体喂养法 , 稳定同位素示踪技术和关键酶类活性检测与变化规律等方面实验结果 , 解析出该菌合成这些物质的代谢流, 发现其与植物中苯丙烷途径类似。最后 , 对相关产物的生物活性进行分析发现, 该菌的静息转

3、化产物能够显著抑制肝癌细胞的活性 , 表现出很好的应用前景。论文主要研究内容与结果如下:(1) 拟茎点霉 XP-8 在不同天然培养基上的PDG产量根据植物中相关代谢途径, 选取富含木脂素合成途径中前体和中间产物的 18 种植物原料制成培养基 , 用于培养拟茎点霉 XP-8, 检测其 PDG合成量。结果发现其中大部分植物原料可显著提高该菌的 PDG产量 , 并以绿豆的提高幅度最大。对绿豆为培养基时的培养方式进行优化发现, 该菌在琼脂固态培养基上的PDG产量高于液体培养基 ; 因此 , 为适应工业化生产 , 考察了该菌在绿豆颗粒固态培养基上的 PDG产量。在绿豆颗粒培养基中加入100 g/kg葡萄

4、糖 , 培养 12 天的PDG产量最高 , 可达 72.1 mg/kg( 湿基 ) 或 216.3 mg/kg( 干基 ), 远远高于其前期在最优合成培养基上的产量。同时 , 在该菌的绿豆发酵物中也检测到了PMG和 Pin 的生成。因此 , 在实际生产中具有很好的应用潜力。(2) 绿豆中促进拟茎点霉属 XP-8 合成 PDG的主要成分分析为进一步揭示绿豆促进拟茎点霉 XP-8 合成 PDG的主要原因 , 对绿豆主要组分进行分离纯化 , 在该菌静息细胞转化体系中 , 分别分析了绿豆淀粉、绿豆水溶性多糖和绿豆蛋白对该菌合成 PDG的影响 , 并以绿豆全粉做参照。 结果发现 , 绿豆淀粉和绿豆水溶性

5、多糖是绿豆中促进该菌合成 PDG的主要有效成分。绿豆淀粉主要促进 PDG和 Pin 积累 , 绿豆水溶性多糖则主要促进 PMG和 Pin合成。进一步分析绿豆水溶性多糖中不同单糖组分发现, 多糖组成中的葡萄糖和阿拉伯糖能够增加三个产物的总量, 但主要促进 Pin 的合成 ; 木糖和甘露糖则主要促进 PDG的合成 ; 半乳糖主要促进PMG的合成。由此说明 , 绿豆对于该菌合成PDG的促进作用主要归因于其中的淀粉和水溶性多糖组份。 (3) 绿豆组份影响 PDG及相关产物的作用机制分析为进一步分析绿豆淀粉和多糖促进拟茎点霉 XP-8 合成 PDG及相关产物的作用机制 , 跟踪检测了该菌在以这些物质为底

6、物时积累的中间产物种类和产量的变化 , 以及相关酶活的变化 , 发现该菌在转化绿豆水溶性多糖和绿豆淀粉合成 PDG,Pin 和/ 或 PMG时, 表现出类似于植物中苯丙烷代谢途径的产物积累顺序和相关酶活 , 推测其作用机制是绿豆淀粉和绿豆水溶性多糖在转化过程中增加了相关途径上的中间产物的积累量 , 从而促进了 PDG及相关产物的合成。(4) 拟茎点霉 XP-8 合成 PDG及相关产物的代谢流解析为进一步解析拟茎点霉XP-8 合成 PDG及相关产物的代谢途径, 使用了前体饲喂 , 代谢流向分析和同位素示踪等方法。结果显示该菌能以苯丙烷途径中的前体物质为唯一转化底物合成Pin; 补充少量葡萄糖能够

7、继续合成PDG。物质的代谢流向依次为 : 葡萄糖、 ( 苯丙氨酸、肉桂酸 )/ 酪氨酸、对香豆酸、Pin 和/ 或 PDG。以 13C标记葡萄糖和苯丙氨酸 ( 标记苯环 ) 为底物验证途径中物质的流向。结果确定了该菌中从苯丙氨酸到Pin 的合成 , 且伴随肉桂酸和对香豆酸的积累。苯丙氨酸的苯环结构参与了这些物质的合成。另外葡萄糖参与了苯丙氨酸及后续产物的合成。为验证该菌经苯丙烷途径合成 PDG及其相关产物的前期推理提供了更多的证据。(5) 拟茎点霉 XP-8 的静息细胞转化产物的抗癌活性与其作用机制为剖析拟茎点霉 XP-8 代谢产物的应用潜力 , 分析了其静息转化产物的提取液对肝癌细胞HepG-2和白血病癌细胞K562的抑制作用与机制 , 结果发现提取液能够显著抑制两种癌细胞的生长活力 , 并促进其细胞凋亡 ; 其作用机制在于该提取液上调了两种细胞中凋亡相关基因FasL 和 caspase 3,8,9和 10 表达量 ; 此外 , 提取液对HepG-2的抑制机制还在于其抑制了该癌细胞的黏附能力, 和通过下调 MMP9 蛋白的表达抑制了肝癌细胞的迁移能力。从而证明该菌的静息细胞转化产物具有被开发为抗肿瘤药物的潜力。