南美叉柱花的离体培养与快速繁殖

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1、南美叉柱花的离体培养与快速繁殖摘要：以叉柱花幼嫩枝条为外植体，建立了快速无性繁殖体系。结果显示：采用 0.1%的升汞溶液消毒处理 10min 最为合适；诱导不定芽最佳增殖培养基配方为改良 Ms 培养基+6-BA 2.0mg/L+KT 0.5mg/L+IBA 0.1mg/L；生根培养基配方为改良的 MS 培养基 +NAA 1mg/L+IBA 0.1mg/L。该离体培养方法能提高叉柱花的繁殖系数，有效缓解当前种苗不足和缩短上市时间，满足市场需求。关键词：叉柱花；组织培养；快速繁殖观赏水草在水族箱中有着重要的地位，随着人们对水草的喜爱，已经发展成为以水草为主的观赏水族箱。南美叉柱花（ Staurog

2、ynerepens），也称叉柱花，是一种双子叶植物，属于爵床科叉柱花属，分布于巴西、委内瑞拉等地，虽然近年来才刚刚引入我国，但是得到市场的认可，市场上往往供不应求。南美叉柱花的繁殖主要依靠对成年的匍匐茎进行分株，繁殖系数较低，同时成本较高。其属于短日照植物，在每年 11 月以后常常开花，引起植物早衰，叶片变黄，失去欣赏价值，不仅导致经济价值下降，而且在秋冬季节市场上产品缺乏。随着生物技术的发展，特别是植物组织培养技术的日趋成熟，利用植物工厂生产花卉，果树等的种苗已经广泛应用，比如香蕉、番木瓜、蝴蝶兰、杨树、铁皮石斛等。近年来一些观赏水草如水榕、红椒、绿椒、皇冠、红波等也已经成功建立了组织培养技

3、术体系，有些品种开展了工厂化育苗，但是还没有工厂化生产叉柱花的报道。组织培养技术能够在短期内大量提供南美叉柱花的种苗，同时通过室内培养避免其受光周期诱导开花。本研究通过对影响叉柱花组织培养及快速繁殖的因素进行了相关探索，以期为叉柱花的工厂化组培育苗提供技术方案，保障周年供应市场。1 材料与方法1.1 材料2014 年春季在南宁花鸟市场购买生长健壮的叉柱花成苗，培养在亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室玻璃温室。1.2 培养基与培养条件改良 MS 培养基（ MX）：改良 MS 培养基的配方为：用Ca（ NO3） 2?4H2O 代替原 MS 培养基中的 CaCl2?2H2O并添加抗坏血酸，其

4、他组分均无变化；其中Ca（ NO3） 2?4H2O的浓度为 95mg/L ，抗坏血酸的浓度为5mg/L ；丛芽增殖培养基：在MX培养基中添加适量的6-BA、 KT、 NAA；生根培养基：在MX培养基中添加适量的I-BA 及NAA。所有培养基附加蔗糖 30g/L 、琼脂 5.5g/L ，pH 值调至 5.8 0.2，经 121高压灭菌 20min 。培养条件： 温度 25 3，湿度为 65% 80%，光照度 800Lx，光照时间10h/d 。1.3 外植体消毒处理选取叉柱花幼嫩的枝条作为外植体，去除叶片，用自来水冲洗 30min ，然后用吸水纸吸干枝条表面水分。在超净工作台上，将洗净的枝条切成带

5、有12个芽的茎段， 先用70%酒精清洗30s，再用无菌水冲洗3 次，每次3min ，立即转入含有吐温的0.1%的升汞溶液中分别浸泡7、 9、 11、 13min，晃动烧杯，让材料充分接触消毒剂，最后将材料用无菌水洗涤 3 次，每次 5min ，得到消毒外植体备用。消毒好的茎段切除与消毒剂有接触的两端，接种于诱导培养基 MX+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.1mg/L 中，每个消毒处理30个芽。于 1 5d 后统计污染率和萌芽率。1.4 丛芽的增殖取诱导得到的初代材料，接种于丛芽增殖培养基，培养基中激素的组合和浓度如表1 所示，进行继代培养21d，比较不同浓度的 6-BA 和 KT 对叉柱

6、花丛芽增值的效果，统计 20个芽的增殖情况。1.5 叉柱花生根诱导将叉柱花丛芽切成带有12 不定芽的茎段，然后将生物学底端插入生根培养基中。培养基以MX 为基础，添加不同浓度的 NAA 和 IBA，浓度见表 2。进行生根培养 1 5 20d，统计 20 株再生植株根的数量和长度。1.6 叉柱花的种植当叉柱花幼苗生的根长至1 2cm、苗高 3cm 以上后，将培养瓶瓶盖打开， 室内炼苗培养7d，然后洗净根部培养基，浸泡 0.1%多菌灵溶液10min ，将组培苗根部用适量消毒后的岩棉包裹，固定在直径5cm，高 6cm 的塑料镂空杯中，种植在遮光率为50%的塑料大棚的水池中，保持叶面湿度。2 结果与分

7、析2.1 外植体消毒经过消毒处理后的外植体在诱导培养基上，7 10d 腋芽开始萌动，在21d 已经有丛芽（图1）。按 1.3 方法对叉柱花外植体进行消毒，70%的酒精处理20s 后，再以0.1%HgCl2作 4 种不同时间的处理，对其污染率、萌芽率和死亡率进行统计，结果如表 3。本研究中，叉柱花外植体污染主要为细菌污染，没有出现真菌污染，可能是采用酒精和氯化汞相结合的2 次消毒的结果。外植体的污染率与0.1%HgCl2处理时间的长短负相关，随着处理时间的延长，0.1%H gCl2外植体的伤害增加，污染率逐渐下降，消毒13min的污染率比消毒7min的降低了60%，并且出现细菌污染的时间也要滞后

8、，而外植体的萌芽率也逐渐降低，在消毒13min时，萌芽率仅为10%，比处理7min 的要低 53.33%；外植体的死亡率不断上升，处理 4 的死亡率最高， 高达 66.67%，而处理 1 仅为 10%。在本研究中处理1 4 均能得少量的无菌外植体，通过结合萌芽率和污染率等综合因素分析，采用70%酒精 20s 和0.1%HgCl2处理 910min 较为合适开展叉柱花外植体的消毒。2.2 叉柱花丛芽的诱导与增殖丛生芽通过不断继代增殖培养，在短期内可以得到大量的无菌苗（图2）。从表4 可以看出， 6-BA 浓度在 13mg/L 内均能诱导不定芽的增殖，增殖效率和浓度正相关。随着浓度的升高，不定芽的

9、增殖效率递增，在 6-BA 浓度 3mg/L 时增殖系数达到 7 左右。但是仅用 6-BA 诱导芽过于密集， 节间短， 苗较弱， 不便于进行第 2 次增殖操作。在培养基中加入 0.5 1mg/L 的 KT 均能促进苗的均匀， 缓解 6-BA 浓度过高导致丛生芽的矮小， 并且增殖系数为 6 7，和原来增殖系数相当， 但改善了苗的均匀性。从节约生产成本的角度考虑， KT 的浓度建议为 0.5mg/L 。2.3 生根培养将带芽的茎段接入生根培养基，培养 20d，统计苗生根率、根的长度和质量。 结果 0.5mg/L 和 1mg/L 的 NAA 都能诱导叉柱花的生根，单独使用 NAA，得到的根相对较细，

10、在移栽过程中容易断。其中，在 1mg/L 处理下根的数量在 5 条左右，要比 0.5mg/L 的处理多 2 3 条，根直径上没有明显的差异。添加 0.1mg/L 的 IBA 能显著提高根直径，得到较为粗壮的苗，完全能够满足后期的移栽，保证成活率（图3）。 MX培养基 +NAA1g/L+IBA 0.1mg/L 是适合诱导叉柱花生根的培养基。2.4 炼苗及移栽生根诱导培养25d 左右，叉柱花幼苗的根一般达到长1cm，株高 3cm 左右。在开盖炼苗期间，生长变慢，叶片变厚。在移栽5 7d 后，植株叶片转绿，有新根长出，成活率在 95%以上（图 4）。 3 讨论观赏水草品种已经超过 500 多种，但是

11、其中绝大多数来源于美洲、非洲、东南亚等热带地区，广州已经成为我国大陆最大的水草集散地。观赏水草市场需求量大，已经发展成为一种重要的经济植物，但是观赏水草的繁殖系数较低，种苗问题严重制约水草产业的发展。叉柱花造型优美、适应性强、容易管理，适合作为前景草，市场上供不应求。但是，叉柱花在冬季的时候，容易开花，市场上稀少。叉柱花的种苗缺乏和避免冬季开花是目前急需解决的问题。植物组织培养技术能解决短时间内大量扩繁种苗和通过室内培养避免冬季开花，在叉柱花的生产上有着重要的意义。目前植物组织培养快速繁殖在技术上非常成熟，只是生产成本的高低关系到应用范围。在植物快繁技术中无菌外植体的获得和增殖效率是关键。叉柱

12、花是水生植物，长期生长在水中，内生菌丰富，获得无菌材料尤为重要。 Hg-Cl2 消毒在植物组织培养研究中效果最好，在水草的组培应用较多，均能成功得到无菌外植体，消毒时间的控制最为关键。消毒时间与材料的幼嫩、生理状态、表面是否光滑等相关。叉柱花的幼嫩茎段在0.1%HgCl2处理 9 1 0min 能获得无菌材料， 在这个时间内达到一个平衡，即杀死细菌和真菌但对植物本身没有伤害。在激素方面由于植物组织培养快速繁殖技术非常成熟，有较多文献可以参考。在生产上，研究者往往结合自己的经验设置简单的梯度获得适合的体系。本研究结合以往的结果，通过设置 6-BA 和 KT 的协同作用，促进丛芽的增殖，结合增殖系数和丛芽质量得到了适合叉柱花的增殖体系。NAA 和 IBA 是常用的生根诱导激素，NAA 的价格要比IBA 便宜，为了节省生产成本， NAA 使用更为广泛，通过两者的配合使用得到叉柱花的根在数量和质量完全能够满足生产上的需求。组织培养技术和栽培技术的结合，在短期内大量提供叉柱花的种苗，克服冬季开花的问题，保障冬季供应市场，提高种植和销售者的收入，促进观赏水草产业的发展。