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1、会计学1PCR扩增和电泳检测扩增和电泳检测电电 泳泳观察PCR反应反应 实验步骤第1页/共32页模板：模板：酶：酶：原料、能量：原料、能量：解旋酶、解旋酶、DNADNA聚合酶等。聚合酶等。DNADNA分子的每条链分子的每条链dATPdATP、dGTPdGTP、dCTPdCTP、dTTPdTTP引物：引物：温和的反应条件温和的反应条件第2页/共32页DNADNA分子的结构分子的结构第3页/共32页合成合成DNADNA分子的原料分子的原料脱氧核苷三磷酸脱氧核苷三磷酸第4页/共32页合成合成DNADNA分子的原料分子的原料脱氧核苷三磷酸脱氧核苷三磷酸dATP dGTP dCTP dTTP第5页/共3
2、2页53OPGOPA模板链CTA35引物3355OHOPGOPAOOHTP模板链CTA35引物333555POOHTPP35第6页/共32页DNA聚合酶聚合酶第7页/共32页 不同生物细胞不同生物细胞 需要的时间需要的时间细细 菌菌一般是一般是20203030分钟分钟蚕豆根尖细胞蚕豆根尖细胞17.317.3小时小时小鼠十二指肠细胞小鼠十二指肠细胞15.315.3小时小时人的肝细胞人的肝细胞2222小时小时人的宫颈癌细胞人的宫颈癌细胞22.522.5小时小时PCRPCR技术可在技术可在几小时内几小时内，将特定核酸序列扩增将特定核酸序列扩增百万倍百万倍! !第8页/共32页第9页/共32页PCRP
3、CR缓冲液：缓冲液：维持维持pH，保护，保护Taq酶酶第10页/共32页变变 性性退火退火 延伸延伸 第11页/共32页PCR三步曲三步曲 预变性预变性保温保温 变变 性性9095延伸延伸 7075退火退火 4060第12页/共32页PCR仪仪第13页/共32页用于用于PCR的预混液（的预混液（ 500 L 体系）：体系）： ddH2O 310 310 L L1010butter 5butter 50 0 L LMgClMgCl2 2 40 40 L LdNTPdNTP混合液混合液 2020 L L引物引物1 251 25 L L引物引物2 252 25 L L模板模板DNA 2525 L L
4、 Taq DNATaq DNA聚合酶聚合酶 5 5 L L 标记一个微量离心管，用取样器取标记一个微量离心管，用取样器取20 L的预混液的预混液加入到该管中。加入到该管中。第14页/共32页反应试剂反应试剂 用量用量PCR SuperMix 10L引物（浓度10M） 1L引物（浓度10M） 1L模板DNA 5LddH2O 3L总体积 20L第15页/共32页第16页/共32页变性变性 94 30 s退火退火 52 30 s延伸延伸 72 60 s 预变性预变性 94 300 s保温保温 72 600 s循环次数循环次数 35第17页/共32页第18页/共32页第19页/共32页第20页/共32
5、页使用使用电泳缓冲液在制胶器上配电泳缓冲液在制胶器上配制制1.0%的琼脂糖凝胶。的琼脂糖凝胶。2L载样缓冲液、载样缓冲液、 2L 核酸荧核酸荧光染料，光染料，10LPCR产物混匀产物混匀。将上步混好的样将上步混好的样10 L加到凝胶加到凝胶孔中孔中。90V电压下电泳电压下电泳1020min。第21页/共32页将凝胶倒入制胶器的槽中将凝胶倒入制胶器的槽中（60oC）将琼脂糖加入电泳缓冲液将琼脂糖加入电泳缓冲液,在微波炉中在微波炉中加热溶解至透明加热溶解至透明。第22页/共32页第23页/共32页向电泳槽中加入电泳缓冲液至没过凝胶向电泳槽中加入电泳缓冲液至没过凝胶 第24页/共32页 琼脂糖凝胶电
6、泳中琼脂糖凝胶电泳中缓冲液的作用缓冲液的作用1 1、增加电导率；、增加电导率；2 2、维持电泳过程中、维持电泳过程中的合适的的合适的pHpH。第25页/共32页将将PCR产物与加样缓冲液充分混合产物与加样缓冲液充分混合（吸排几次吸排几次） 第26页/共32页常用的上样缓冲液配方及各成分的作用常用的上样缓冲液配方及各成分的作用蔗糖蔗糖使样品呈色，便于上样，使样品呈色，便于上样，形成可见指示带，预测电泳进程。形成可见指示带，预测电泳进程。溴酚蓝溴酚蓝增加样品密度，保证增加样品密度，保证DNADNA均匀沉均匀沉入加样孔内。入加样孔内。核酸荧光染料核酸荧光染料可嵌合入可嵌合入DNADNA分子，在特定激发分子，在特定激发光源的激发下可发出荧光，荧光源的激发下可发出荧光，荧光强度与光强度与DNADNA含量成正比。含量成正比。（需要与加样缓冲液混合）（需要与加样缓冲液混合）第27页/共32页第28页/共32页第29页/共32页电泳结果的观察电泳结果的观察在在DNADNA电泳图谱观察仪中观察核酸条带并拍照。电泳图谱观察仪中观察核酸条带并拍照。第30页/共32页第31页/共32页
PCR扩增和电泳检测教案
