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1、会计学1PCR法获取目的基因法获取目的基因第1页/共22页第2页/共22页1.Khorana1.Khorana等等19711971年提出在体外经年提出在体外经DNADNA变性、变性、与适当引物杂交、再用与适当引物杂交、再用DNADNA聚合酶延伸聚合酶延伸, ,克隆克隆DNADNA的设想。的设想。2.19832.1983年年,Mullis,Mullis发明了发明了PCRPCR技术技术, ,使使KhoranaKhorana的设想得到实现。的设想得到实现。3.19883.1988年年SaikiSaiki等将耐热等将耐热DNADNA聚合酶（聚合酶（TaqTaq）引入了）引入了PCRPCR技术。技术。
2、4.19884.1988年，第一台年，第一台PCRPCR仪问世。仪问世。5.19895.1989年美国年美国ScienceScience杂志比喻杂志比喻19891989年为年为PCRPCR爆炸年爆炸年,Mullis,Mullis荣获荣获19931993年度诺贝尔化学奖。年度诺贝尔化学奖。第3页/共22页在微量离心管中在微量离心管中,加加入适量的缓冲液入适量的缓冲液, 微量的微量的模板模板DNA,四种脱氧核苷四种脱氧核苷酸酸,耐热性耐热性DNA聚合酶聚合酶, 一对合成一对合成DNA的引物的引物,通通过过高温变性高温变性、低温退火低温退火和中和中温延伸温延伸三个阶段的三个阶段的循环合成循环合成DN
3、A，每一次，每一次循环使特异区段的基因循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍。一般拷贝数放大一倍。一般样品经过样品经过30次循环次循环,可使可使基因的拷贝数达到数百基因的拷贝数达到数百万。万。 第4页/共22页 （1）类似于）类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于寡核苷酸引物的存的天然复制过程，其特异性依赖于寡核苷酸引物的存在在 （3）重复）重复“变性变性-退火退火-延伸延伸”的循环，可获得大量的新的循环，可获得大量的新DNA链，而链，而且这种新链又可成为下次循环的模板，从而指数级地获得大量且这种新链又可成为下次循环的模板，从而指数级地获得大量DNA产物，数小时内可使目的基因的数量扩增数百万倍
4、。产物，数小时内可使目的基因的数量扩增数百万倍。（2）PCR过程：由变性过程：由变性复性（退火）复性（退火）-延伸三延伸三个基本反应步骤构成个基本反应步骤构成 变性：变性：94左右，使双链左右，使双链DNA模板解离成为模板解离成为单链；单链； 复性：复性：55左右，引物与模板左右，引物与模板DNA单链互补单链互补配对结合；配对结合； 延伸：延伸：72左右，左右，“模板模板-引物结合物引物结合物”在在DNA聚合酶作用下，以聚合酶作用下，以dNTP为原料，以靶为原料，以靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成新的合成新的DNA链链第5页/共22页第6页
5、/共22页Taq酶酶0.5L第7页/共22页PCR排管第8页/共22页扩增出的目标基因第9页/共22页转移点样进行电泳扩增出的目的基因第10页/共22页第11页/共22页PCR技术的注意事项1.合理分隔实验室合理分隔实验室将样品的处理、配制PCR反应液、PCR循环扩增及PCR产物的鉴定等步骤分区或分室进行，特别注意样本处理及PCR产物的鉴定应与其他步骤严格分开。2.吸样枪吸样枪由于操作时不慎将样品或模板核酸吸入枪内或粘上枪头是一个严重的污染源，因而加样或吸取模板核酸时要十分小心，吸样要慢，吸样时尽量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或产生气溶胶污染。 3.试剂分装试剂分装所有的PCR试剂都应
6、小量分装，-20保存，以减少重复加样次数，避免污染机会。另外，PCR试剂和PCR反应液应与样品及PCR产物分开保存。4.防止操作人员污染防止操作人员污染一次性手套、吸头、小离心管应一次性使用。 第12页/共22页第13页/共22页第14页/共22页第15页/共22页33第16页/共22页 第17页/共22页荧光定位PCR技术（FQ-PCR）FQ-PCR的工作原理是利用Taq 酶的5 3外切酶活性，在PCR反应系统中加入一个荧光标记的探针。该探针可与引物包含序列内的DNA模板发生特异性杂交，探针的5端标以荧光报告基团，靠近3端标以荧光淬灭基团，两者之间构成能量传递结构。当PCR反应每复制一个特异核酸片段，就有一个探针被切断，伴随一个荧光信号的释放。由于被释放的荧光基团数目和PCR产物是一对一的关系，因此用荧光检测技术检测出的荧光信号有无或强弱，即代表扩增产物有无或多少。由于荧光信号是代表扩增产物的有效特异信号,实现了仪器实时检测，为新的PCR定量原理创造了条件。第18页/共22页第19页/共22页第20页/共22页第21页/共22页
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