2019年植物组织培养

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1、植物组织培养：概念：在无菌和人工控制的环境下，利用适当的培养基，对离体的植物器官，组织，细胞及原生质体进行培养，使其再生细胞或完整植株的技术。分类：愈伤组织培养、悬浮细胞培养、器官培养、茎尖分生培养、组织培养、原生质体培养。理论依据：细胞的全能性：任何有完整细胞核的植物细胞，具有全部的遗传信息，在一定条件下均具有分化，发育成一个完整植株的潜在能力。细胞全性实现条件：1.组织或器官离体（解除植物其余部分对这些细胞质的抑制性）2.给与所需营养条件，特别是激素对器官分化起决定性作用。分化途径：外植体（离体的植物器官、组织、细胞）经过脱分化形成愈伤组织，经过再分化形成不定根、不定芽和胚状体，最后形成植

2、株，或者直接由外植体分化形成不定根、不定芽和胚状体，然后形成植株。应用前景：1.理论研究方面的应用：研究细胞分化和器官建成响应因素的主要方法2植物离体快繁3.人工种子的制备4.次生产代谢物的产生5.脱毒培养6.种质资源的保存和交换7.遗传操作实验室:1.准备室:功能：材料培养器械的清洗，培养基、灭菌的准备工作普通化学实验室：仪器：纯水仪、冰箱、移液枪、过滤灭菌器、电炉、微波炉、磁力搅拌器、低速台式离心机、电脑。作用：配制培养基洗涤室：仪器：储存器皿设备、鼓风干燥箱。作用：洗涤用具灭菌室：仪器：棉塞、无菌纸。作用：灭菌消毒2.无菌操作室：功能：进行植物材料分离接种的重要场所，需长时间的无菌操作对

3、组织培养成功起关键作用。仪器：超净工作台、紫外灯、固定式和移动载物台、消毒器、酒精灯、广口瓶、酒精棉、机械支架、手术剪、解离刀、解剖针3.培养功能：进行材料的培养场所。设备：可控光、温、湿度等设备，固定式培养架，转床，摇床，适当的培养基4.细胞学实验室：功能：细胞学和组织学观察。设备：高倍显微镜，切片机，相机，恒温箱5.温室：功能：组培苗的移栽锻炼。灭菌方法及适用范围：概念：1.灭菌：灭杀或出去物体表面和空隙内的所有微生物。2.消毒：杀死物体上的病源微生物灭菌方法:1.干热灭菌法适用玻璃器皿2.温热灭菌法适用培养基灭菌3.蒸熏灭菌法适用培养室、接种室灭菌4.过滤灭菌法适用液体培养基5.药剂灭菌

4、法适用培养材料灭菌6.灼烧灭菌法适用接种器具7.射线灭菌法适用室内灭菌培养基主要成分及作用：无机盐类：构成植物细胞中核酸、蛋白质以及生物膜系统等必不可少的营养元素有机化合物：提供碳源和能源植物生长调节物质：不仅可以促进植物组织的脱分化和形成愈伤组织，还可以诱导不定芽、不定胚的形成附加物：减少外植体的褐变。培养基种类及特点：按目的分：1.诱导培养基：外植体诱导产生愈伤组织的培养基2.继代培养基：使愈伤组织继续生长.分化培养基：诱导愈伤组织分化4.生根培养基：诱导再生苗生根的培养基按物理状态分：1.固体培养基：方便占地不大但植株只能与部分培养基接触，受营养不均匀2.液体培养基：吸收营养充分，换液较

5、复杂细胞的组织培养：对植物器官或愈伤组织上分离出的单细胞进行培养，形成单细胞无性系或再生植株的技术。单细胞分离方法:机械法:优点1.细胞不受酶的伤害2.不会发生质壁分离。缺点：1.要求薄壁细胞排列分散2.产量低酶解法：优点：分离细胞能得到较均匀一致的海绵组织细胞或栅栏组织细胞。缺点：分离细胞时，必须给酶溶液给予渗透压保护，防治细胞胀裂。由培养的愈伤组织中分离单细胞:振荡的作用：1.对细胞团施加一定的缓和压力。使之破碎成小细胞团或单细胞2.使细胞与细胞团在培养基中均匀分布.促进培养基气体交换，保证正常呼吸单细胞的培养方法：平板培养：是将悬浮培养的细胞接种到未固化的薄层培养基中，使其与培养基充分混

6、合，再倒入培养皿中进行培养的方法。培养过程中应注意：1.选择合适的培养基，以降低细胞起始密度2.选用分裂旺盛时期的细胞（分裂能力强，不用处于静止期过久的细胞）3.培养基的温度要严格控制135C,过低，操作困难，凝固块使细胞分布不均匀。过高，细胞受伤害看护培养法：用同种或异种材料的愈伤组织作为看护组织来培养细胞的一种方法。特点：不仅给单细胞提供了营养成分，而且还提供了促进细胞分裂的其他活性物质。微室培养：将细胞放到人工制造的小室中进行培养的方法。优点：在培养过程中可以连续进行显微观察，把一个细胞的生长、分裂和形成细胞团的全部过程记录下来。条件培养基培养：在培养基中加入高密度的细胞进行培养，一定时

7、间后这些细胞就会向培养基中分泌一些物质，使培养基条件化。细胞的悬浮培养（P109）:将游离的植物细胞按一定的细胞密度，悬浮在液体培养基中进行培养的方法。分批培养（P109）：把细胞分散在一定容积的培养基进行培养，建立单细胞培养物的方法。变化曲线“S”形：延滞期:细胞很少分裂指数生长期：细胞分裂活跃（细胞体积小，容易结团）指数生长期：细胞增值最快，单位时间内细胞增长数目大体一致（细胞体积增加，很少结团）缓慢期：由于营养耗尽或有毒代谢物的积累，细胞增长变慢静止期：生长趋于完全静止。半连续培养（P110）：利用培养罐进行细胞大量培养的方式。在半连续培养中，当培养罐内细胞数目增殖到一定量后，倒出一半细

8、胞悬浮液于另一个培养罐内，在分别加入新鲜培养基继续进行培养。特点：能够重复获得大量均匀一致的培养细胞。连续培养（P110）:利用特种的培养容器进行大规模细胞培养的方式。封闭性连续培养：在培养过程中，排出的旧培养基由加入的新鲜培养基进行补充，进出数量保持平衡，从而使培养系统中营养物质的总含量总是超过细胞生长的需要。特点：在培养过程中，细胞的密度会不断增加开放型连续培养：在连续培养中，注入的新鲜培养液的容积与流出的培养液容积相等，其中细胞的密度也保持恒定，并通过调节流出和流入的速度，使培养细胞的生长速度一致保持在一个稳定状态，流出的细胞数相当于培养系统中新细胞的增加数。特点：细胞密度保持恒定。浊度

9、恒定式：用一支比浊计或分光光度计来测定培养液中细胞的浑浊度，新鲜的培养液流入量与旧培养液的流出量都受光电计自动控制。当培养液中细胞密度增加时，光透量减少，从而给培养液入口一个信号，加入一定量的新培养液，同时流出等量的旧培养液，保持体积不变。当光透过量增加时，会自动停止新鲜培养液的注入和旧培养液的流出化学恒定式：米用两种方法1.固定速度注入新鲜培养基2.控制培养液的进入速度，是细胞稀释的速度正好和细胞增殖的速度相同。生长的测定（P115）:细胞计数：为提高细胞计数的准确性，可先用铬酸或果胶酶对细胞和细胞团进行处理，以增加细胞的分散性。细胞密实体积：以每毫升培养液中细胞总体积的毫升数表示。鲜重：用

10、已知重量的干尼龙网收集细胞，用水洗去培养基，真空抽滤以除去细胞多余的水分，称量。干重：用已知重量的干尼龙网收集细胞，在60C下干燥12h,在称量。细胞干重以每毫升培养物或每io6个细胞的重量来表示细胞有丝分裂的指数：在一个细胞群体中，处于有丝分裂的细胞占细胞总数的百分数。一个迅速生长的细胞群体其有丝分裂指数为3%5%。对于愈伤组织一般是采用孚尔根染色法。植板率：表示能分裂长出细胞团的细胞占接种细胞总数的百分比。植板率=每个平板形成的细胞团数/每个平板接种的细胞总数X100细胞活力测定：TTC（四唑盐还原法）：活细胞由于呼吸作用可产生还原力，可将三苯思唑氯化物还原呈红色染料，据此可测定细胞的呼吸

11、效率。还可将还原的TTC红色染料用乙酸乙酯提取出来，用分光光度计进行测定，计算细胞的相对活力FDA（荧光素二乙酸法）：FDA即不发荧光也不具有极性，能自由地穿过细胞膜进入细胞内部，在活细胞内FDA被酯酶分解，产生荧光素，在荧光显微镜下观察到产生荧光的细胞，表明是有活力的细胞，相反则是无活力的细胞。细胞活力以发绿色荧光的活细胞的百分数表示伊凡蓝染色法：当用伊凡蓝的稀溶液对细胞进行处理时，只有死细胞和活力受损伤的细胞能够吸收这种染料，而完整的活细胞不能摄取或积累这种染料。细胞活力以未染色的活细胞数占总观察细胞数的百分数来表示。原生质体的分离和纯化：分离：机械法：缺点：量少，只能取液泡化程度大的长形

12、细胞酶分离法：1.两步法：先用果胶酶处理材料，游离出单细胞，然后再用纤维素酶处理单细胞，然后再用纤维素酶处理单细胞，分离出原生质体。优点：所获得的原生质体均匀一致、质量好，但操作繁杂，2.步法：将纤维素酶和果胶酶等配置成混合酶液来处理材料，一步获得原生质体，操作简便。纯化：沉降法：原理：利用比重原理，在具有一定渗透压的溶液中进行过滤离心，使纯净完整的原生质体沉积于试管底部。优点：纯化收集方便。缺点：原生质体纯度不高。漂浮法：原理：采用比重大于原生质体的高渗蔗糖溶液，离心后，使原生质体漂浮于液体表面而残渣碎屑沉降于底部。优点：获得的原生质体纯度高。缺点：原生质体的收率低，高渗溶液对原生质体有害。

13、界面法：原理：利用两种比重不同的溶液，使完整的原生质体处于两液相约的界面之中。优点：可收集到较大纯净的原生质体，避免收集过程中细胞破损。影响原生质体数量和活力的因素：光：黑暗，静止条件下温度：25C30C酶解时间：小于24h太长时间影响活力细胞壁降解酶的种类和组合渗透压稳定剂原生质膜稳定剂PH原生质体融合：通过物理或化学方法使原生质体融合，经培养获得具有双亲全部遗传物质的后代的方法。原理：细胞膜表面有稳定的疏水性基团，具有膜电位，因其静电斥力使原生质体不能吸附在一起。1.化学融合法：带有阴离子的的PEG分子等与原生质体表面的阴离子之间在Ca2连接下形成共同的静电键，从而促进了原生质体间的黏着和

14、结合。2.物理法融合法：对融合槽的两个平行电极施加高频交流电压，产生电泳效应，使融合槽内的原生体偶极化并沿着电场的方向排列成串珠状，再施加瞬间的高压直流脉冲，使黏合相邻的原生质体膜局部发生可逆性瞬间穿孔，然后，原生质体膜连接、闭合，最终融为一体。方法：1.物理方法：离心、振动、电刺激2.电融合：微电极控制仪。杂种细胞的选择：互补筛选法：1.激素自养型互补选择2.白化互补选择3.营养缺陷型互补选择4.抗性突变互补选择5.基因互补选择机械筛选法：1.一种方法是设计一个选择程序，使在某种条件下只有杂种细胞生长，而任何一个亲本不能在此条件下生长，生长缓慢或中途夭折，存活下来的为杂种细胞2.借助于显微镜

15、技术将融合体或杂种细胞直接挑选出来继续单独培养，目前较有发展前途的是荧光协调技术与显微镜结合的方法。杂种植株的鉴定：1.形态学鉴定2.杂种和亲本的核型分析3.生物化学鉴定4.分子生物学鉴定遗传的特点：.体细胞无性系的遗传稳定性（离体培养的细胞学基础是有丝分裂）2即使发生变异，也可以及时淘汰变异。变异的特点：.普遍性：可发生在各种培养类型中，发生在各种植株的培养中，变异发生与培养类型有关。2局限性：从表型上看，植株形态，生长势，盲性，某些抗性等性状的变异。从生理生化上看，易出现同工酶谱，次生代谢的消长等变异、3嵌合性：指同一有机体中同时存在有遗传组成不同的细胞，是组培中的常见现象，器官、离体培养

16、时易发生嵌合。影响遗传变异的因素：1.供体植株：供体植株倍性水平：多倍体和染色体数目多的植株其变异频率比二倍体和单被体高，多倍体染色组以缓冲染色体数目变异引起的不平衡，突变体易成活基因型外植体分化程度：分化程度高的分生细胞变异少。2培养基及培养方式：不同的激素浓度可以有选择地诱导不同倍性的细胞分裂，激素除了引起染色体倍性的增加外，在一些培养中及发现染色体倍性减少的现象3继代次数：一般来讲，继代时间越长，继代次数越多细胞变异的几率就越高。体细胞无性系变异的诱导、筛选与应用：诱导：1.离体培养细胞的自发突变：组培后变异的原因：a分化程度不同，嵌合性。B植株的再生式，生长调节物质，继代培养的时间c由

17、外遗传变异及生理作用引起的变异外植体为体细胞的称体细胞变异，为性细胞的为性细胞变异体细胞无性系自发变异的特征表现在：随机性，无法精确分批重复2人工诱发突变：物理方法：X射线、Y射线等。优点：使用方便，干净，穿透力强，重复性好，突变频率高，但需要专门的设备化学诱变：碱基类似物，移码诱变剂等。优点：部需要专门设备，操作简便，在一定程度上克服了物理方法的缺点。3.体细胞无性系变异机理：染色体数目与结构变异DNA扩增和转座DNA甲基化状态外遗传变异筛选：农作物的品质改良抗病突变体抗除草剂突变体抗逆突变体应用：创造育种中间材料或直接筛选新品种遗传研究发育生物学研究生化代谢途径研究胚培养：类型：成熟胚培养

18、：一般在比较简单的培养基上就能萌发，只需要提供合适生长条件，打破休眠幼胚培养：尚未成熟发育即发育早期的胚，它较成熟胚难培养，要求的技术和条件也较高，关键是维持胚性生长。幼胚培养生长方式：继续进行正常的胚胎发育，维持胚性生长迅速萌发成为幼苗，不能维持胚性生长（早熟萌发）。早熟萌发形成的幼苗往往畸形瘦弱，甚至死亡。应用：克服远缘杂交不亲和打破种子休眠缩短育种周期克服种子的自然不育性离体授粉：概念：将未授粉的胚珠或子房从母体上分离下来，进行无菌培养，并以一定的方式授以无菌花粉，使之在试管内时间受精技术。意义：克服受精前障碍获得可育种子。类型：1.离体柱头授粉：通过雌蕊的离体培养，使无菌花粉授于柱头上

19、，得到含有可育的种子和果实2.离体子房授粉：通过人工方法将花粉直接引入子房，使花粉在子房腔内萌发，并进行正常受精，获得有活力的种子。作用：克服受精前障碍有效途径。花粉粒引入子房有两种方法：一是直接引入，二是注射法.离体胚珠授粉：指离体培养未受精的胚珠，并在胚珠上授粉，最终在试管内结出正常种子的技术。作用：即可排除柱头和花柱组织对于受精的障碍，由可克服活体子房的脱落。单倍体：发生方式：孤雌生殖：由未受精的卵细胞发育。孤雄生殖：由精细胞发育而来无融合生殖：由胚囊中卵细胞以外的其他细胞发育人工诱发单倍体：激素处理，远缘杂交，延迟授粉等。雄核发育途径（人工诱导单倍体产生途径）：A途径：小孢子的第一次有

20、丝分裂按胚子体方式进行，为不均等分裂，形成营养细胞和生殖细胞。B途径：小孢子第一次有丝分裂为均等分裂，形成两个大小相近的细胞，以后，由这两个细胞连续分裂产生单一类细胞组成的多细胞花粉或多核花粉。离体培养花药和花粉：概念：使小孢子改变原有胚子体发育途径，转向孢子体发育途径，形成花粉胚或花粉愈伤组织，最后形成花粉植株，并从中鉴定出单倍体植株。基本程序：外植体选择外植体预处理外植体消毒剥取花药（分离花粉粒）-接种-诱导培养-分化培养外植体预处理对花粉培养的影响：1.低温处理：3C保存48h,提高30%诱导率。原因：低温可改变第一次有丝分裂的纺锤体轴向，使之均等分裂，使花药朝胚胎方向发展低温使花粉保持

21、了较长时间的活力，使花粉向胚胎发展2.离心处理3.乙烯处理：促使细胞核分裂单倍体植株的应用：1缩短育种年限加速F1代亲和体的纯化2.形成多倍体.形成自交系4.排除显隐性基因干扰，有利与进行突变体选择。植物离体繁殖（植物快繁）：概念：利用植物组织培养技术对外植体进行离体培养，使其短期内获得遗传性一致的大量再生植株的方法。优点：1.繁殖效率高2.培养条件可控性强.占用空间小4.管理方便，利于自动化控制应用：1.短期内获得大量性状优良，整齐一致的种苗群体加快引进新种，新育良种的繁殖，促进优良品种推广和应用2大量繁育原来常规方法不能进行无性繁殖，难繁殖和繁殖速度慢的一些植物，尤其对一些稀濒危植物更有意

22、义。.作为培育新品种的有效手段，繁殖和保存育种材料，如远缘杂种，多倍体，突变体。4通过径尖培养等技术，脱毒扩增脱毒苗，达到提纯复壮良种的目的5.种质资源的保存和交换快繁的营养形成方式：1短枝发生型：使外植体携带的带叶茎段，在适宜的培养环境中萌发，形成完整植株，再将其剪成带叶茎段，继代再成苗的繁殖方法。特点：能一次成苗，遗传性状稳定，培养过程简单，移栽成活率高2.器官型（丛芽发生型）：使外植体携带的顶芽或腋芽在适宜培养环境中不断发生腋芽而呈丛生芽，将单个芽转入生根培养基中，诱导生根成苗的繁殖方法。特点：由单芽到丛芽，繁殖速度快，遗传性状稳定，多数花卉，苗木的快繁属于此类。3.器官发生型（不定芽发

23、生型）：外植体在适宜培养基和培养条件下，经过脱分化形成愈伤组织，然后经过再分化诱导愈伤组织产生不定芽，或外植体不形成愈伤组织而直接从表面形成不定芽，将芽苗转移到生根培养中，经培养获得完整植株的繁殖方法。特点：繁殖速度快，由愈伤组织再生植株，遗传不稳定。烟草，水稻，小麦，番茄等4胚状体发生型：外植体在适宜培养环境中，经诱导产生体细胞胚的繁殖方法。特点：发生数量大，速度快，结构完整。人工种子繁殖，遗传变异。5.原球茎发生型：是兰科植物的一种快繁方式，它是指茎尖或腋芽外植体经培养产生原球茎的繁殖类型。特点：是兰花唯一有效的大规模无性繁殖方法植物快繁的程序：无菌母株的制备（初代培养：在无菌条件下，制备

24、无菌繁殖的材料称为无菌母株，或繁殖母株）-芽的继代增殖（无菌母株再次切割继代培养，其分化增殖成丛芽，加快繁殖速度）-芽苗的生根培养（试管内生根，试管外生根）宀再生植株的锻炼和移栽为什么再生植株要锻炼与移栽？答：移栽前后培养条件发生变化（试管苗：营养充足。自然条件下：营养缺乏。移栽后植株死亡的原因：1.根系结构不完善：不定根、根与芽的输导组织不相通，再生根的吸收功能差。2叶部结构不完善：缺少角质层或蜡质层，保水性差，缺乏叶表皮毛，保温反光性差，气孔开度过大，栅栏组织不完善克服死苗的方法：1.闭瓶炼苗：培养瓶中壮苗720天2.开瓶炼苗：37天，时间过长会引起培养基污染。.壮苗措施：培养基中加入适宜

25、的生长延缓剂4.炼苗措施：日光锻炼温度锻炼湿度锻炼移栽过程注意的问题：将小苗根系周围的培养基冲洗干净，以避免有害微生物的污染。筛选适宜的移栽基质，砂，蛭石，腐叶土和土壤配置使用，也可单独使用，以保持良好的保水性与通气性。选择使用营养体，苗床或塑料薄膜以及遮阳网，以调控光，温度，湿度等。当移栽后小苗开始生长表明植株适应环境。脱毒培养的程序：病感植物T热处理T茎尖分生组织培养T再生植株T再生根培养T炼苗移栽T病毒检测T脱毒种苗的繁殖或者：病感植物T热处理T茎尖分生组织培养T再生植株T病毒检测T增殖性繁殖T再生根培养T炼苗移栽T病毒检测T脱毒种苗的繁殖、脱毒苗保存脱毒方法：茎尖组织培养脱毒法：1.普

26、通茎尖培养。2.茎尖分生组织培养。原理：茎尖区域一般是无菌的热处理脱毒法（与茎尖组织培养脱毒法结合，即可较取较大的茎尖进行培养，提高成活率和增值率，又达到消除病毒的目的）：1.方法：热水：休眠芽，50C热水泡数分钟到一小时。热气：活跃茎尖，温度35C50C，时间长度各异（时间长短可根据病毒浓度，寄主蛋白含量，温度高低来确定。长时间的高温处理不能提高脱毒效率，仅降低茎尖的再生能力，可以采用逐渐升温，变温处理）2.原理：利用病毒和寄主植物对咼温的耐热性的差异。脱病毒植株的检测：直接测定法：形态，症状致使植物法：指接种某种病毒后能快速表现特有症状的植物。原理：病毒可以在指示植物上产生典型症状。抗血清

27、鉴定法：植物病毒由蛋白质和核酸组成的核蛋白是较好的抗原，注射到动物体中，动物在外来抗原刺激下产生抗体，存在与血清中，含抗体的血清为抗血清。原理：抗体与抗原特异性沉淀反应。方法：试管沉淀，琼脂双扩散法。酶联免疫吸附法：采用酶标记的抗体来指示抗原抗体的微量测定法。方法：将抗体固定在支持物上加入被检测的植物提取液然后加酶标记的抗体然后加入该种酶反应底物电镜鉴定法：电子显微镜分辨率能达到0.5卩m（六）核酸分析法：通过核酸杂交或PCR法，检测目标病毒的核酸序列。种质资源的保存：概念：利用天然或人工创造的适宜环境，借以保存种质资源方法：低温保存法高渗透压保存法生长抑制剂保存法降低氧分压保存法干燥保存法超

28、低温保存的基本程序：植物材料的选取材料的预处理、冷冻处理冷冻储存解冻处理细胞活力和变异评价再培养冷冻处理：1.慢冻法：先以15C/min的速度降温，降至一30一40C或一100C，平衡1h左右，此时细胞内的水分减少到最低限度，再将样品放入液氮中（至一196C）保存。适合大多数植物离体种质的保存，对茎尖和悬浮物尤其适用，但要求严格控制降温速度2.快冻法：对预处理过的材料以1001000C/min的速度降温，直至一196C冷冻保存。适合植物的花粉、种子等高度脱水的材料以及经低温锻炼的木本植物的枝条和芽。解冻处理：1.快速解冻法：把冷冻材料取出后，迅速放入3540C温水浴中解冻，并小心摇动，待材料中的冰晶完全融化为止。此法融冰的速度快，细胞内的水分来不及再次形成冰晶就已完全融化，因而对细胞的损伤较轻。2慢速解冻法：把材料置于0C或23C的低温下慢慢融化。少数超低温保存的材料只有采取慢速解冻才能存活，如木本植物的冬眠芽。冷冻防护剂：原理：冷冻防护剂在水溶液中产生强烈的水合作用，提高水溶液的黏滞性，从而降低细胞内盐的浓度和冰晶的形成，使细胞免受冻害常用的冷冻防护剂：甘油、二甲基亚砜（DMSO）、脯氨酸。特点（P203）:对植物来说，DMSO是最好的防护剂。而甘油因为渗透性低，需要慢慢加入。脯氨酸对许多植物来说是较好的防护剂，最适浓度是10%生物技术本）071李文煜总结