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1、实验四实验四 血清蛋白的醋酸纤维薄膜电血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳泳 目的1、掌握电泳的基本原理 2、掌握电泳的基本操作1实验四醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白概论原理原理-电泳电泳: :带电颗粒在电场中泳动的现象带电颗粒在电场中泳动的现象各种蛋白质在同一各种蛋白质在同一pHpH条件下，因分子量和电荷数量等不同而条件下，因分子量和电荷数量等不同而在电场中的迁移率不同而得以分开。在电场中的迁移率不同而得以分开。 不用支持物的不用支持物的 利用支持物利用支持物1 1）纸电泳）纸电泳2) 2) 淀粉凝胶电泳淀粉凝胶电泳3) 3) 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳4 4）醋酸纤维薄膜电泳）醋酸纤维薄膜电泳5 5
2、）聚丙烯酰胺凝胶电泳（）聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGEPAGE）2实验四醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白概论泳动度泳动度U U 泳动度：带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度泳动度：带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度 U=v/E=dl/Vt U=v/E=dl/Vt E: E:电场强度，每电场强度，每cmcm的电压降，的电压降，V/lV/l v: v:颗粒的移动速度，颗粒的移动速度，d/td/t d: d:颗粒的移动距离颗粒的移动距离 t: t:通电时间通电时间 V: V:加在支持物两端的实际电压加在支持物两端的实际电压 l: l:支持物的有效长度支持物的有效长度3实验四醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白概论影
3、响泳动速度的主要因素影响泳动速度的主要因素1 1）电场强度：（越大，移动速度越快）电场强度：（越大，移动速度越快） 常压电泳：常压电泳：100-500V100-500V，2-10V/cm2-10V/cm 高压电泳：高压电泳：500-10000V500-10000V， 20-200V/cm20-200V/cm2 2）溶液的）溶液的pHpH值：值：bufferbuffer。8.608.603 3）溶液的离子强度：）溶液的离子强度： （I I越大，速度越慢；缓冲越大，速度越慢；缓冲 效果越好）效果越好） ，0.02-0.20.02-0.2之间。之间。0.070.074 4）电渗现象：）电渗现象：液体
4、在电场中相对于固体支持物的相对移动。液体在电场中相对于固体支持物的相对移动。 尽量避免有高电渗作用的支持尽量避免有高电渗作用的支持物。物。4实验四醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白概论聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） Davis Davis 和和Ornstein 1959Ornstein 1959年年-人血清蛋白人血清蛋白 聚丙烯酰胺凝胶：丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝胶：丙烯酰胺（AcrAcr，单体），单体）和和N,NN,N-甲叉双甲叉双丙烯酰胺丙烯酰胺（BisBis，交联剂），交联剂）共聚合而成共聚合而成（由过硫酸铵（由过硫酸铵- -四乙基乙二四乙基乙二胺胺TEMEDTEMED系统或核黄素系统或核黄素-TE
5、MED-TEMED系统激发）系统激发）。 分子筛，可通过调节单体浓度或与交联剂的比例来控制分子筛，可通过调节单体浓度或与交联剂的比例来控制孔径大小，达到不同的分离目的。孔径大小，达到不同的分离目的。 凝胶可以是平板（垂直板型）或柱子（盘状）凝胶可以是平板（垂直板型）或柱子（盘状）5实验四醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白概论6实验四醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白概论7实验四醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白概论SDSSDS：十二烷基硫酸钠十二烷基硫酸钠CHCH3 3（CHCH2 2）1111OSOOSO3 3NaNa，阴离子去污剂，与蛋白阴离子去污剂，与蛋白质结合，能破裂蛋白质分子中的氢键和疏水作用质结合，
6、能破裂蛋白质分子中的氢键和疏水作用，破坏蛋白质的，破坏蛋白质的二级、三级、四级结构。二级、三级、四级结构。 1 1）先加还原剂如巯基乙醇打开）先加还原剂如巯基乙醇打开-S-S-S-S-； 2 2）SDSSDS破坏蛋白质构象，与氨基酸侧链充分结合，形成蛋白质亚破坏蛋白质构象，与氨基酸侧链充分结合，形成蛋白质亚基基-SDS-SDS胶束。胶束。SDSSDS是阴离子，使多肽链带上负电荷，该电荷量远远是阴离子，使多肽链带上负电荷，该电荷量远远超过蛋白质分子原有电荷量，掩盖了不同蛋白质之间的电荷差别。超过蛋白质分子原有电荷量，掩盖了不同蛋白质之间的电荷差别。电泳迁移率主要取决于蛋白质或亚基分子量的大小。电
7、泳迁移率主要取决于蛋白质或亚基分子量的大小。SDS-PAGE：十二烷基硫酸钠十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳8实验四醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白概论作作 用用 使蛋白质成为亚基物质，形成蛋白质使蛋白质成为亚基物质，形成蛋白质-SDS-SDS胶束，消除蛋胶束，消除蛋白质分子之间的电荷、形状差异；椭圆棒状，短轴均为白质分子之间的电荷、形状差异；椭圆棒状，短轴均为1.8nm1.8nm，长轴正比于蛋白质分子量。，长轴正比于蛋白质分子量。 MWMW在在1515 200kDa200kDa，电泳迁移率与分子量对数呈线性关系。，电泳迁移率与分子量对数呈线性关系。 logM=a-bRlogM
8、=a-bRf f，R Rf f为迁移率为迁移率9实验四醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白概论10实验四醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白概论醋酸纤维薄膜电泳(CAME) 以醋酸纤维薄膜以醋酸纤维薄膜( (CAM)CAM)作支持物的一种区带电泳技术，作支持物的一种区带电泳技术，将血清样品点样于醋纤膜上，在将血清样品点样于醋纤膜上，在pH8.6pH8.6的缓冲液中电泳，的缓冲液中电泳，血清蛋白质均带负电荷移向正极。血清蛋白质均带负电荷移向正极。 由于血清中各蛋白组分等电点不同而使表面净电荷量由于血清中各蛋白组分等电点不同而使表面净电荷量不等，加之分子大小和形状各异，因而电泳迁移率不不等，加之分子大小和形状各异
9、，因而电泳迁移率不同，彼此得以分离。同，彼此得以分离。 电泳后，电泳后，CAMCAM经染色和漂洗，可清晰呈现经染色和漂洗，可清晰呈现清蛋白、清蛋白、1 1、2 2、球蛋白球蛋白5 5条区带。条区带。11实验四醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白概论人血清中常见蛋白质的等电点和分子量人血清中常见蛋白质的等电点和分子量蛋白质 等电点 分子量 正常参考值（%）清蛋白 4.88 69000 57-681-球蛋白 5.06 200000 1.0-5.72-球蛋白 5.06 300000 4.9-11.2 -球蛋白 5.12 90000-150000 7-13-球蛋白 6.85-7.2 156000-300000
10、 9.8-18.2 负极 正极球蛋白球蛋白/ /-球蛋白球蛋白/2-球蛋白球蛋白/1-球蛋白球蛋白/清蛋白清蛋白12实验四醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白概论器 材 1醋酸纤维薄膜(8X2mm) 2点样器 3染色皿，漂洗器，镊子 4电泳仪：电泳仪电源，水平电泳槽13实验四醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白概论试剂1 1巴比妥缓冲液巴比妥缓冲液( (pH8.6 )pH8.6 )：取巴比妥钠取巴比妥钠12.7612.76g g，巴比妥巴比妥1.661.66g g，加蒸馏水加热溶解后稀释至加蒸馏水加热溶解后稀释至1 1升。升。2 2氨基黑氨基黑1010B B染色液：取氨基黑染色液：取氨基黑1010B 0.5g
11、B 0.5g，甲醇甲醇5050mlml，冰冰醋酸醋酸l0mll0ml，加水至加水至100100mlml。3 3漂洗液：漂洗液：9595乙醇乙醇4545mlml、冰醋酸冰醋酸5 5mlml、蒸馏水蒸馏水5050mlml14实验四醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白概论操作操作- -准备准备l l醋酸纤维薄膜醋酸纤维薄膜(CAM)(CAM)的准备：薄膜放进缓冲液中，自然的准备：薄膜放进缓冲液中，自然浸润，约浸润，约2020分钟。分钟。2 2电泳槽的准备：水平放置，将缓冲液注入电泳槽中，电泳槽的准备：水平放置，将缓冲液注入电泳槽中，两边缓冲液高度一致，架上滤纸桥，盖上电泳槽盖两边缓冲液高度一致，架上滤纸桥，
12、盖上电泳槽盖. .3 3点样：将充分浸透点样：将充分浸透( (指膜上无白色斑痕指膜上无白色斑痕) )的薄膜取出，的薄膜取出，用滤纸轻轻吸去膜上过多缓冲液，粗糙面用滤纸轻轻吸去膜上过多缓冲液，粗糙面( (无光泽面无光泽面) )用用于点样，载玻片蘸取血清，垂直印在于点样，载玻片蘸取血清，垂直印在CAMCAM粗糙面上。粗糙面上。15实验四醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白概论操作-电泳4 4加样后，将薄膜条架于支架两端，点样面朝下，点样侧置于负加样后，将薄膜条架于支架两端，点样面朝下，点样侧置于负极端。薄膜应平直无弯曲，加上槽盖平衡极端。薄膜应平直无弯曲，加上槽盖平衡5 5分钟后通电。分钟后通电。5 5连
13、接电泳槽与电泳仪对应的正负极，开启电源通电。电压连接电泳槽与电泳仪对应的正负极，开启电源通电。电压160V160V。电泳电泳5050分钟，断电。分钟，断电。6 6染色染色：用镊子取出薄膜条投入染液用镊子取出薄膜条投入染液8 8分钟，染色期间轻轻晃动染分钟，染色期间轻轻晃动染色皿，使染色充分。色皿，使染色充分。7. 7. 漂洗漂洗 : :从染液中取出薄膜条并尽量沥去染液，投入漂洗皿中反从染液中取出薄膜条并尽量沥去染液，投入漂洗皿中反复漂洗，直至背景漂净为止。此时清晰可见复漂洗，直至背景漂净为止。此时清晰可见5 5条色带，待干。条色带，待干。16实验四醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白概论实验报告实验报告将将薄膜条粘贴于实验报告，并标明各带所代薄膜条粘贴于实验报告，并标明各带所代表的蛋白质，完成实验报告。表的蛋白质，完成实验报告。( (本实验结束后，本实验结束后，电泳槽内的缓冲液不要倒掉；染电泳槽内的缓冲液不要倒掉；染色液需要回收，漂洗液请倒入废水缸色液需要回收，漂洗液请倒入废水缸) )。本周值日本周值日: :第四组第四组17实验四醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白概论实验四醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白概论
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