药物分析试验-武汉大学药学院

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1、药物分析实验武汉大学药学院- 0 -目录第一章药物分析实验须知2第一节药物分析实验的性质和基本要求2第二节实验室安全知识3第三节原始记录与实验报告5第四节 实验考核方式 5 第二章 药物的鉴别试验 6实验一 典型药物的鉴别试验 6 第三章 药物的杂质检查 12实验二药物的一般杂质检查-五种无机杂质的检查 13实验三药物的一般杂质检查-残留溶剂的检查 18实验四药物的特殊杂质检查-色谱分析法检查药物中的有关物质22第四章药物制剂的常规检查27实验五药物制剂的含量均匀度和溶出度检查28第五章药物的含量测定 36实验六双相滴定法测定水溶性有机酸盐类药物的含量37实验七亚硝酸钠滴定法测定含芳伯氨基药物

2、的含量39实验八非水溶液滴定法测定化学原料药含量42实验九旋光法、折光法和剩余滴定法测定葡萄糖注射液含量44实验十紫外分光光度法测定复方磺胺嘧啶片含量50实验十一高效液相色谱法测定复方磺胺甲噁唑片含量54实验十二 气相色谱法测定维生素 E 胶丸含量 60 第六章 综合性实验 63实验十三化学原料药及其制剂的全质量检验63实验十四 中药制剂的全质量检验 68 第七章 设计性实验 72实验十五药物制剂的HPLC含量测定方法建立与验证72实验十六药物制剂的毛细管电泳含量测定方法建立与验证74实验十七药品质量标准的制订76实验十八血浆或尿液中药物色谱分析方法的建立与验证76参考文献 83- 1 -第一

3、章药物分析实验须知第一节药物分析实验的性质和基本要求1药物分析实验的性质药物分析实验是药学专业本科生必修的主要实验课程之一，独立设课。 学生通过该课程的学习， 可以加深和巩固对药物分析理论知识的理解，正确掌握药物分析中的各种分析方法和基本操作技能，熟练使用各种分析仪器，全面了解药品检验工作的基本程序；具备独立开展药品质量控制的能力，并初步具有建立药物分析新方法、新技术的能力； 树立高度的责任意识、质量意识和安全意识，培养严肃认真、实事求是的科学态度和工作作风。2药物分析实验的基本要求（ 1）进入实验室应穿白色工作服，保持实验室安静及室内卫生和整洁，不得将与实验无关的任何物品带入实验室。不迟到、

4、不早退。（ 2）实验室禁止吃东西、吸烟。（ 3）实验课前做好预习，明确每次实验的目的要求，熟悉原理和操作要点，预先安排好实验进程，估计实验中可能发生的问题及处理办法。（ 4）认真掌握操作技术，细心观察实验现象。在严格按实验规程操作、虚心接受教师指导的同时，鼓励大胆创新，善于发现问题、提出问题和分析问题。（ 5）为防止试剂、药品污染，取用时应仔细观察标签和取用工具上的标志，杜绝错盖瓶盖或不随手加盖的现象发生。当不慎发生试剂污染时，应及时报告任课教师。公用试剂、药品应在指定位置取用。取出的试剂、药品不能再倒回原瓶。未经允许不得擅自动用实验室任何物品。（ 6）爱护仪器和公物，节约试剂、药品和水电；破

5、损仪器应及时登记报损、补发。使用精密仪器，需经教师同意，用毕登记签名。（ 7）可回收利用的废溶剂应回收至指定的容器中；有毒、腐蚀性等物质，按教师要求存放，不可任意丢弃；滤纸、火柴棒、碎玻璃等应投入废物篓，切勿丢入水池内。（ 8）实验完毕应认真清理实验台，仪器洗净后放回原处，擦净台面，晾好抹布、毛刷、放齐凳子、锁好柜子，经教师同意后，方可离开。值日生还应负责整理公用试剂台、打扫地面卫生、清除垃圾及废液篓中污物，并检查水、电、门、窗等安全事宜。（ 9）认真处理数据、总结实验结果，按要求撰写实验报告，并在规定时间内上交。2（ 10）各组及同学之间应相互协作，合理安排实验时间、实验内容和后续工作。第二

6、节实验室安全知识在药物分析实验中常接触到有腐蚀性、毒性、易燃烧或易爆炸的化学试剂和药品，以及各种电器设备，如使用不慎易发生危险。为了避免事故的发生，操作前应对各种药品、试剂的性质、 仪器的性能和正确操作方法有充分的了解，熟悉一般安全知识；必须严格遵守实验室的各种安全操作守则。要时刻注意防火、防爆， 发现事故苗头及时报告，不懂时不要擅自动手处理。下面介绍一般实验室中可能发生的危险及预防处理措施。1防火实验室中失火原因通常是使用或蒸馏易燃液体不谨慎或电器电线有故障。下面是预防失火的措施：（ 1）易燃烧物质不宜大量存放于实验室中，应贮存在密闭容器内并放于阴凉处。（ 2）加热低沸点或中等沸点等易燃液体

7、，例如乙醚、二硫化碳、丙酮、苯、酒精等最好是用水蒸气加热，至少用水浴加热，并时时察看检查，不得离开操作岗位。切不能用直火或油浴加热，因为它们的蒸气极易着火。（ 3）在实验中使用或倾倒易燃物质时，注意要远离火源。（ 4）身上或手上沾有易燃物质时，应立即清洗干净，不得靠近火源。（ 5）易燃液体的废液应倒入专用贮存器，不得倒入下水道，以免引起燃烧、爆炸等事故。（ 6）磷与空气接触，易自发着火，宜贮存在水中；金属钠暴露于空气中能自发着火，与水能起猛烈反应着火，应贮存于煤油中。2防爆（ 1）乙醚在室温时的蒸气压很高，乙醚和空气或氧气混合时能产生爆炸性极强的过氧化物，在蒸馏乙醚时应特别小心，切勿蒸干。（

8、2）无水过氯酸与还原剂接触能引起爆炸，无水过氯酸也能自发爆炸，常用的6070浓度的过氯酸的水溶液，则没有危险。（3）下列物质混合，都可能发生爆炸。金属钠或钾与水；高锰酸钾与浓硫酸、硫磺或甘油；过氯酸与乙醇；过氯酸盐或氯酸盐与浓硫酸；3硝酸钾与醋酸钠；氧化汞与硫磺；磷与硝酸、硝酸盐、氯酸盐。（ 4）易发生爆炸的操作不得对着人进行。（ 5）使用可燃性气体如氢气、乙炔等作为仪器的气源时，气瓶及仪器管道的接头处不能漏气，以免漏气后与空气混合发生爆炸。3有腐蚀性、毒性的试剂和药品（ 1）硫酸、盐酸、硝酸、冰醋酸、氢氟酸等酸类物质腐蚀性很强，能烫伤皮肤产生剧烈的疼痛，甚至发炎腐烂，酸也能损坏衣物。应特别注

9、意勿使酸溅入眼中，严重的能使眼睛失明。盐酸、硝酸、氢氟酸的蒸气对呼吸道粘膜及眼睛有强烈的刺激作用，因此在倾倒上述酸类时应在毒气橱中进行，或戴上经水或苏打溶液浸湿的口罩及防护眼镜。稀释硫酸时，应谨慎地将浓硫酸渐渐倾注水中，切不可把水倾注浓硫酸中。被酸烫伤时可用大量水冲洗，然后用 20苏打溶液洗拭。被氢氟酸烫伤时，先用大量冷水冲洗，后用5苏打溶液洗拭，再以甘油与氧化镁糊（2 1）的湿纱布包扎或到医院处理。（ 2）氢氧化钠、氢氧化钾等碱类物质，均能腐蚀皮肤及衣服，浓氨水的蒸气能严重刺激粘膜及伤害眼睛，使流泪并可能引发各种眼疾。被碱类烫伤时，应立即用大量水冲洗，然后再用 2硼酸或醋酸溶液冲洗。（ 3）

10、浓过氧化氢能引起烫伤，可用热水或硫代硫酸钠溶液敷治。苯酚有腐蚀性，使皮肤呈白色烫伤，应立即将其除去，否则引起局部糜烂，治愈极慢。（ 4）溴能刺激呼吸道、眼睛及烧伤皮肤。烧伤处用25氨溶液 - 松节油 -95乙醇（ 1 110）的混合液涂敷处理。（ 5）氰化钾、三氧化二砷、升汞、黄磷或白磷皆有剧毒，应严格按毒剧物有关规定保存、取用，切勿误入口中，使用后应及时洗手。4用电安全实验室中由于电线、电气设备损坏，或线路安装不妥，或使用不慎，或实验人员缺少用电常识，易发生触电事故或火灾。实验室用电一般应注意：（ 1）定期检查电线、电器设备有无损坏，绝缘是否良好，电线和接头有无损坏。（ 2）使用电器时，先应

11、认真阅读使用说明书，明确使用方法，不可盲目地接入电源。（ 3）使用烘箱和高温炉时，必须确认自动控制温度装置的可靠性，同时还需人工定时监测温度。（ 4）不要将电器放在潮湿处，禁止湿手或沾有食盐溶液和无机酸的手接触电器，也不4宜站在潮湿的地方使用电器。（ 5）正确操作闸刀开关，使闸刀处于完全合上或完全拉断的位置，不能若即若离，以防接触不良造成漏电。禁止将电线头直接插入插座内使用。5. 玻璃仪器洗涤玻璃器皿， 应注意安全，以防划伤； 破损的玻璃器皿和碎片应放入安全的地方，切勿乱丢乱放。第三节原始记录与实验报告进入实验室要随身携带一本预先编好页码的实验记录本，用于及时、完整、确切地记录原始实验数据和现

12、象，称为“原始记录 ”。实验过程中应尊重实验事实，应直接将原始记录记于实验记录本上，绝不允许记于纸条上、手上或其他地方再誉写，也不允许暂记在脑子里等下一个数据一起记录。原始记录是实验报告的一部分，尊重原始记录是必要的科学作风。记录本不准撕页， 如记录有误， 只能将写错处用双线划去 （但要求仍能看清原来写错的数值） ，在其旁写上正确数据，千万不得涂改，涂改的原始记录无效。记录内容一般包括供试药品名称、来源、批号、数量、规格、外观性状、包装情况、实验中观察到的现象、检验数据等。记录实验数据时，保留几位有效数字应和所用仪器的准确程度相适应。学生结束实验时，应向教师出示有关实验结果和原始记录，教师在原

13、始记录本上签字认可后，实验才能真正完毕。应根据原始记录，写出实验报告。实验报告应包括实验名称、实验日期、实验目的、实验原理、操作步骤、实验数据的处理及结果、问题及讨论、结论等。第四节实验考核方式药物分析实验课程主要考核学生是否具有：（ 1）良好的实验习惯，严谨求实的科学态度和工作作风， 大胆创新和积极发现问题、 提出问题、 分析问题和解决问题的精神和能力；（ 2）团结协作精神；（ 3）良好的实验动手能力；（ 4）数据处理与文字表达能力。平时成绩占 70%，期末考试成绩占 30%。平时成绩根据多元素给定，包括实验素养、实验预习、 实验前回答问题、 原始记录、 实验操作能力、 设计性实验的设计方案

14、、 实验报告等；期末考试包括笔试、 口试、实际操作，采取学生随机抽取实验内容，当堂完成实验并写出实验报告， 当堂公布评分标准和实验成绩的方式。具体实施细则可参考武汉大学药学院实验课考核规定。5第二章药物的鉴别试验药物的鉴别试验是根据药物的分子结构、理化性质， 采用化学、 物理化学或生物学方法来判断药物的真伪。它是药品质量检验工作的首要任务，只有在药物鉴别无误的前提下，药物的杂质检查和含量测定才有意义。中国药典和世界各国药典所收载的各药品项下的鉴别方法，均是用于证实贮藏在有标签容器中的药物是否为标签所标示的药物，而不是对未知药物进行定性分析。药物的鉴别试验项目包括性状、一般鉴别试验和专属鉴别试验

15、。一般鉴别试验是以某些类别药物的共同化学结构为依据。根据其相同的物理化学性质来进行药物真伪的鉴别，以区别不同类别的药物。而专属鉴别试验，则是在一般鉴别试验的基础上，利用各种药物的化学结构差异， 来鉴别药物， 以区别同类药物或具有相同化学结构部分的各个药物单体，达到最终确认药物真伪的目的。药物的鉴别方法可以分为化学法、光谱法、色谱法和生物学法。前两者最为常用，化学法主要包括呈色反应、沉淀生成反应、荧光反应、气体生成反应等鉴别方法，而光谱法常用的是紫外光谱鉴别法和红外光谱鉴别法。常常采用化学法与光谱法相结合来同时鉴别药物。每种药品一般选用24 种方法进行鉴别，相互取长补短。实验一典型药物的鉴别试验

16、一、实验目的1了解药物鉴别试验的目的和特点。2掌握药物的常用化学鉴别方法及其影响因素。3掌握紫外光谱鉴别法和红外光谱鉴别法。4判断有标签容器中的苯巴比妥、对氨基水杨酸钠、维生素 B1 片和注射用硫酸链霉素的真伪。二、基本原理（一）苯巴比妥的化学鉴别1银盐反应：巴比妥类药物在适当的碱性溶液中，遇过量硝酸银试液，即产生白色的6二银盐沉淀。2铜盐反应：因巴比妥类药物分子中含有-CONHCONHCO- 基因，可互变异构成烯醇型，与铜盐在碱性溶液中作用，产生类似双缩脲的颜色反应。与硫酸铜、 吡啶的反应式如下：HHOH-ONONOONOHR 1NHR1NR 1N+ H+R2R2R2OOO2+N2N+ Cu

17、SO 4Cu+ SO42-NR2 R1OH2+ON HONO-NNN2 R1N+OCuCuOR2NNNOONHR1OR23亚硝酸钠 -硫酸反应： 含芳环取代基的巴比妥类药物，与亚硝酸钠- 硫酸反应后，显橙黄色，其反应原理，可能是苯环上的亚硝基化反应。4甲醛 -硫酸反应：含芳环取代基的本类药物，与甲醛-硫酸反应显玫瑰红色，其反应产物不明。（二）对氨基水杨酸钠的化学鉴别对氨基水杨酸钠水溶液加稀盐酸酸化后，在中性或弱酸性（pH4 6）条件下能与三氯7化铁反应而显紫红色。COONaCOOHCOOOHH+OHpH 4-6O+ 4FeCl 3Fe Fe + 12HCl2NH 2NH 23NH 2（三）维生

18、素B1 的化学鉴别硫色素反应为维生素B1 所特有的专属反应，其反应式如下：NCH 2+CH 3NCH 2NCH 3NClNaOHH 3 CNNH 2 HCl SCH 2CH 2OH开环NNH2OH NaSCH 2CH2OHH 3C- H2ONNCH 3环合NNCH 3环合H 3CNNNaSCH 2 CH 2OHH 3CNNSCH 2CH 2OHH（ O）NNCH 3- 2 HH3CNNSCH 2CH 2 OH硫色素（四）硫酸链霉素的化学鉴别1 坂口反应 ：系链霉素水解产物链霉胍的特征反应。硫酸链霉素水溶液加氢氧化钠试液，水解生成链霉胍；链霉胍、8-羟基喹啉分别与次溴酸钠的反应产物缩合生成橙红色

19、化合物。反应式如下：RNH2 BrO -RNHBr-OHRNBr-Br -RN CN CN CNCNNH2NH 2NH 2NH 2链霉胍OHOHRONNBrNBr-N C NNHBrO2O8-羟基喹啉NRNNHH橙红色化合物2麦芽酚反应 ：系硫酸链霉素的特征反应。链霉素在碱性溶液中，链霉糖经分子重排形成六元环后，消除N-甲基 -L- 葡萄糖胺及链霉胍生成麦芽酚（-甲基 -羟基 -吡喃酮），麦芽酚与三价铁离子在微酸性溶液中形成紫红色配位化合物。反应式如下：8R OOROOFe/3OHNaOHFe3+OOOHH +H 2OCHOOCH3OCH3CH3链霉素麦芽酚紫红色配位化合物（五）影响化学鉴别的

20、因素影响化学鉴别反应的因素主要有溶液的浓度、试剂的用量、 溶液的温度、 溶液的酸碱度、反应时间等， 溶液的浓度主要是指被鉴别药物的浓度。溶液的浓度和各种试剂的用量一般是过量的。 溶液的酸碱度应使各反应物有足够的浓度处于反应活化状态，使反应生成物处于稳定和易于观测的状态。一般，温度升高，化学反应速度会增加，但也可使生成物分解，导致实验现象变得不明显，甚至观察不到阳性结果。有机反应的反应速度一般较慢，因此为使鉴别反应完成，需要一定时间。（六）紫外光谱鉴别法不同的有机药物由于含有能吸收不同紫外光的基团而显示特征紫外吸收光谱，可作为鉴别的依据。 UV 鉴别法简便，但UV 光谱的波长范围较窄、光谱简单、

21、平坦，曲线形状变化不大，尤其是有机分子的吸收波长和强度主要取决于分子中的发色团、助色团及其共轭情况，与精细结构无关。 因此， 结构完全相同的化合物应有完全相同的吸收光谱，而吸收光谱完全相同的化合物却不一定是同一个化合物。UV鉴别法的专属性远不如IR 鉴别法，不能单独使用，应与其他方法配合，才能对药物的真伪做出鉴别。常用的UV 鉴别方法有：1测定 max 或/ 和 min2规定一定浓度供试液在max 处的吸收度3规定吸收波长和吸收系数法4规定吸收波长和吸收度比值法5经化学处理后，测定产物的UV 特性（七）红外光谱鉴别法不同的有机药物由于含有能吸收不同红外光的基团而显示特征红外吸收光谱，可作为鉴别

22、的依据。 IR 光谱特征性强，专属性高，凡化学结构明确、组分单一的有机原料药物都可用 IR 鉴别，尤其是适合于结构复杂、且结构非常相似的药物的区别。中国药典和英国药典采用标准图谱对照法， 美国药典采用对照品法。 在实际操作中， 可根据实际条件选用其中任9一种方法。三、实验方法（一）苯巴比妥的鉴别1取供试品约50mg，加碳酸钠试液0.5ml 与水 5ml，振摇 2min，滤过（如不浑浊可不必滤过），滤液中逐滴加入硝酸银试液，即发生白色沉淀，振摇，沉淀即溶解，继续滴加过量的硝酸银试液，沉淀不再溶解。2取供试品约50mg，加吡啶溶液（ 1 10）5ml ，溶解后，加铜吡啶试液1ml ，即显紫色或生成

23、紫色沉淀。3取本品约10mg，加硫酸2 滴与亚硝酸钠约5mg，混合，即显橙黄色，随即转橙红色。4取本品约50mg，置试管中，加甲醛试液1ml，加热煮沸，冷却，沿管壁缓缓加硫酸0.5ml ，使成两液层，置水浴中加热，接界面显玫瑰红色。5本品的红外吸收光谱应与对照图谱一致。（二）对氨基水杨酸钠的鉴别1取本品约10mg，加水 10ml 溶解后， 加稀盐酸2 滴使成酸性， 加三氯化铁试液1 滴，应显紫红色。2本品 250mg，加 1mol/L 氢氧化钠溶液 3ml 溶解后，用水稀释至 500ml ，混匀。精密吸取该液 5ml 置于内含 12.5ml 磷酸盐缓冲液（ pH 7）的 250ml 量瓶中，用

24、水稀释至刻度，混匀。以相同的缓冲液为空白溶液，测定UV ，分别在 265nm 和 299nm 波长处有最大吸收，且 A 265 /A 299 比值应在 1.501.56 之间。3本品的红外吸收光谱应与对照图谱一致。（三）维生素B1 片的鉴别1取相当于5mg 维生素B1 的本品细粉适量，加水搅拌，滤过，滤液蒸干后，加氢氧化钠试液2.5ml 溶解，再加铁氰化钾试液0.5ml 与正丁醇5ml，强力振摇2min，放置使分层，上面的醇层显强烈的蓝色荧光；加酸使成酸性， 荧光即消失； 再加碱使成碱性， 荧光又重现。2取相当于5mg 维生素B1 的本品细粉适量，加水搅拌，滤过，滤液蒸干后，先加氨试液使成碱性

25、，将析出的沉淀滤过除去。取滤液，加稀硝酸使成酸性后，滴加硝酸银试液，即生成白色凝乳状沉淀；分离，沉淀加氨试液即溶解，再加稀硝酸酸化后，沉淀复生成。（四）注射用硫酸链霉素的鉴别1取本品约0.5mg，加水 4ml 溶解后，加氢氧化钠试液2.5ml 与 0.1% 8- 羟基喹啉的乙10醇溶液 1m1，放冷至约15，加次溴酸钠试液3 滴，即呈橙红色。2取本品约20mg，加水 5ml 溶解后，加氢氧化钠试液0.3ml ，置水浴上加热5min，加硫酸铁铵溶液（取硫酸铁铵0.1g，加 0.5mol/L 硫酸溶液5m1 使溶解） 0.5ml ，即呈紫红色。3本品的红外吸收光谱应与对照图谱一致。4本品的水溶液显

26、硫酸盐的鉴别反应。（ 1）取本品水溶液，滴加氯化钡试液，即生成BaSO4 白色沉淀；分离，沉淀在盐酸或硝酸中均不溶解。（2）取供试品溶液，滴加醋酸铅试液，即生成PbSO4 白色沉淀；分离，沉淀在醋酸铵试液或氢氧化钠试液中溶解。四、实验指导1苯巴比妥的铜盐反应中，样品量要足够50mg。亚硝酸钠 -硫酸反应中，应采用干燥试管或白色点滴板。甲醛-硫酸反应中，操作须细心，滴加硫酸时要慢，并且沿管壁加入，方能成两液层；然后放入刚煮沸过的水浴中，静置加热，时间应足够（约1 2min），则可得界面玫瑰红色。2 UV 鉴别法的注意事项：（ 1）由于常需采用规定波长、吸收度、吸收系数等的比对，故测定时应注意仪器

27、的波长、吸光度精度须符合要求。（ 2）对于吸收带很窄的药物，应考虑仪器狭缝对测定结果的影响。（ 3）根据药物的溶解性，选择合适的溶剂，不溶于水的药物常采用甲醇、乙醇或水-醇混合溶剂；当采用有机溶剂时，要注意溶剂的吸收波长是否对该鉴别波长产生干扰。（ 4）为了增加药物的溶解度或稳定性，或需要其在一定pH 条件下产生相应的特征吸收，常常在溶剂中加入一定浓度的酸、碱或缓冲液。3 IR 鉴别法的注意事项：（ 1）样品的纯度应大于 98，应不含水分。（ 2）空白片光谱图的基线应大于75透光率； 除在 3440cm 1 及 1630 cm 1 附近因残留或附着水而呈现一定吸收峰外，其他区域不应出现大于基线

28、3透光率的吸收谱带。（ 3）有机碱盐酸盐采用溴化钾压片时，可能发生复分解反应（ BHCl + KBr B HBr +KCl ），此时可采用氯化钾压片，并比较氯化钾压片和溴化钾压片法的光谱，若二者没有区别，则仍使用溴化钾压片。（ 4）供试品研磨应适度，以粒度 25m为宜。过度研磨可能导致晶格结构被破坏或晶型转化。粒度不够细则易引起光散射能量损失，整个光谱基线倾斜，甚至严重变形。11（ 5）压片法制成的片厚宜在 0.5mm 以下，否则可观察到干涉条纹，干扰供试品光谱。（ 6）样品扫描速度应与波长校正的条件一致， 因为快速扫描将使波长滞后。 制成图谱的最强吸收峰透光率应在 10以下。（ 7）药物制剂

29、采用 IR 法鉴别时，应对供试品进行前处理，以除去辅料的干扰。五、思考题1药物鉴别试验的目的和特点分别是什么？2影响化学鉴别反应的因素主要有哪些？3紫外光谱鉴别法、红外光谱鉴别法各有什么特点？第三章药物的杂质检查药物的检查包括四大方面，分别是有效性、均一性、安全性和纯度要求。 药物的纯度是指药物的纯净程度， 药物中的杂质是影响药物纯度的主要因素。因此，药物的纯度检查即是指药物的杂质检查。根据药物中杂质存在的广泛程度可分为一般杂质检查及特殊杂质检查。一般杂质是在大多数药物的生产和贮藏过程中都容易引入的杂质，如氯化物、 硫酸盐、铁盐、重金属、 砷盐、炽灼残渣、 残留溶剂等， 而特殊杂质是各个药物中

30、可能存在的原料、中间体、降解物、 异构体、 副反应产物等， 是该药在生产和贮藏过程中有可能引入的仅属该药特有的一些杂质。对于药物中所存在的杂质， 在不影响疗效、 不产生毒性和保证药物质量的前提下，允许药物中含有一定量的杂质。 杂质的限量一般根据杂质的安全性、生产的可行性、 产品的稳定性等综合考虑而定。药物中杂质限量的控制方法一般分两种：一种为限量检查法（limit test ），另一种是对杂质进行含量测定。限量检查法通常不要求测定其准确含量，只需检查杂质是否超过限量。进行限量检查时，多数采用标准溶液对照法，此外，还可采用灵敏度法和比较法。标准溶液对照法系指取一定量的被检杂质标准溶液和一定量供试

31、品溶液，在相同的条件下试验，比较结果，以确定杂质含量是否超过限量。由于供试品（S）中所含杂质的最大允许量可以通过杂质标准溶液的浓度（ C）和体积（ V ）的乘积表达，所以，杂质限量（L ）的计算公式为：12杂质限量杂质标准溶液（浓度体积）100 或 LC V供试品量100 %S采用对照法须注意平行操作原则，即供试溶液和对照溶液应在完全相同的条件下反应，如加入的试剂、反应的温度、放置的时间等均应相同，这样检查结果才有可比性。灵敏度法系指在供试品溶液中加入一定量的试剂，在一定反应条件下， 不得有阳性结果出现， 从而判断供试品中所含杂质是否符合限量规定。该法不需用杂质标准品溶液对比。如乳酸（ lac

32、tic acid ）中枸橼酸、草酸、磷酸或酒石酸的检查：取本品0.5g 加水适量使成5ml ，混匀，用氨试液调至微碱性，加氯化钙试液1ml ，至水浴中加热5min，不得产生浑浊。比较法系指取供试品一定量依法检查，测定特定待检杂质的特征参数（如：吸光度等）与规定的限量比较，不得更大。如利巴韦林（ribovirin ）中吸光度的检查：取本品1.0g，加水 25ml 溶解后，在430nm 波长处测定吸光度，不得大于0.02。又如维生素 B2 中检查感光黄素，利用维生素B 2 几乎不溶于氯仿，而感光黄素溶于氯仿的性质，用无醇氯仿提取供试品中的感光黄素，在440nm 波长处测定氯仿液的吸光度，不得超过0

33、.016。实验二药物的一般杂质检查-五种无机杂质的检查一、实验目的1掌握氯化物、硫酸盐、铁盐、重金属和砷盐限量检查的基本原理和方法。2掌握杂质的限量计算方法。3了解无机杂质检查的意义。二、基本原理无机杂质可能来源于生产过程，如生产过程中使用的仪器、原料、干燥试剂、 过滤辅助器，反应试剂、催化剂、助滤剂、活性炭等，它们一般是已知的和确定的。由于许多无机杂质直接影响药品的安全性和稳定性，并可反映生产工艺本身的情况，了解药品中无机杂质的存在状况对评价药品的生产工艺、保证药品安全、稳定具有重要意义。1氯化物检查药物中微量的氯化物在硝酸酸性溶液中与硝酸银作用，生成的氯化银胶体微粒而显白色浑浊， 与一定量

34、标准氯化钠溶液（ 10g Cl- /ml ）与硝酸银在同样条件下生成的氯化银浑浊程度相比较，判定供试品中氯化物是否符合限量规定。13ClAgNO3AgCl2硫酸盐检查药物中微量的硫酸盐在稀盐酸酸性溶液中与氯化钡反应，生成的硫酸钡微粒显白色浑浊，与一定量标准硫酸钾溶液（100g SO2- /ml ）在相同条件下产生的硫酸钡浑浊程度比较，4判定供试品硫酸盐是否符合限量规定。SO4 2BaCl 2BaSO43铁盐检查中国药典和美国药典均采用硫氰酸盐法。铁盐在盐酸酸性溶液中与硫氰酸盐作用生成红色可溶性的硫氰酸铁配离子，与一定量标准铁溶液（硫酸铁铵，FeNH 4（ SO4）2 12H2O）用同法处理后进

35、行比色。Fe3+ nSCN - Fe（）nn - 3（n=1 6）SCN在酸性条件下反应，可防止Fe3 的水解。加入氧化剂过硫酸铵既可氧化供试品中Fe2 成3Fe，同时可防止由于光线使硫氰酸铁还原或分解褪色。某些药物（如葡萄糖、糊精、硫酸镁等）在检查过程中需加硝酸处理，硝酸也可将Fe2+氧化成 Fe3+，因此这些药物的铁盐检查可在硝酸酸性溶液中进行。因硝酸中可能含亚硝酸，它能与硫氰酸根离子作用，生成红色亚硝酰硫氰化物，影响比色， 所以剩余的硝酸必须加热煮沸除去。HNO 2SCNHNO SCNH 2O4重金属检查重金属系指在实验条件下能与硫代乙酰胺或硫代钠作用而显色的金属杂质，如银、铅、汞、铜、

36、镉、铋、锑、锡、砷、锌、钴、镍等。因为在药品生产中遇到铅的机会较多，且铅易积蓄中毒，故作为重金属的代表，以铅的限量表示重金属限度。中国药典（2005）收载了四种重金属检查方法。其中，硫代乙酰胺法的原理如下：硫代乙酰胺在弱酸性条件下（pH 3.0 3.5）水解，产生硫化氢，与重金属离子生成黄色到棕黑色的硫化物混悬液，与一定量标准硝酸铅溶液经同法处理后所呈颜色比较，判定供试品中重金属是否符合限量规定。CH 3CSNH2H 2OCH3CONH 2H 2 SPb2H 2 SPbS5砷盐检查14中国药典（ 2005）收载的古蔡氏（Gutzeit）法检查砷盐的原理是：金属锌与酸作用产生新生态的氢， 与药物

37、中微量砷盐反应生成具挥发性的砷化氢，遇溴化汞试纸， 产生黄色至棕色的砷斑，与一定量标准砷溶液所生成的砷斑比较，判断供试品中重金属是否符合限量规定。As33Zn3H3Zn 2AsH 3AsO 333Zn9H3Zn23H 2OAsH 3AsH 33HgBr 23HBr（黄色）As( HgBr )32 As(HgBr )3AsH 33AsH ( HgBr ) 2 (棕色 )As( HgBr ) 3AsH 33HBrAs2 Hg 3 (黑色 )五价砷在酸性溶液中也能被金属锌还原为砷化氢，但生成砷化氢的速度较三价砷慢，故在反应液中加入碘化钾及氯化亚锡将五价砷还原为三价砷，碘化钾被氧化生成的碘又可被氯化亚

38、锡还原为碘离子，后者与反应中产生的锌离子能形成稳定的配位离子，有利于生成砷化氢的反应不断进行。AsO432I2HAsO33I 2H 2 OAsO43Sn22HAsO33Sn4H 2 OI 2Sn22ISn44IZn 2 ZnI 4 2氯化亚锡与碘化钾还可抑制锑化氢的生成，因锑化氢也能与溴化汞试纸作用生成锑斑。在试验条件下，100g锑存在也不致干扰测定。氯化亚锡又可与锌作用，在锌粒表面形成锌锡齐，起去极化作用，从而使氢气均匀而连续地发生。锌粒及供试品中可能含有少量硫化物，在酸性液中能产生硫化氢气体，与溴化汞作用生成硫化汞的色斑，干扰试验结果，故用醋酸铅棉花吸收硫化氢。用醋酸铅棉花60mg，装管高

39、度约 60mm 80mm，以控制醋酸铅棉花填充的松紧度，使既能免除硫化氢的干扰（ 100gS2- 存在也不干扰测定），又可使砷化氢以适宜的速度通过。三、实验方法葡萄糖中五种无机杂质的检查。1氯化物取本品 0.30g，加水溶解使成12.5ml （溶液如显碱性，可滴加硝酸使成中性），再加稀硝酸 5ml ；溶液如不澄清，应滤过；置 25ml 纳氏比色管中，加水使成约 20ml，摇匀，即得供试溶液。 另取标准氯化钠溶液 （ 10g CI -/ml ）3.0ml ，置 25ml 纳氏比色管中， 加稀硝酸 5ml ，加水使成约 20ml ，摇匀，即得对照溶液。于供试溶液与对照溶液中，分别加入硝酸银试液0.

40、5ml ，用水稀释使成25ml ，摇匀，在暗处放置5 分钟，同置黑色背景上，从比色管上方向15下观察、比较、供试溶液不得比对照溶液更浓（0.010%）。2硫酸盐取本品 1.0g，加水溶解使成约20ml（溶液如显碱性，可滴加盐酸使成为中性）；溶液如不澄清，应滤过；置25ml 纳氏比色管中，加稀盐酸1ml ，摇匀，即得供试溶液。另取标准硫酸钾溶液（ 100g SO42-/ml ） 1.0ml，置 25ml 纳氏比色管中，加水使成约20ml，加稀盐酸 1ml ，摇匀，即得对照溶液，于供试溶液与对照溶液中，分别加入25%氯化钡溶液 2.5ml ，用水稀释使成 25ml ，充分摇匀，放置10 分钟，同置

41、黑色背景上，从比色管上方向下观察、比较、供试溶液不得比对照溶液更浓（0.010%）。3铁盐取本品 1.0g，加水 10ml 溶解后，加稀硝酸2 滴，缓缓煮沸5 分钟，放冷，加水稀释使成 23ml ，加硫氰酸铵溶液（30100 ） 2ml ，摇匀，如显色、与标准铁溶液（10g Fe3+/ml ）1.0ml 经相同方法制成的对照溶液比较，不得更深（0.001% ）。4重金属取 25ml 纳氏比色管两支，甲管中加一定量的标准铅溶液（ 10g Pb2+/ml ）与醋酸盐缓冲液（ pH3.5） 1ml 后，加水稀释成12.5ml 。取本品2.0g，置于乙管中，加水11.5ml 溶解后，加醋酸盐缓冲液（P

42、h3.5）1ml ；若供试液带颜色，可在甲管中滴加少量的稀焦糖溶液或其它无干扰的有色溶液，使之与乙管一致；再在甲、 乙两管中分别加新鲜配制的硫代乙酰胺试液各 1ml ，摇匀，放置 2 分钟，同置白纸上，自上向下透视，乙管中显出的颜色与甲管比较，不得更深（含重金属不得过百万分之五）。5砷盐取本品 2.0g 置试砷瓶中， 加水 5ml 溶解后， 加稀硫酸 5ml 与溴化钾溴试液0.5ml，置水浴上加热约20 分钟，使保持稍过量的溴存在，必要时，再补加溴化钾溴试液适量，并随时补充蒸散的水分，放冷， 加浓盐酸 5ml（可改为加稀盐酸（ 1：1）10ml ）与水适量使成28ml ，加碘化钾试液5ml 与

43、酸性氯化亚锡试液5 滴。在室温放置10 分钟后，加锌粒2g（锌粒和锌粉各1g），迅速用试砷管塞紧瓶塞（试砷管上已置装有醋酸铅棉花及溴化汞试纸），并在25 40的水浴中反应45 分钟，取出溴化汞试纸，将生成的砷斑与一定量标准砷溶液制成的标准砷斑进行比较，颜色不得更深，应符合规定（0.0001% ）。标准砷斑的制备：精密量取标准砷溶液（1g/ml ） 2ml ，置试砷瓶中，加浓盐酸5ml 与蒸馏水 21ml（可改为：加稀盐酸（1：1）10ml 和蒸馏水16ml），再加碘化钾试液5ml 与酸性氯化亚锡试液5 滴，在室温放置10 分钟后，加锌粒2g（锌粒和锌粉各1g），迅速用试砷16管塞紧瓶塞（试砷管

44、上已置装有醋酸铅棉花及溴化汞试纸），并在25 40的水浴中反应45 分钟，取出溴化汞试纸，观察标准砷斑。四、实验指导1纳氏比色管的选择与洗涤：比色或比浊操作，一般均在纳氏比色管中进行，因此在选用比色管时， 必须注意使样品管与标准管的体积相等，玻璃色质一致， 最好不带任何颜色，管上的刻度均匀，如有差别，不得相差2mm。比色管洗涤时避免用毛刷或去污粉等洗刷，以免管壁划出条痕影响比色或比浊。2平行原则：比色、比浊、砷盐检查时，样品液与标准液的实验条件应尽可能一致，平行操作。3严格按操作步骤进行实验，注意各种试剂的加入次序。如氯化物检查时，加适量蒸馏水使成约20ml 后，再加AgNO 3 试液。4比色

45、、比浊前应使比色管内试剂充分混匀，主要利用手腕转动360 的旋摇操作来完成；比色方法是将两管同置于白色背景上，从侧面观察； 比浊方法是将两管同置于黑色或白色背景上，自上而下观察。5重金属检查中，应注意：（ 1）根据杂质限量计算公式，计算出标准铅溶液的取用量。（ 2）样品管中 “加水 11.5ml 溶解后， 加醋酸盐缓冲液 （ pH3.5 ）1ml”，实验时应采用 “加水适量溶解后，加醋酸盐缓冲液 ”（ pH 3.5 ）1ml ，再加水使成 12.5ml ，更便于操作。加醋酸盐缓冲液前， 注意比较样品管与标准管的溶液颜色， 若样品管带色， 应在标准管中滴加少量稀焦糖溶液，使两管的颜色一致，然后依

46、法操作。如在标准管 （甲管） 中滴加稀焦糖溶液仍不能使颜色一致时，可取该药品项下规定的二倍量的供试品和试液，加水使成15ml，将溶液分成甲乙二等分，乙管中加水稀释成12.5ml ；甲管中加入硫代乙酰胺试液1ml ，摇匀，放置2 分钟，经滤膜（孔径3m）滤过，然后甲管中加入一定量的标准铅溶液，加水使成12.5ml ，再分别在乙管加硫代乙酰胺试液1ml，甲管中加水 1ml ，依法比较，即得。（ 3）标准铅溶液应在临用前精密量取标准铅贮备液新鲜配制，以防止铅的水解而造成误差。6砷盐检查中，应注意：（ 1）所用的标准管与样品管应力求一致，试砷管的长短、内径一定要相同，以免生成的色斑大小不同，影响比色。17（ 2）预先安装好试砷管。醋酸铅棉花用于吸收硫化氢（锌粒及供试品中可能含有少量硫化物，在酸性溶液中即产生硫化氢），从而免除了与溴化汞作用生成硫化汞色斑的干扰。（ 3）锌粒的大小以通过 20 目筛为宜，过细则作用太快，过粗则作用太慢，为此可采用锌粒与锌粉各一半加入的方式。（ 4）加锌粒后，应立即将试砷管盖上，塞紧，以免AsH 3 气体逸出。五、思考题1比色、比浊操作应遵循的原则是什么?2试计算葡萄糖重金属检查中标准铅溶液的取用量。3古蔡氏试砷法中所加各试剂的作用是什么?4根据样品取用量、杂质限量及标准砷溶液的浓度，计算标准砷溶液的取用量。