高级生物化学实验指导

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1、高级生物化学实验指导四川农业大学生化研究室 二零一二年十月目录实验一 猪血中超氧化物歧化酶(sod)的分离纯化及活力测定、 同工酶电泳.1实验二 蛋白质分子量测定-凝胶层析法8实验三 纳米磁珠法小规模提取质粒DNA及纯化鉴定18实验四 DNA的琼脂糖凝胶电泳21实验一 猪血中超氧化物歧化酶(sod)的分离纯化及活力测定、 同工酶电泳 一、原理 超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）是一种能专一地清除超氧离子自由基（O2-）的金属酶,他具有抗衰老.抗辐射、抗炎和抗癌等作用，因而在医药化妆品、食品工业等方面具有了广泛地应用前景。 SOD是一种酸性蛋白，对热、PH和蛋白酶

2、的水解较一般酶稳定。按照它所含金属离子的不同，可分为Cu-Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD等三种。Cu-Zn-SOD为二聚体，呈蓝绿色；Mn-SOD呈紫红色；Fe-SOD呈褐色。SOD催化下述反应：2H+2O2-H2O2+O2。机构内0-的过量和不足均对集体不利，SOD对过量的02-的及时清理保证了集体内02-的含量相对平衡。集体内的O2-的形成可病理性和生理性两方面。在一些正常的生理过程中形成一些02-。例如：呼吸链中电子传递结果可以产生一些O2-。在某些疾病的过程产生大量02-如不及时清理，会对细胞损伤。SOD将02-，歧化为H202，而过氧化酶、股胖肝泰过氧化酶可以催化过氧化氢分

3、解，在集体内形成一套解毒系统，对集体起防护作用。本实验采用邮寄溶剂沉淀方法以新鲜猪血为原料，从中提取SOD并惊醒纯化。酶活力测定可用以下方法；邻苯三分自氧化法、黄嘌呤氧化酶法、NBT光还原法、化学发光法、肾上腺自氧化法、亚硝酸法等。该实验sod酶活性采用邻苯三分自氧化法测定，酶活性单位定义为：每毫升反应中，每分钟抑制邻苯三分氧化速率达50%的酶含量定义为一个酶的单位。样品中的蛋白质含量用考马斯亮蓝G-250法测定。考马斯蓝G-250Coomassic brilliant blue G-250）在在游离状态下呈紫色，与蛋白质结合呈现蓝色。在一定范围内，溶液在595nm波长下的光密度与蛋白质含量成

4、正比，可用比色法测定，测定范围1-1000ug。SOD同工酶鉴定采用不连续聚丙烯酰酰胺凝胶电泳技术分离鉴定。用“负”显色法，核黄素经光照所产生的活性氧O2-（氧自由基）能使氯化硝基四氮嗟蓝（NBT）由黄色的氧化型转化为蓝色的还原型。由于SOD能够抑制O2-的作用，因此，电泳分离SOD后，凝胶上无SOD处应显示为蓝色，而有SOD处则无色透明，由此可鉴定SOD同工酶的酶谱（即同工酶的数量、分布及活性大小）。二、 实验试剂与器材试剂1. SOD的提取ABC抗凝剂：柠檬酸10g，柠檬酸钠30g，葡萄糖25g，用适量蒸馏水溶解并稀释至1000ml.0.9%NaCl0.9g，溶于100ml蒸馏水中。丙酮9

5、5%乙醇氯仿2. SOD活力测定50mmol/L pH8.3磷酸缓冲液10mmol/L EDTA钠盐溶液3mmol/L 领苯三酚溶液（用10mmol/L盐酸配制）3. 考马斯亮蓝G-250法测蛋白质考马斯亮蓝G-250试剂：称取100mg考马斯亮蓝G250，溶于50ml95%乙醇中，加入100ml85%（W/V）的磷酸，蒸馏水定容至1000ml。此试剂常温下可保存30天。标准蛋白质溶液：精确称取结晶牛血清白蛋白25mg，加蒸馏水溶解并定容至100ml。吸取上述溶液40ml，用蒸馏水稀释至100ml，即为100ug/ml的标准蛋白质溶液。4. SOD同工酶鉴定40%蔗糖w/v：称取40g蔗糖加重

6、蒸水100ml。10%过硫酸铵Ap：称过硫酸铵10g，溶于100ml重蒸水中。用时现配。电极缓冲液：称取三时配羟甲基氨基甲烷6g，甘氨酸28.8g。用蒸馏水溶解并定容至1000ml，过滤后装入棕色瓶，4保存。30%的AcrBis溶液：称Acr30g，Bis0.8g，加重蒸馏水溶解，定容至100ml，过滤后装入棕色瓶，4保存。Tris-HCL，ph6.7缓冲溶液：Tris6.0g，加入1mol/L HCL 48ml，TEMED0.4ml,用浓盐酸调PH8.9后，再用蒸馏水定容至100ml。Tris-HCI，PH6.7缓冲溶液：Tris6.0g,加1mol/L HCL 48ml,TEMED0.4m

7、l,用浓盐酸调至PH6.7后，再用蒸馏水定容至100mlNBT溶液：核黄素吗（0.01%），氯化硝基四氮嗟蓝（NBT）（25mol/L），磷酸缓冲液（0.05mol/L）、PH7.8），EDTA-Na2（1.0mol/L）。2.810（3）mol/L的EDTA-Na2（用PH7.8/,3.610（3）moL/L磷酸缓冲液配制）器材752分光光度计；分析天平；具塞试管；刻度吸管；（1ml，5ml）；离心机；烧杯（50ml）电泳装置一套；微量进样器；注射器。 三、操作步骤1. SOD的提取 1取新鲜猪血20ml（预先0.15:1（v/v）的比例加入ACD抗凝剂），4000r/m，10min，去上层

8、血浆，取下层红血球粘稠液，并量其体积，然后加入2倍体积的0.9%NaCl溶液清洗，4000r/m，10min，弃上层清液，再加入2倍体积的0.9%Nacl溶液重复清洗一次，4000r/m，10min,得洗净的红血球浓稠液。2向洗净的红血球中加入等体积的蒸馏水，剧烈搅拌30min，使其充分溶血。再向溶血液中缓慢加入预冷的0.25倍体积的95%乙醇溶液和0.15倍体积的氯仿，匀浆呈暗红色，再继续搅拌15min，4000r/m，10min，去变性蛋白沉淀物，得上层液，留样2ml。将上层液用多层纱布进行粗滤，以除去上层液中的漂浮物，然后将清夜在65-70恒温水浴中进行热处理，15min后取出迅速冷却至

9、室温，4000r/m，15min除沉淀，得浅黄色粗酶液，留样2ml。3向粗酶液中加入等体积的丙酮溶液，冰箱中静置过液，4000r/m，10min弃上清液，得沉淀。将沉淀物用等体积预冷的丙酮溶液洗二次，离心收集沉淀，自然干燥即得淡绿色成品，按1mg/ml溶于蒸馏水，备用。2.SOD活力测定 1邻苯三酚自氧化率的测定 取405ml50mol/L pH8.3的磷酸缓冲液，4.2ml蒸馏水和1ml10mol/LEDTA-Na2溶液，混匀后在25水浴保温20min，取出后立即加入25预热过的邻苯三酚溶液0.3ml，迅速摇匀，倒入光径1cm的比色杯内，用10mol/L HCI作空白，325nm波长下每隔3

10、0秒测光密度值一次，整个操作在4min内完成，计算出每分钟A325的增值，此即为邻苯三酚自氧化率。要求自氧化氯控制在0.070/min左右。 2酶活力测定 操作与1一致，加入邻苯三酚前，先加入0.1ml的SOD样液，蒸馏水则减少相应的体积，同理测其光密度值，计算加酸后邻苯三酚自氧化氯。 3酶活性单位的计算 根据酶活性单位的定义，按下列公式计算酶活性： (A0-Am)/A0*100% 样液稀释倍数单位活性（U/ml）=-*反应液总体积数*- 50% 样液体积 其中，A0为邻苯三酚自氧化氯；Am为加酶后邻苯三酚自氧化氯。 总结性（U）=单位活性*酶原液总体积 4蛋白质含量测定（考马斯亮蓝G-250

11、法） 标准曲线的整理：取6支具塞试管，编号，按下表加入试剂： 管 号 试 剂 1 2 3 4 5 6 蛋白质标准液（ml） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0蒸馏水（ml） 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0考马斯亮蓝G-250(ml) 5 5 5 5 5 5蛋白质含量（ug） 0 20 40 60 80 100 塞上盖子，摇匀。注意各管振荡程度尽量一致。在595nm波长下比色测定光密度值，比色应在1h内完成。以牛血清蛋白质含量（ug）为横坐标，光密度值为纵坐标，绘出标注曲线。 样品中蛋白质含量的测定 将待测的SOD溶解并解释到一定浓度，取1支具塞试管，准确加入0.1ml样品提

12、取液，加入0.9ml蒸馏水和5ml考马斯亮蓝G-250试剂，其余操作与标准曲线整理相同。 蛋白质含量计算 根据所测样品提取液的光密度，在标准曲线上查到相应的蛋白质含量，计算其浓度。 5结果处理 利用考马斯亮蓝G-250法测定每毫升酶原液蛋白质毫克数。 单位活力（U/ml） 总活力 比活力（U/mg）=- = - 单位蛋白质浓度（mg/ml） 总蛋白质（mg） 将测定的数据或计算结果填入下表：提纯步骤 酶液总体积 蛋白质 酶活性 总活性 比活性 回收率 纯化倍数 ml mg/ml U/ml U U/mg % 除血蛋白血清热变性后上清丙酮沉淀后的3.SOD同工酶鉴定（PAGE） 1样品制备 取一定

13、浓度（约SOD0.5mg/ml）酶液，按酶液：40%蔗糖=1：1（V: V）的比例配成样品液，备用。 2上样及电泳 组成电泳槽：将四只固定螺杆插入一只贮槽的相应空洞中，然后将贮槽框放在桌上。左手拿凹形带槽橡胶模框，右手的拇指与中指握住短玻璃板的两侧边缘插到橡胶模框的短槽内，然后以同样方式将长玻璃极插到相应的长槽内，将带有长、短玻璃板的橡胶模框平放在仰放的贮槽框架上，其下缘必须对齐贮槽框下缘。双手拿另一只贮槽框仰放在桌上的贮框相会，并使橡胶模框上的凸出线位于贮槽的有机玻璃框的中央。装上四只螺母。拧紧螺丝。最好用双手按斜角位置双双逐渐拧紧。将电泳槽垂直置起，放在桌上，带短玻璃板的贮槽称上槽，带长玻

14、璃板的贮槽称下槽，在长玻璃板与胶模框间有一缝隙。此缝隙可用已溶化的1%琼脂沿长玻璃板下端灌入，以防止产生气泡。待琼脂完全凝固后才能灌胶。1凝胶的制备 取两只洁净的小烧杯标号，按下述试剂配方：试剂 烧杯编号 分离胶 浓缩胶 30%Acr-Bis 4.0ml 0.8mlTris-HCL Ph8.9缓冲液 3.0ml -Tris-HCL Ph6.7缓冲液 - 1.0mlH2O 9.0ml 3.0ml10%AP 0.3ml 0.15m组装好的电泳槽，先制分离胶，再在其上制浓缩胶，灌浓缩胶时将梳子插入，待胶凝后就可形成凹形加样槽。2加样及电泳先将电泳槽注满电极缓冲液，分别在各样品管中加入20-30ml样

15、品液。电流调至200V电泳，待样品全部进胶后，调电压至250V,电泳至示踪染料下行距胶底1cm处停止电泳，取出玻璃板（含凝胶）。3取出胶板显带用扁平药匙轻轻揭去一块玻璃板，另一板上的凝胶胶面朝下，再启胶一角注水，使胶缓缓落入培养皿中。将电泳后的凝胶在严格避光的NBT溶液内浸泡20min，再放在2.8mol/L的EDTA-Na2溶液中，40w日光灯下直射，至蓝色背景下出现多条透明酶带为止，观察结果，拍照绘制模式图。4干胶制备在浸泡的两张玻璃纸u（比胶大）中夹入凝胶，平置子一块玻璃板上，赶除期间的气泡，将玻璃纸四周边缘折向玻璃板底，用另一块同样大小的玻璃板压住，再用铁夹将两块板夹紧，室温下放置至干

16、，修剪后保存。倍体积的0.9%Nacl溶液重复清洗一次，4000r/m，10min,得洗净的红血球浓稠液。2向洗净的红血球中加入等体积的蒸馏水，剧烈搅拌30min，使其充分溶血。再向溶血液中缓慢加入预冷的0.25倍体积的95%乙醇溶液和0.15倍体积的氯仿，匀浆呈暗红色，再继续搅拌15min，4000r/m，10min，去变性蛋白沉淀物，得上层液，留样2ml。将上层液用多层纱布进行粗滤，以除去上层液中的漂浮物，然后将清夜在65-70恒温水浴中进行热处理，15min后取出迅速冷却至室温，4000r/m，15min除沉淀，得浅黄色粗酶液，留样2ml。3向粗酶液中加入等体积的丙酮溶液，冰箱中静置过液

17、，4000r/m，10min弃上清液，得沉淀。将沉淀物用等体积预冷的丙酮溶液洗二次，离心收集沉淀，自然干燥即得淡绿色成品，按1mg/ml溶于蒸馏水，备用。2.SOD活力测定 1邻苯三酚自氧化率的测定 取405ml50mol/L pH8.3的磷酸缓冲液，4.2ml蒸馏水和1ml10mol/LEDTA-Na2溶液，混匀后在25水浴保温20min，取出后立即加入25预热过的邻苯三酚溶液0.3ml，迅速摇匀，倒入光径1cm的比色杯内，用10mol/L HCI作空白，325nm波长下每隔30秒测光密度值一次，整个操作在4min内完成，计算出每分钟A325的增值，此即为邻苯三酚自氧化率。要求自氧化氯控制在

18、0.070/min左右。 2酶活力测定 操作与1一致，加入邻苯三酚前，先加入0.1ml的SOD样液，蒸馏水则减少相应的体积，同理测其光密度值，计算加酸后邻苯三酚自氧化氯。 3酶活性单位的计算 根据酶活性单位的定义，按下列公式计算酶活性： (A0-Am)/A0*100% 样液稀释倍数单位活性（U/ml）=-*反应液总体积数*- 50% 样液体积 其中，A0为邻苯三酚自氧化氯；Am为加酶后邻苯三酚自氧化氯。 总结性（U）=单位活性*酶原液总体积 4蛋白质含量测定（考马斯亮蓝G-250法） 标准曲线的整理：取6支具塞试管，编号，按下表加入试剂： 管 号 试 剂 1 2 3 4 5 6 蛋白质标准液（

19、ml） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0蒸馏水（ml） 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0考马斯亮蓝G-250(ml) 5 5 5 5 5 5蛋白质含量（ug） 0 20 40 60 80 100 塞上盖子，摇匀。注意各管振荡程度尽量一致。在595nm波长下比色测定光密度值，比色应在1h内完成。以牛血清蛋白质含量（ug）为横坐标，光密度值为纵坐标，绘出标注曲线。 样品中蛋白质含量的测定 将待测的SOD溶解并解释到一定浓度，取1支具塞试管，准确加入0.1ml样品提取液，加入0.9ml蒸馏水和5ml考马斯亮蓝G-250试剂，其余操作与标准曲线整理相同。 蛋白质含量计算 根据所测样

20、品提取液的光密度，在标准曲线上查到相应的蛋白质含量，计算其浓度。 5结果处理 利用考马斯亮蓝G-250法测定每毫升酶原液蛋白质毫克数。 单位活力（U/ml） 总活力 比活力（U/mg）=- = - 单位蛋白质浓度（mg/ml） 总蛋白质（mg） 将测定的数据或计算结果填入下表：提纯步骤 酶液总体积 蛋白质 酶活性 总活性 比活性 回收率 纯化倍数 ml mg/ml U/ml U U/mg % 除血蛋白血清热变性后上清丙酮沉淀后的3.SOD同工酶鉴定（PAGE） 1样品制备 取一定浓度（约SOD0.5mg/ml）酶液，按酶液：40%蔗糖=1：1（V: V）的比例配成样品液，备用。 2上样及电泳

21、组成电泳槽：将四只固定螺杆插入一只贮槽的相应空洞中，然后将贮槽框放在桌上。左手拿凹形带槽橡胶模框，右手的拇指与中指握住短玻璃板的两侧边缘插到橡胶模框的短槽内，然后以同样方式将长玻璃极插到相应的长槽内，将带有长、短玻璃板的橡胶模框平放在仰放的贮槽框架上，其下缘必须对齐贮槽框下缘。双手拿另一只贮槽框仰放在桌上的贮框相会，并使橡胶模框上的凸出线位于贮槽的有机玻璃框的中央。装上四只螺母。拧紧螺丝。最好用双手按斜角位置双双逐渐拧紧。将电泳槽垂直置起，放在桌上，带短玻璃板的贮槽称上槽，带长玻璃板的贮槽称下槽，在长玻璃板与胶模框间有一缝隙。此缝隙可用已溶化的1%琼脂沿长玻璃板下端灌入，以防止产生气泡。待琼脂

22、完全凝固后才能灌胶。1凝胶的制备 取两只洁净的小烧杯标号，按下述试剂配方：试剂 烧杯编号 分离胶 浓缩胶 30%Acr-Bis 4.0ml 0.8mlTris-HCL Ph8.9缓冲液 3.0ml -Tris-HCL Ph6.7缓冲液 - 1.0mlH2O 9.0ml 3.0ml10%AP 0.3ml 0.15m组装好的电泳槽，先制分离胶，再在其上制浓缩胶，灌浓缩胶时将梳子插入，待胶凝后就可形成凹形加样槽。2加样及电泳先将电泳槽注满电极缓冲液，分别在各样品管中加入20-30ml样品液。电流调至200V电泳，待样品全部进胶后，调电压至250V,电泳至示踪染料下行距胶底1cm处停止电泳，取出玻璃板

23、（含凝胶）。3取出胶板显带用扁平药匙轻轻揭去一块玻璃板，另一板上的凝胶胶面朝下，再启胶一角注水，使胶缓缓落入培养皿中。将电泳后的凝胶在严格避光的NBT溶液内浸泡20min，再放在2.8mol/L的EDTA-Na2溶液中，40w日光灯下直射，至蓝色背景下出现多条透明酶带为止，观察结果，拍照绘制模式图。4干胶制备在浸泡的两张玻璃纸u（比胶大）中夹入凝胶，平置子一块玻璃板上，赶除期间的气泡，将玻璃纸四周边缘折向玻璃板底，用另一块同样大小的玻璃板压住，再用铁夹将两块板夹紧，室温下放置至干，修剪后保存。实验二 蛋白质分子量的测定凝胶层析法一、原理 凝胶层析法是利用凝胶把分子大小不同的物质分离开的一种方法

24、，又叫分子筛层析法，排阻层析法。凝胶本身是一种分子筛，它可以把分子按大小不同的进行分离，如同过筛可以把大颗粒与小颗粒分开来一样。但是这种“过筛”与普通过筛不一样。将凝胶颗粒在适宜溶剂中浸，使充分洗液膨胀，然后装入层析柱中，加入欲分离的混合物后，再以同一溶剂洗脱，在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部而言凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外，而小分子可以进入凝胶内部，流速缓慢，以致最后流出柱外，而使样品分子不同的分子得到分离。凝胶室友叫退溶液凝结而成的固体物质，不论是天然还是人工合成凝胶，他们的内部都具有很多和微细的多孔网状机构，凝胶层析法常用天然凝胶是琼脂凝胶，人工合成的凝胶是聚丙烯酰胺凝胶，和葡萄糖凝

25、胶，具有不同孔隙度的立体网状结构的凝胶，不溶于水。这种聚合物的立体网状结构，起孔隙代销与被分离物质分子的大小有相似的数量级，在凝胶充分溶胀后，交联度高的，孔隙小，只能有相应的小分子可以通过，适用于分离小物质。相反，交联度低的孔隙大，适用于分离大分子的物质。利用这种性质可分离不同分子量的物质。一下进一步来说明凝胶层析的原理。将凝胶装在柱子里，柱床体积称为总体积，以Vt表示。实质上Vt是由Vo、Vi与Vg三部分组成，既Vt=Vi+Vg+Vo。Vo称为孔隙体积或者外体积，又称为外水体积，即存在于柱床内凝胶克里外面孔隙之间的水相体积，相应于一般层析法中柱内部流动相的体积；Vi为内部体积，济宁叫颗粒内部

26、所含水相的体积，因此Vt-Vo=Vi+Vg脱洗体积与Vo及Vi之间的关系可用下式表示Ve=Vo+KdVi式子中的Ve为脱水体积，自加入样品时算起，到祖坟最大浓度出现时候流出的体积，Kd为样品组分在二相间的分配系数。它只与被分离物质分子的大小和凝胶颗粒孔隙的大小分布有关，与柱的长短粗细无关，也就是说他对每一个物质为常数。与柱的物理条件无关。Kd可以通过实验室求得。上式子可改写成：Kd=（Ve-Vo)/Vi Vo表示外体积；Vi内体积；VeII、VeIII分别代表组分II和III的洗脱体积。Kd可以有下列几种情况：1、当Kd=0时，则Ve=Vo。即对于根本不能进入凝胶内部的大分子物质（全排阻），洗

27、脱体积等于空隙体积（图4-1组分I）2、当Kd=1时，Ve=Vo+Vi。即小分子可完全渗入凝胶内部时，洗脱体积应为空隙体积与内体积之和（图4-1组分III）。可以看出，对某一凝胶介质，两种全排出的分子即Kd都等于零，虽然分子大小有差别，但不能有分离效果。同样两种分子如都能进入内部空隙，即Kd都等于1，它们即使分子大小有不同，也没有分离效果。因此不同型号的凝胶介质，有它一定的使用范围。3、当0Kd1时，表示凝胶对组分有吸附作用，此时VeVo+Vi。例如一些芳香族化合物的洗脱体积远超出理论计算的最大值，这些化合物的Kd1。如苯丙氨酸，络氨酸和色氨酸在Sephadx G-25中德Kd值分别为1.2，

28、1.4和2.2。在实际工作中，对小分子物质也得不到Kd=1的数值，特别是交联度大的凝胶差别更大，如用G-10型得Kd值0.75左右，用G-25型得0.8左右。这是由于一部分水相与凝胶结合较牢固，成为凝胶本身的一部分，因而不起作用，小分子不能扩散入内所致。此时Vi即不能以gWR计算，为此也常有直接用小分子物质D2O，NaCl等通过凝胶柱而由实验计算出Vi值的。另一个解决的办法是不使用Vi与Kd，而用Kav（有效分配系数）代替Kd，其定义如下：已知 Kd= Ve-VoVi， Vt-Vo代替Vi，则：Kav=Ve-VoVt-Vo即 Va=Vo+Kav(Vt-Vo)在这里实际上将原来以水作为固定相（V

29、i）改为水与凝胶颗粒Vt-Vo作为固定相，而洗脱剂（Ve-Vo）作为流动相。Kav与Kd对交联度小的凝胶差别较小，而对交联度大的凝胶差别大。在一般情况下，凝胶对组分没有吸附作用时，当流动相流动Vt体积后，所有的组分都应该被洗出来，只一点为凝胶层析法的特点，与一般层析方法不同。Ve与分子量的关系：对同一类型的化合物，洗脱特性与组分的分子量有关，流过凝胶柱是，按分子量大小顺序流出，分子量大的走在前面。Ve与分子量的关系可用下式表示： Ve=K1-K2logMK1与K2为常数，M为分子数，Ve也可用Ve-Vo（分离体积）,Ve/Vo相对保留体积，Ve/Vt（简化的洗脱体积,它受柱的填充情况的影响较小

30、）或Kav代替，与分子量的关系同上式，只是常数不同。通常多以Kav对分子量的对数作图得一曲线，称为“选择曲线”如图4-2所示。曲线的斜率是说明凝胶性质的一个很重要的特征。在允许的工作范围内，曲线越陡，则分级愈好，而工作范围愈窄。凝胶层析主要决定与溶质分子的大小，每一类型的化合物如球蛋白类，右旋糖酐类等都有它自己的特殊的选择曲线，可用以测定未知物的的分子量，测定时以便用曲线的直线部分为宜。用凝胶层析法测定蛋白质的分子量，方法简单，技术易掌握，样品用量少，而且有时不需要纯物质，用一粗制品即可。例如在一粗酶制剂中，为了测定某一酶组分的分子量，只要测定脱洗液中具有该酶最大活性的部分，然后确定其洗脱体积

31、，即可从标准曲线中查出其分子量。凝胶层析法测定分子量也有一定的局限性，在pH6-8的范围内，线性关系比较好，但在极端pH时，一般蛋白质有可能因变性而偏离。糖蛋白在含糖量超过5%时，测得分子量比真实的要小。有一些酶底物是糖，如淀粉酶，溶菌酶等会与葡聚糖胶形成络合物，这种络合物与酶底物络合物相似，因此在葡聚糖凝胶上层析时表现异常，用凝胶层析法所测分子量的结果，要和其他方法的测定相对照，由此才可作出可靠的结论。图4-2 球蛋白分子量“选择曲线”凝胶层析技术操作方便，设备简单，周期短，重复性能好，而且条件温和，一般不引起生物活性物质的变化，目前以得到相当广泛的应用，例如可用于脱盐，浓缩高分子物质的分子

32、量。下面实验是利用葡聚糖凝胶层析法测定蛋白质的分子量。二、试剂和器材【试剂】1、 1、标准蛋白质：蓝色葡聚糖-2000（200KD），牛血清血蛋白（67KD），胃蛋白酶（36KD），CytC(13.7KD)等，均为分析纯。2、 2、洗脱液：0.2mol/LTris-HCl-KCl，pH7.5取0.5M KCl 20ml，0.2M Tris 25ml，0.1M HCl 40.3ml，再加H2O定容至100ml3、 3、Sephadex G-75（或G-100）。【器材】1、 1、层析柱：柱管1.2*50cm。2、 2、核酸蛋白检测仪（或紫外分光光度计）。3、 3、部分收集器。4、 4、刻度试管。

33、三、操作方法（一）凝胶柱的准备1、凝胶的选择和处理1凝胶的选择：凝胶型号很多。型号不同，筛分范围亦不同。市售的Sephadex的分离范围，常用高聚糖或球蛋白测定。Sephadex G型一般适宜于分离蛋白质。如果用于分离核糖时，则限于其空间结构和所带基团的影响，选用高于它们分子量范围的型号，或者选用适当型号的生物胶和Sephacryl。在去除蛋白质溶液中的盐类时，可选用凝胶Sephadex G-25.当溶液通过G-25柱时，蛋白质被排阻在凝胶外面先流出来，而盐类则扩散到凝胶网孔里后流出来，这样就使蛋白质得到纯化。一般说来，在规定的筛分范围内，混合物之间量差别越大，分离效果越好。2凝胶的处理：葡聚

34、糖凝胶是以干粉保存的，因此使用前必须将干凝胶浸泡于将要做洗脱剂的相同液体中，充分溶胀，然后才能使用。根据层析柱的体积和所选用的凝胶，膨胀后床体积，计算所需凝胶干粉的重量，将称好的干粉倾入过量的洗脱液中，一般为水、盐溶或缓冲液，放置在室温，使之充分吸水溶胀。注意不要过分搅拌，以防颗粒破碎。浸泡时间根据凝胶交联度不同而异。为了缩短溶胀时间，可以在沸水浴上加热至将近100，这样可大大缩短溶胀时间至几小时，而且还可杀死细菌和霉菌和排除凝胶内部包藏着的气泡。但是，必须避免置于酸或碱溶液中加热。 凝胶颗粒最好大小比较均匀，这样流速稳定，结果较好。如果颗粒大小不匀，可以在浸泡时用倾泻法将不易沉下的较细的颗粒

35、倾去。装柱前最好将处理好的凝胶置真空干燥器中抽真空，以除尽凝胶中的空气。2、凝胶柱的制备1柱的选择：层析柱是所有层析方法的主要组成部分。因此，对层析柱（包括体积和长度等）选择的合理与否，将直接影响分离效果。当用同样直径的层析柱分离两种以上的物质时，长层析柱比短的分辨率高；当用同样长度的层析柱分离两种以上的物质时，层析柱直径大的比小的分辨率高；当用同样体积的层析柱分离两种以上物质时，仍时层析柱长的比短的分辨率高。一般理想的层析柱之直径和长度之比是1：25100。层析柱最好有架套，这样温度可以控制，得到的结果可以重复。2装柱：层析柱必须粗细均匀，柱管大小可根据实际需要选择。一般柱直径（半径）为1c

36、m，如果样品样比较多，最好用直径23cm柱。但若直径太小时会发生“壁管效应”，即在柱管中心部分组分移动较慢，而在管壁周围移动较快，因而影响分离效果。一般说来，柱越长，分离效果愈好，但柱过长，实验时间长，而且样品稀释度大，易扩散，分离效果反而不好。一般来说，用于脱盐时，柱高50cm比较合适；在进行分级分离时，100cm高就已足够。装柱方法与一般柱层析法相似，柱管可用一般柱层析管，柱的下端缩口，底部目前常用多孔的聚乙烯片做底板。底下用棉花或玻璃纤维填弃。如用烧结玻璃砂板做底，尽管用细孔的（3号），粗孔的则要在其上铺一层滤纸或尼龙滤布。先加适量溶剂到柱内，排走其中的空气，然后把预先用溶剂浸泡好的凝胶

37、搅匀，随即将此悬浮液连续倾入柱内，待其自然沉降至柱高的1/41/3时，打开柱下端出口，让溶剂慢慢流入，使柱上端悬浮液面缓慢下降至需要的高度。要注意颗粒间没有夹杂气泡，最好不用分次填装法或稀的凝胶悬浮液装柱。凝胶沉集后，将溶剂放出，再通过2-3倍柱床体积的溶剂使柱床稳定，然后在凝胶表面上放一片滤纸或尼龙滤布，以防在加样时凝胶被冲起来。3凝胶柱的鉴定：红色葡聚糖或细胞色素C等配成2毫克/毫升的溶液过柱，观察色带是否均匀下降。如果凝胶是均匀的，没有“纹路”、裂缝或气泡，才可以使用，否则就必须重新装柱。要注意在任何时候不要使液面低于凝胶表面，否则水分挥发，凝胶变干，分离效果变坏，并有可能混有气泡，影响

38、液体在柱内的流动。3、 加样：加样量与测定方法和层析柱大小有关。测定样品含量的方法灵敏或床柱体积小时，加样量可少。否则反之。例如，一般测定蛋白质的含量多用紫外分光光度法。当采用280nm观察消光读数时，加样量需5mg左右（柱体积2X60cm）；当采用220nm观察消光读数时，加样量只需要1.2mg左右。加样量掌握得当，可提高分离效果。一般来说，加样量越少，或加样体积越小（样品浓度高），分辨率越高。但用于样品的制备和脱盐时，加样量应在不影响分辨率的前提下增大。此外，样品的粘度也影响层析的分辨率，样品的粘度大比小分辨率低。因此，一般使用的样品粘度应小于2，或者与洗脱液的粘度相当为宜。 加样的方法与

39、一般柱层析法相同，将柱中多余的液体放出后，将样品溶液小心加到凝胶柱上，打开管夹，使样品溶液流入柱内。然后加入溶剂或盐溶液洗脱。4、 洗脱：所有洗脱液均以能溶解洗脱物质和不使其变性或失活为原则。洗脱用的液体应与浸泡膨胀凝胶所用的液体相同，否则由于更换溶剂，凝胶体积发生变化而影响分离效果。洗脱所用的液体有水（多用于分离不带电荷的中性物质）及电解质溶液（用于分离带电基团的样品），如酸、碱、盐的溶液及缓冲液等。对于吸附较强的组分，也有使用水与有机溶剂的混合液，中水-甲醇，水-乙醇，水-丙酮等，如以此作为洗脱剂，可以减低吸附，将组分分洗下。洗脱时的流速要严格控制。否则收集的每一部分洗脱体积就不会恒定，理

40、想的分配系数就难以测出。控制流速的最好装置是恒流泵，它不仅可以使流速恒定，而且还可以使其在较大范围内选择。若无此装置，可用控制操作压的办法进行。事实上，大多数实验室是采用后一种方法进行控制流速的。流速在洗脱液加在柱上的压力（因液面差造成）有关。凝胶层析与一般离子交换树脂不同，加压超过一个极限值，不仅不能增加速度，反而使流速急剧下降。流速对交联度不同的凝胶是不同的。对交联度大的凝胶（G-10至G-50型），流速与柱的压力差成正比，与柱长成反比，与柱的直径无关。对交联度小的凝胶（G-75至G-200型），流速与柱的直径有关，并在一定的适宜操作压差下有最大的流速。 流速亦受颗粒大小影响，颗粒大时流速

41、较大，但流速大时洗脱峰形状较宽，颗粒小时流速较慢，分离情况较好。在操作时应根据实际需要，在不影响分离效果的情况下，尽可能使流速不致太慢，以免时间过长。5、 柱的重新填装：由于在洗脱过程中，所有组分一般可全部自柱上洗下，所以装好一次柱管之后，可以反复使用，无须特殊的“再生”处理。但由于在使用过程中，颗粒可能渐渐沉积压紧，因此在使用一段时间后，流速可能渐渐减低，使一次分析时间拖长很久，这时需要将凝胶倒出，重新填装，或者用反冲方法，使凝胶松动冲起，再行降沉。有时流速改变是由于柱顶上有灰尘集聚，则需将表面层除去。由于葡萄糖凝胶为糖类化合物，并且一定要在液相中操作，所以有必要注意防止发霉与生长细菌。一般

42、可用0.02%的叠氮钠（NaN3）溶液，它极易溶于水，不与蛋白质和糖反应，也不改变他们的层析效果。也可用0.002%的洗必泰（hibitane）溶液。在弱酸性溶液中可用0.05%（0.01-0.02%）三氯丁醇溶液，但它在强碱性溶液或加热到60度以上时就要分解。在弱碱性溶液中也有用0.01%乙醇尔溶液防腐消毒。一般不用氯仿、丁醇、甲苯等为防腐剂，因为它们能引起凝胶颗粒的收缩，同时还能进入层析仪器的塑料部件，使塑料变软，造成不良后果。6、 凝胶的保存方法：凝胶用完后可用以下方法保存：(1)、膨胀状态：即在水相中保存，可加入上述防腐剂，或加热灭菌后于低温保存。 （2）、半收缩状态：用完后用水洗净，

43、然后再用60-70%乙醇洗，则凝胶体积缩小，于低温保存。 （3）、干燥状态：用水洗净后，加入含乙醇的水洗，并逐渐加大含醇量，最后用95%乙醇洗，则凝胶水收缩，再用乙醚洗去乙醇，抽虑至干，于60-80度干燥后保存。这三种方法中，以干燥状态保存为最好。（二）用葡萄糖凝胶层分析法测定蛋白质的分子量：凝胶层析的操作方法如上所述。测定蛋白质的分子量根据需要可选用Sephadex G-75,G-100或G-150型凝胶凝胶颗粒一般在40-120微米，柱管选用直径1.0-1.3cm，高90-100cm。1、 标准曲线的制定：层析柱用1.2X100cm，凝胶用Sephadex G-75（或G-100）。 1蛋

44、白质标准样品混合液：分别称取4mg蓝色葡萄糖-2000（分子量200，000）、牛血清蛋白（分子量67，000），胃蛋白酶（分子量36，000），Cytc（分子量：13，700）共同溶于2mlPH7.5 0.025mol/L Tris-HCl缓冲液中。 2上柱和脱洗：将标准样品混合液上柱，然后用PH7.5 0.025mol/L Tris-HCl溶液洗脱。流速45d/min,2ml/管，用部分收集器收集，紫外检测仪280nm处检测。或收集后用紫外分光光度计于280nm处测定每管OD值，以管号（或洗脱体积）为横坐标，OD值为纵坐标绘出洗脱曲线。根据洗脱峰位置量出每种蛋白质的洗脱体积（Ve）。然后以

45、蛋白质分子量的对数（1gM）为横坐标，Ve为纵坐标，作出标准曲线。为了结果可靠，应以同样条件重复1-2次，取Ve的平均值作图。2、 未知数品分子量的测定：完全按照标准曲线的条件操作，根据紫外检测的洗脱峰位置，测出洗脱体积。重复测定1-2次，取平均值，由标准曲线可查得样品的分子量。实验三 纳米磁珠法小规模提取质粒DNA及其纯度鉴定一、 原理 质粒（plasmid）是目前最常见的基因克隆的载体分子。细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1Kb至200Kb以上不等。各种质粒都是存在与细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会

46、可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂遗传到后代。碱裂解法是通常的质粒DNA的提取方法。SDS和NaOH是碱裂解法的主要试剂。SDS是一种阴离子表面活性剂，它既能裂解细菌细胞，又能使细菌蛋白质变性。所以，SDS处理细菌细胞后会导致细菌细胞壁破裂，从而使质粒DNA及细菌基因组DNA由于分子较大在短时间内难以复性，会跟变性的蛋白质及细胞破碎片形成白色的团聚物。经离心后，变性蛋白质、染色体DNA及细胞破碎片沉淀到离心管的底部，而质粒DNA将留在上清液中，通过这种方法即可得到质粒DNA的粗提液。含质粒DNA的粗提液一般来说不能直接提供酶切、转化、测序和PCR等分子生物学应用，

47、而需经进一步纯化。传统的苯酚/氯仿抽提法及当今广泛应用的试剂盒法（DNA可逆吸附到silica上）都可以除去里面大部分残存的蛋白质等杂质，得到相对纯度较高的质粒DNA。但这些方法往往使用有毒试剂，且对离心机的依赖程度较高，费时，费力且不利于节约成本。基本纳米磁性粒子的磁性分离技术与之相比具有较大的优势。通过将SiO2包覆到纳米磁球Fe3O4在的表面，得到表面富含羟基的Fe3O4/SiO2复合纳米磁珠，可作为酶固定化、核酸分离纯化等生物学应用的载体。在高盐低PH值条件下，DNA可大量结合到Fe3O4/SiO2表面，而且低盐高PH值下DNA又可被洗脱下来，利用外界磁场的控制，可直接将DNA从成分复

48、杂的混合物中提取出来。该法提取纯度高，避免了使用氯仿、苯酚等有毒试剂，从菌体收集到质粒DNA的获得仅需要两步离心，而且后期操作可在一个离心管中完成，提取过程更加方便快捷。磁性分离技术近年被广泛应用于各种生物大分子的提取，特别是核酸的高通量、自动化提取方面。为了得到纯的DNA制品，可用适量DNase处理提取液，以降解RNA。同时为了防止提取过程中DNA被细胞中释放的DNase降解，要用EDTA-2Na抑制DNase的活性，同时整个操作尽可能在较低温度下进行。提取的DNA是否纯净，是否是双链、高分子化合物，一般通过自外吸收、化学测定和Tm测定等方面的鉴定，本实验仅采用紫外吸收法。二、材料和试剂菌种

49、：含质粒的E.coli DH5。SolutionI:PH=8.0, 50mmol/L Tris-HCl, 10mmol/L EDTA ,用时补加RNase使其终浓度为1mg/ml。SolutionII:200mmol/L NaOH,1%SDS。SolutionIII:4.0mmol/L盐酸胍，0.75mol/L KAC,用冰醋酸将PH调至4.0。洗清液：70%乙醇；洗脱液（TE）：10mmol/L Tris-HCl,1mmol/L EDTA, PH=8.0的TE溶液。20mg/mlFe3O4/SiO2纳米磁珠。三、试验器材1、离心机2、八孔磁架3、紫外分光光度计4、DNA电泳装置5、10ul

50、200ul 1000ul 移液枪6、1.5ml 离心管四、 操作步骤1、 取1.5ml大肠杆菌过夜培养液于离心管中，1200r/m离心60s。弃上清，将离心管倒置，尽量去除液体。2、 向离心管中加入250ul SolutionI,用移液枪吹打，使菌体分散均匀。3、 向菌悬液中加入250ul SolutionII,盖紧管口，温和颠倒4-5次。静置2min。4、 加入350ul SolutionIII,快速温和颠倒数次，此时可见白色絮状沉淀出现，静置2min后，120000r/m离心5min。5、 将上清液转移到另一只离心管中，注意不要将白色絮状沉淀移走。6、 加入Fe3O4/SiO2磁珠50ul

51、，用移液器吹打混匀，室温静置5min。7、 将离心管置于磁性分离架上，磁分离1min，弃上清。8、 向固定于磁性分离架上的离心管缓慢加入800ul清洗液，注意不要触动磁珠。静置1min，弃上清。9、 静置3min，待乙醇挥发完毕。10、 将离心管从磁架取出，加入50ul TE，并用移液器吹打磁珠混匀，静置5min。11、 将离心管置于磁架上，磁性分离。将上清液转移到另一个离心管中，此时所得的无色透明液体即为DNA溶液。12、 取质粒DNA溶液20ul，稀释200倍，用紫外分光光度计测定质粒DNA的在260nm和280nm下的吸收OD260，OD280。DNA浓度（ug/ml）=A260 X稀释

52、倍数/0.020 X L （L为比色杯厚度，一般为1；0.020为每毫升溶液内含1ug DNA钠盐时的光密度；A260为260nm波长处光密度读数）。13、 取质粒DNA溶液5ul加上样缓冲液，琼脂糖凝胶电泳。实验四 DNA 的琼脂糖凝胶电泳 一、 原理二、 核酸具有两性解离物质，一般在PH8.0左右条件下电泳时相正极移动。根据核酸片段所带电荷多少、片段的大小及构型和差异，可以用电泳法进行分离。电泳所用的凝胶主要是聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶两种。两种凝胶都具有分子筛作用，分辨率很高，在测定制备的核酸纯度、分子量、或核酸酶切后片段的分离、回收以及核酸的核苷酸顺序分析等方面，都能获得满意结果，所以

53、应用十分广泛。凝胶可以根据需要配成各种浓度，进行不同目的电泳。不同浓度凝胶的有效分离范围之间会有所重叠，但下表所列参数可作为选择参考。凝胶种类分离范围（碱基或碱基对数）0.3%琼脂糖50，000-100，0000.7%琼脂糖20，000-3001.4%琼脂糖6，000-2004%聚丙烯酰胺1，000-10010%聚丙烯酰胺500-2520%聚丙烯酰胺50-1聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理及应用在本科生所做的有关实验中已经介绍过。本实验主要介绍琼脂糖凝胶电泳。琼脂糖是一种天然的直链多糖。琼脂糖的原料是琼脂，由于它不带电荷琼脂糖和带电荷的琼脂所构成。琼脂中含有共价结合的硫酸和羟基，因此带有电荷。这样电泳

54、时即产生严重的电渗现象，影响电泳结果。为此，现在使用的是已经将琼脂分离除去，只剩下不带电荷的琼脂糖。琼脂糖制成不同浓度的琼脂糖凝胶。不同浓度琼脂糖凝胶，可以分离DNA片段大小的范围参数如下：琼脂浓度（%）长链DNA分子有效分离范围（kb）0.360-50.620-10.710-0.80.97-0.51.26-0.41.54-0.22.03-0.1琼脂糖凝胶的铸型可以根据需要而定。若将煮沸溶解的琼脂糖注入圆柱形玻璃管中，冷却后即形成柱状凝胶。若铺于平板玻璃上冷凝后形成板状凝胶。柱状凝电泳时应在管下口用橡皮圈固定一层层龙布，以挡住琼脂糖胶从管中滑出。板状凝胶电泳时，一般是直接将凝胶侵泡在电泳槽内的

55、电极缓冲液中进行，这样做可以充分保持凝胶的湿度，增加DNA分子的迁移率，而且，实验证明在这种条件下同样DNA样品的迁移率具有较好的重复性。出侵泡法外，也可用滤纸或纱布作为盐桥，将电极缓冲溶液与凝胶相连接进行电泳。琼脂糖凝胶电泳，方法简单，以操作，快速，在核酸研究中得到了广泛的应用。核酸凝胶电泳结果的检验方法有溴化乙锭、银染色及同位素放射自显影等。其中溴化乙锭染色法较为普遍。溴化乙锭（ethidium bromide 简称EB），由于溴化锭分子插入双螺旋结构的两个碱基之间后，形成一种在紫外线激发下能发出很强橙黄色荧光的络合物，所以十分容易观察。检测时灵敏度非常高，1ug/ml的溴化锭水溶液可检出

56、10ug或者更少的DNA样品。溴化乙锭产生的荧光在紫外光源下放置时间过长能被淬灭。也易受一些化学物质的污染而淬灭。溴化乙锭是一种DNA诱变剂，使用时应避免与皮肤接触。实验室中EB污染物应妥善处理。EB溶液和污染物不能直接倒入下水道及垃圾中，含有EB的凝胶应在干燥后烧毁，由于EB的致癌性，现在很多绿色EB替代品，如DNAgreen ，goldview和gel red等DNA染料。二试剂与器材用琼脂糖凝胶电泳法测定核酸片段的分子量，是在同一块凝胶板上一孔中加待测样品，另一孔中加一个标准分子量样品同时进行电泳。在紫外灯下比较样品与标准品中的位置，即可估计出待测样品的分子量大小范围，实验室常用的DNA

57、分子量标准品有DNA的酶切片段（见表1） 表1 DNA/HindIII参照物分子量（bp）23,13065572,3225649,41643612,027125 试剂 DNA样品（自制或购买）：配成100ug/ml溶液；琼脂糖；DNAgreen；指示剂：先配制0.1%溴酚蓝水溶液，然后取一份与等体积的甘油（或40%的蔗糖）混匀即可，TBE缓冲液（89mmol/L Tis,89mmol/L硼酸，2.5mmol/L EDTA-Na2，PH8.3）：称取10.78gTris 5.50g硼酸，0.93gEDTA-Na2；分子量标准DNA：DNA。器材6cmX6cm玻璃板；电泳槽：可将凝胶板浸泡在电极缓冲液中的水平电泳槽；电泳仪；紫外透射检测仪；恒温水浴锅。三、 操作步骤1、琼脂糖凝胶的制备：根据样品DNA分子大小选择凝胶浓度。本实验选用0.7%的琼脂糖胶。称取琼脂0.7g放入三角瓶中，加入100mlTBE缓冲液。将三角瓶入沸水浴中加热15-20min，使琼脂糖充分溶解，然后在室温放至60度左右，加入DNAgreen