生物药物分析与检测高效液相色谱法PPT课件

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1、2022-4-8第一节第一节 概述概述第二节第二节 基本理论基本理论第三节第三节 高效液相色谱的定性和定量分析高效液相色谱的定性和定量分析第四节第四节 实际操作中的问题实际操作中的问题第五节第五节 在药物在药物(yow)(yow)分析中的应用分析中的应用高效高效(o xio)(o xio)液相色谱法液相色谱法第1页/共236页第一页，共236页。第2页/共236页第二页，共236页。2022-4-81、历史： 1903年 茨维特分离绿叶色素(Tswett实验) 40年代 TLC，纸色谱 50年代 GC出现使色谱具备分离和在线分析功能 60年代末 HPLC出现，使色谱分析范围进一步扩大(kud)

2、2、展望： 1新型固定相和检测器 2联用仪器：GC-MS，HPLC-MS 3智能化发展第一节第一节 概述概述(i sh)(i sh)第3页/共236页第三页，共236页。2022-4-8Tswett实验实验(shyn)第4页/共236页第四页，共236页。2022-4-8茨维特的实验(shyn)（图示）第5页/共236页第五页，共236页。2022-4-8色谱(s p)三要素： Tswett实验实验(shyn)第6页/共236页第六页，共236页。2022-4-8经典(jngdin)液相色谱法柱层析第7页/共236页第七页，共236页。高效液相色谱法（ high performance liq

3、uid chromatography；HPLC）是在经典液相色谱法的基础(jch)上，引入了气相色谱的理论与高压技术，以高压输送流动相，采用高效固定相及高灵敏度检测器，发展而成的现代液相色谱分离分析方法。第8页/共236页第八页，共236页。概述 高效液相色谱(HPLC)是以溶剂液体为流动相的色谱方法。 早期液相色谱，包括Tswett的工作，都是在直径1-5cm, 长50-500cm的玻璃柱中进行(jnxng)的。为保证有一定的柱流速，填充的固定相颗粒直径多在150-200m范围内。即使这样，流速仍然很低(流动相极性流动相极性正相分配正相分配(fnpi)色谱色谱（正相柱）（正相柱）组分组分(z

4、fn)极性越大极性越大，保留时间越长；使用，保留时间越长；使用极性化合物的分离。极性化合物的分离。反相分配反相分配(fnpi)色谱色谱（反相柱）（反相柱）固定相极性固定相极性流动相极性流动相极性组分极性越小，保留时组分极性越小，保留时间越长；适用非极性化间越长；适用非极性化合物的分离。合物的分离。第70页/共236页第七十页，共236页。 将固定液的官能团键合在载体的表面(biomin)，而构成化学键合相。 以化学键合相为固定相的色谱法称为化学键合相色谱法，简称键合相色谱法（BPC）。正相正相键合相键合相色谱色谱反相反相键合相键合相色谱色谱分类三、化学键合相色谱三、化学键合相色谱第71页/共2

5、36页第七十一页，共236页。 固定相非常稳定，在使用中不易流失。由于固定相非常稳定，在使用中不易流失。由于(yuy)可将各种极性的官能团键合到载体表面可将各种极性的官能团键合到载体表面，因此它适用于种类繁多样品的分离。，因此它适用于种类繁多样品的分离。特点(tdin) 将各种( zhn)不同基团通过化学反应键合到硅胶（担体）表面的游离羟基上。第72页/共236页第七十二页，共236页。1. 键合固定键合固定(gdng)相相制备制备ODS(C18)键合相键合相硅胶硅胶(u jio)十八烷基十八烷基(wn j)氯氯硅烷硅烷非极性非极性硅烷化反应硅烷化反应使用使用pH范围：范围： 2-8第73页/

6、共236页第七十三页，共236页。2. 键合固定键合固定(gdng)相相类型类型类型(lixng)反相柱正相柱氨丙基氰乙基、醚和醇等极性基团(j tun)不同碳原子数的烷烃（C8和C18）、苯基等疏水基团第74页/共236页第七十四页，共236页。保留保留(boli)时间：时间：例：以例：以ODS键合色谱柱、甲醇键合色谱柱、甲醇-水为流动相分离水为流动相分离(fnl)以下两种苯甲酸，试判断出峰次序。以下两种苯甲酸，试判断出峰次序。COOHOHOHCOOHOHOHHO没食子酸没食子酸3,4-二羟基二羟基(qingj)苯苯甲酸甲酸固定相固定相: 非极性非极性; 流动相流动相: 极性极性组分极性组分

7、极性: 3,4-二羟基苯甲酸二羟基苯甲酸 固定相极性 底剂 + 有机调节剂（极性调节剂） 例：水 + 甲醇，乙腈，THF第81页/共236页第八十一页，共236页。4保留行为的影响因素(yn s)：1）溶质的分子结构： 溶质极性，疏水性，k，组分tR2）流动相极性与k的关系： 流动相极性，洗脱能力，k，组分tR3）固定相： 碳链，疏水性，k，组分tR5出柱顺序：极性大的组分先出柱 极性小的组分后出柱6适用：非极性中等极性组分（HPLC80%问题）第82页/共236页第八十二页，共236页。正相和反相键合色谱法 在HPLC分析中，有时(yush)要在流动相中加入适量的盐(碳酸铵、四烷基铵盐)或酸

8、，为什么？答：都是为了防止峰形拖尾。加入盐类是为了减少待测物与键合相表面的残留硅醇基作用；加入酸是抑制酸类待测物的离解，使其以游离酸在柱内分离。第83页/共236页第八十三页，共236页。固定相与固定相与(xingy)流动相流动相反相(fn xin)HPLC 极性:固定相 流动相 固定(gdng)相 - 极性强 流动相(己烷, 庚烷)- 极性弱 极性物质后出峰正相色谱正相色谱 20%反相色谱反相色谱80%正相色谱正相色谱 20%反相色谱反相色谱80%与固定相与固定相极性相近极性相近tR长长主流第84页/共49页第84页/共236页第八十四页，共236页。流动流动(lidng)相相(反相反相)常

9、用溶剂(rngj)：乙腈、甲醇、水等实际使用：甲醇(ji chn)-水/乙腈-水混合体系等度洗脱：流动相比例恒定流动相比例恒定梯度洗脱：逐步提高有机溶剂比例逐步提高有机溶剂比例第85页/共49页第85页/共236页第八十五页，共236页。正相色谱正相色谱低极性流动相低极性流动相反相色谱反相色谱高极性流动相高极性流动相中等极性流动相中等极性流动相中等极性流动相中等极性流动相时间时间时间时间时间时间时间时间待测物极性：待测物极性：ABC正、反相色谱中极性和保留时间的关系正、反相色谱中极性和保留时间的关系第86页/共236页第八十六页，共236页。四、离子交换四、离子交换(l z jio hun)色

10、谱色谱固定(gdng)相：阴离子交换树脂或阳离子交换树脂。阳离子：阳离子：SO3H(强强)CO2H(弱弱)阴离子：阴离子：N+R3(强强)NH2 (弱弱)担体苯乙烯苯乙烯-二二乙烯苯共聚乙烯苯共聚物微球物微球键合基团(j tun)键合第87页/共236页第八十七页，共236页。流动(lidng)相：阳离子交换树脂固定相，采用酸性水溶液；阴离子交换树脂固定相，采用碱性水溶液。基本原理： 试样组分在固定相上发生的反复离子交换反应(fnyng)，依据组分与离子交换剂之间亲和力的不同而分离。第88页/共236页第八十八页，共236页。阳离子交换(jiohun)：RSO3H + M+ = RSO3 M

11、+ H+ 阴离子交换(jiohun)：RNR4OH + X- = RNR4 X + OH-一般(ybn)形式： RA + B = RB + A 试样组分与交换基团(j tun)间的作用力的大小决定色谱的保留行为。第89页/共236页第八十九页，共236页。阳离子交换(jiohun)：RSO3H + M+ = RSO3 M + H+ 阴离子交换(jiohun)：RNR4OH + X- = RNR4 X + OH- 组分与离子交换剂之间作用力的大小与离子半径、电荷、存在形式(xngsh)等有关。作用大，保留时间长。应用(yngyng)：离子及可离解的化合物， 氨基酸、核酸、蛋白质等。第90页/共2

12、36页第九十页，共236页。五、离子五、离子(lz)对色谱对色谱离子对色谱: 用正向或反向色谱柱分离(fnl)离子和中性化合物混合物的方法。 离子对：两个相反(xingfn)电荷的离子相互作用形成一个中 性化合物。第91页/共236页第九十一页，共236页。原理：将一种（或多种）与溶质离子电荷相反的离子（对离子或反离子）加到流动相（固定相）中使其与溶质离子结合形成(xngchng)疏水性离子对化合物，使其能够在两相之间进行分配。第92页/共236页第九十二页，共236页。 由于待测离子的性质不同，与对离子形成离子对的能力不同，形成的离子对的疏水能力不同，在两相间的分配系数不同，从而实现(shx

13、in)色谱分离。阴离子分离：烷基铵类，如氢氧化四丁基铵或氢氧化十六烷基三甲铵作为(zuwi)对离子。阳离子分离：烷基磺酸类，如己烷磺酸钠作为(zuwi)对离子。第93页/共236页第九十三页，共236页。六、空间六、空间(kngjin)排阻色谱排阻色谱-凝凝胶色谱胶色谱 原理：利用凝胶中孔径大小的不同，按分子大小分离。小分子可以扩散到凝胶空隙，由其中通过，出峰最慢；中等分子只能通过部分凝胶空隙，中速通过；而大分子被排斥(pich)在外，出峰最快；溶剂分子小，故在最后出峰。 快速分离(fnl)不同分子量混合物的色谱方法。 第94页/共236页第九十四页，共236页。相对分子质量相对分子质量(zh

14、ling)(zhling)差别差别大于大于1010的化合物的化合物才可以分离才可以分离排阻色谱排阻色谱(s p)分离分离示意图示意图第95页/共236页第九十五页，共236页。七、亲和色谱七、亲和色谱(s p) 原理：利用生物大分子和固定相表面存在(cnzi)的某种特性亲和力，进行选择性分离的一种色谱方法。具有(jyu)反应活性的连接链（环氧、联胺等） 酶、抗原等第96页/共236页第九十六页，共236页。第一节 色谱图流出曲线(qxin)及有关术语 一、色谱流出曲线(qxin)及色谱峰（一）色谱(s p)流出曲线色谱(s p)图（chromatogram）是样品被流动相冲洗，通过色谱是样品被

15、流动相冲洗，通过色谱(s p)柱，流经检测器，所形成的浓柱，流经检测器，所形成的浓度信号随洗脱时间变化而形成的曲线称为色谱度信号随洗脱时间变化而形成的曲线称为色谱(s p)流出曲线流出曲线(简称流出曲线简称流出曲线)，即浓度，即浓度时间曲线。时间曲线。动画动画第97页/共236页第九十七页，共236页。（二）（二） 基线（基线（baseline）1、基线、基线 （baseline）在正常操作条件下，仅有流）在正常操作条件下，仅有流动相通过时响应信号时间曲线。动相通过时响应信号时间曲线。2、基线噪声（、基线噪声（baseline noise）由各种因素所引）由各种因素所引起的基线波动起的基线波动

16、(bdng)。(一般计算峰前后一般计算峰前后1-2min内的噪声）内的噪声）3、基线漂移（、基线漂移（baseline drift） 基线随时间定向的基线随时间定向的缓慢移动缓慢移动第98页/共236页第九十八页，共236页。（三）色谱峰（三）色谱峰（chromatographic peak）1、正常色谱峰：呈正态分布、正常色谱峰：呈正态分布2. 拖尾峰（拖尾峰（tailing peak）：前沿陡峭）：前沿陡峭(duqio)，后沿拖尾的不对称色谱峰，后沿拖尾的不对称色谱峰3、前伸峰（、前伸峰（leading peak）:前沿平缓，后沿陡峭前沿平缓，后沿陡峭(duqio)的不对称色谱峰的不对称色

17、谱峰第99页/共236页第九十九页，共236页。4. 4. 不对称不对称(duchn)(duchn)度（度（AsAs）或拖尾因子）或拖尾因子(T) (T) （tailing factortailing factor）As(不对称(duchn)因子)=B/A（ x=0.10 h）T(拖尾因子)=（A+B）/2A（ x=0.05 h）第100页/共236页第一百页，共236页。AsymmetryA factor describing the shape of a chromatographic peak. Theory assumes a Gaussian shape peak that is s

18、ymmetrical. The peak asymmetry factor is the ratio (at 10 percent of the peak height) of the distance between the peak apex and the back side of the chromatographic curve to the distance between the peak apex and the front side of the chromatographic curve. A value 1 is a tailing peak, while a value

19、 1 is a fronting peak 第101页/共236页第一百零一页，共236页。5. 假峰（ghost peak）又称鬼峰：由于仪器(yq)条件的变化等原因而在谱图上出现的色谱峰，即并非由试样所产生的峰。第102页/共236页第一百零二页，共236页。色谱(s p)峰： 1 1个样品组分的色谱峰可用3 3个参数来描述，即峰高( (或峰面积(min j)(min j)、峰位和峰宽。峰高( (或峰面积(min j)(min j)用于定量；峰位用于定性；峰宽可用于衡量柱效。若描述一组色谱峰，还需用分离参数表述相邻峰的重叠程度。第103页/共236页第一百零三页，共236页。二、 保留值定

20、性(dng xng)参数（一）保留时间(retention time)（1）死时间(dead time):tM（2）保留时间(retention time) （tR）（3）调整(tiozhng)保留时间(adjusted retention time) （tR ）：tR= tRtM（二）保留体积(retention volume)（1）死体积（VM）： VM = tM Fc（2）保留体积（VR）：VR = tRFc（3）调整(tiozhng)保留体积(VR)：V R = VR VM Fc：载气流速(li s)（mL/min)第104页/共236页第一百零四页，共236页。（1 1） 死时间(s

21、hjin)tM(shjin)tM 一些不被固定相吸收或吸附的气体通过色谱柱时，从进样到出现峰极大值所需的时间(shjin)（它正比于色谱柱的空隙体积）。如用热导池作检测器时，从注射空气样品到空气峰顶出现时的时间(shjin)。以 s 或 min 为单位表示。第105页/共236页第一百零五页，共236页。（2 2）保留(boli)(boli)时间 (tR) (tR) 试样（某一组分）从进样开始到柱后出现峰极大点时所经历的时间为试样中某一组分的保留时间。以 s 或 min 为单位(dnwi)表示。第106页/共236页第一百零六页，共236页。（3） 调整(tiozhng)保留时间 保留时间(s

22、hjin)(shjin)减去死时间(shjin)(shjin)即为调整保留时间(shjin) :(shjin) : ) (Rt )(MRtttR第107页/共236页第一百零七页，共236页。（4 4） 死体积(tj)(tj) 指色谱柱中不被固定相占据的空间及进样系统和到检测系统的总体积.当色谱仪中管路和连接头间的空间以及(yj)检测系统的空间的总体积很小而可忽略不计时，等于死时间乘以载气的流速。0MFtVM第108页/共236页第一百零八页，共236页。（ 5） 保留体积 从注射样品到经过柱后色谱峰顶出现时，通过色谱系统流动相的体积，一般可用保留时间乘载气流速(li s)求得，以 mL 为单

23、位表示。 0RFtVR第109页/共236页第一百零九页，共236页。（6）调整(tiozhng)保留体积 保留体积(tj)减去死体积(tj)即为调整保留体积(tj)(VRVM)。 RV0RFtVR第110页/共236页第一百一十页，共236页。（三）相对(xingdu)保留值( r 21 ) 在一定色谱(s p)条件下被测组份2和组份1调整保留值之比。 r 21 =tR2 /tR1 = VR2 / VR1式中式中 tR2 tR2 组份组份2 2的调整保留时间的调整保留时间; ; t R1 t R1 组份组份1 1的调整保留时间。的调整保留时间。它与流动相的流速和色谱柱的物理指标无关；仅与柱温

24、和它与流动相的流速和色谱柱的物理指标无关；仅与柱温和(wnh)(wnh)固定相的性质有关固定相的性质有关第111页/共236页第一百一十一页，共236页。（四）保留(boli)指数(retention index）tR(x)-tR(x)-待测物待测物X X的调整的调整(tiozhng)(tiozhng)保留时间保留时间tR(z)-tR(z)-碳原子数为碳原子数为Z Z的正构烷烃的调整的正构烷烃的调整(tiozhng)(tiozhng)保留时间保留时间tR(z+n)-tR(z+n)-碳原子数为碳原子数为z+nz+n的正构烷烃的调整的正构烷烃的调整(tiozhng)(tiozhng)保留时间保留时

25、间tR(z) tR(x) tR(z+n) tR(z) tR(x) tR(z+n) （通常（通常 n=1 n=1） 规定规定正构烷烃的正构烷烃的I I 值是其原子数的值是其原子数的100100倍，倍，如：正庚烷如：正庚烷I=700I=700)lglglglg(100,)(,)(,)(,)(ZRnZRzRXRttttnZ第112页/共236页第一百一十二页，共236页。)lglglglg()()()()()()()(ZttttItttZRZRZRXRXZRXRZR11100第113页/共236页第一百一十三页，共236页。第114页/共236页第一百一十四页，共236页。保留保留(boli)指数差

26、指数差化合物化合物x x在某一固定液在某一固定液s s上测得的保留上测得的保留(boli)(boli)指数减去在角鲨烷（异三十烷）指数减去在角鲨烷（异三十烷）固定液上得到的保留固定液上得到的保留(boli)(boli)指数。指数。第115页/共236页第一百一十五页，共236页。（一）（一）. . 区域区域(qy)(qy)宽度宽度 用来衡量色谱峰宽度的参用来衡量色谱峰宽度的参数，有三种数，有三种(sn zhn)(sn zhn)表示方法表示方法：（1 1）标准偏差）标准偏差( () )：即：即0.6070.607倍倍峰高处色谱峰宽度的一半。峰高处色谱峰宽度的一半。（2 2）半峰宽）半峰宽(W1/

27、2)(W1/2)：色谱峰高：色谱峰高一半处的宽度一半处的宽度 W1/2 =2.354 W1/2 =2.354 （3 3）峰底宽）峰底宽(W)(W)：W=4 W=4 三三 、柱效参数、柱效参数(cnsh)第116页/共236页第一百一十六页，共236页。从色谱(s p)图中，可得许多信息：1 1 色谱峰的个数，可推断所含组分的个数；2 2 根据色谱峰的保留值，可以进行定性分析；3 3 根据色谱峰的面积(min j)(min j)或峰高，可以进行定量分析；4 4 色谱峰的保留值及其区域宽度，评价柱效依据；5 5 色谱峰两峰间的距离判断组分选择性 第117页/共236页第一百一十七页，共236页。(

28、 (一）一）. . 分配系数（分配系数（ partition factor partition factor） K K在一定温度、压力下，组分在固定在一定温度、压力下，组分在固定(gdng)(gdng)相和流动相和流动相中平衡浓度的比值。相中平衡浓度的比值。Ms ccK 组分在流动相中的浓度组分在固定相中的浓度第三节 色谱法基本原理一、分配系数和分配比：相平衡参数，是用来描述色谱过一、分配系数和分配比：相平衡参数，是用来描述色谱过程中，样品程中，样品(yngpn)组分在相对运动的两相中的分配情组分在相对运动的两相中的分配情况况动画动画第118页/共236页第一百一十八页，共236页。分配系数(

29、xsh) K 的讨论 一定温度下，组分的分配系数一定温度下，组分的分配系数K越大，出峰越慢；越大，出峰越慢；试样一定时，试样一定时，K主要取决于固定相性质；主要取决于固定相性质；选择适宜的固定相可改善分离效果；选择适宜的固定相可改善分离效果；试样中的各组分具有不同的试样中的各组分具有不同的K值是分离的基础；值是分离的基础；某组分的某组分的K = 0时，即不被固定相保留时，即不被固定相保留(boli)，最先流出。，最先流出。同一条件下，若两组分的同一条件下，若两组分的K值相等，则色谱峰重合，差别值相等，则色谱峰重合，差别越大，色谱峰的距离越大越大，色谱峰的距离越大 组分在流动相中的浓度组分在流动

30、相中的浓度组分在固定相中的浓度组分在固定相中的浓度 K第119页/共236页第一百一十九页，共236页。（二）（二）. .分配分配(fnpi)(fnpi)比比 （partion ratiopartion ratio）k k 或或 K K 在实际工作中，也常用分配比来表征(bio zhn)色谱分配平衡过程。分配比是指，在一定温度下，组分在两相间分配达到平衡时的质量比：Ms mmk 组分在流动相中的质量组分在流动相中的质量组分在固定相中的质量组分在固定相中的质量 1. 分配系数与分配比都是与组分及固定相的热力学性质有关的常数，随分离柱温度、柱压的改变而变化。 2.分配系数决定于组分和两相性质,与两

31、相体积无关.而分配比与组分和两相性质有关,也两相体积有关 3. 分配系数与分配比都是衡量色谱(s p)柱对组分保留能力的参数，数值越大，该组分的保留时间越长。 分配比也称：分配比也称： 容量因子容量因子(capacity factor)；容量比容量比(capacity factor)；第120页/共236页第一百二十页，共236页。（三）分配（三）分配(fnpi)比与分配比与分配(fnpi)系数的关系数的关系系 式中为相比(xin b)。 填充柱相比(xin b)：535；毛细管柱的相比(xin b)：501500。VM为流动相体积，即柱内固定相颗粒间的空隙体积； VS为固定相体积，对不同类型

32、色谱柱， VS的含义不同； 气-液色谱柱： VS为固定液体积； 气-固色谱柱： VS为吸附剂表面容量；KVVccVVmVVmmmkmSmsmmmSSSmS第121页/共236页第一百二十一页，共236页。（四）（四） 分配比与保留时间分配比与保留时间(shjin)的关系的关系 tR = tM(1+k)tR=ktM第122页/共236页第一百二十二页，共236页。（五）（五） 分配分配(fnpi)比、分配比、分配(fnpi)系数系数与选择性因子的关系与选择性因子的关系 a a = tR（2）/ tR（1）= k2 /k1= K2 /K1第123页/共236页第一百二十三页，共236页。讨论：如何

33、(rh)使A、B组分完全分离ABAB组分组分A、B在沿柱移动时不同位置的浓度轮廓在沿柱移动时不同位置的浓度轮廓浓浓度度1.两组分的分配系数必须有差异两组分的分配系数必须有差异2.区域宽度区域宽度(kund)的扩展速度应小于区域分离的速度的扩展速度应小于区域分离的速度3.在保证快速分离的前提下，提供足够长的色谱柱在保证快速分离的前提下，提供足够长的色谱柱第124页/共236页第一百二十四页，共236页。练习题1.混合(hnh)样品a, b, c, d, e在柱上的 分配系数分别为105，85，310，50，205，则各个组分流出柱的先后顺序为（ ）A d，b，a，e，c B. c，d，a，b，e

34、 C. c，e， a，b，d D. a，b，c，d，e第125页/共236页第一百二十五页，共236页。下列参数改变时，会引起分配系数变化(binhu)的是（ ）A 柱长增加 B. 固定相改变 C. 相比减少 D. 流动相流速增加 下列参数改变时，会引起分配比变大的是（ ）A 柱长增加 B. 固定相改变 C. 相比减少 D. 流动相流速增加 第126页/共236页第一百二十六页，共236页。 色谱理论需要解决的问题：色谱分离过程的热力学和动力学问题。影响(yngxing)分离及柱效的因素与提高柱效的途径，柱效与分离度的评价指标及其关系。组分保留时间为何不同？色谱峰为何变宽？组分保留时间为何不同

35、？色谱峰为何变宽？组分保留时间：色谱过程的热力学因素控制；组分保留时间：色谱过程的热力学因素控制； （组分和固定液的结构和性质）（组分和固定液的结构和性质）色谱峰变宽：色谱过程的动力学因素控制；色谱峰变宽：色谱过程的动力学因素控制； （两相中的运动阻力，扩散（两相中的运动阻力，扩散(kusn)）两种色谱理论：塔板理论和速率理论；两种色谱理论：塔板理论和速率理论；第127页/共236页第一百二十七页，共236页。 塔板理论的假设：塔板理论的假设： (1) 在每一个平衡过程间隔内，平衡可以迅速达到；在每一个平衡过程间隔内，平衡可以迅速达到； (2) 将载气看作成脉动（间歇）过程；将载气看作成脉动（

36、间歇）过程； (3) 试样沿色谱柱方向的扩散可忽略；试样沿色谱柱方向的扩散可忽略； (4) 每次分配的分配系数相同。每次分配的分配系数相同。（5）所有物质在开始）所有物质在开始(kish)时全部进入零号塔板时全部进入零号塔板二、 塔板理论(lln)(lln) （1 1）. .塔板理论（塔板理论（plate theoryplate theory）半经验理论；半经验理论； 将色谱分离过程比拟将色谱分离过程比拟(bn)(bn)作蒸馏作蒸馏过程，将连续的色谱分离过程分割成多次的过程，将连续的色谱分离过程分割成多次的平衡过程的重复平衡过程的重复 （类似于蒸馏塔塔板上（类似于蒸馏塔塔板上的平衡过程）；的平

37、衡过程）；第128页/共236页第一百二十八页，共236页。组分(zfn)在n=5,k,=1,m=1柱内任一板上分配表载气体积 01234柱出口N=010000010.50.5000020.250.50.2500030.1250.3750.3750.1250040.0630.250.3750.1250.063050.0320.1570.3130.3130.1570.03260.0160.0950.2350.3130.2350.07970.0080.0560.1160.2750.2750.11880.0040.0320.0860.1960.2750.13890.0020.0180.0590.14

38、10.2460.138100.0010.1010.0380.1000.1890.118第129页/共236页第一百二十九页，共236页。 色谱柱长：L， 虚拟的塔板间距离：H， 色谱柱的理论塔板数：n，则三者的关系(gun x)为： n = L / H理论塔板数与色谱参数之间的关系(gun x)为：保留时间包含保留时间包含(bohn)(bohn)死时间，在死时间内不参与分配死时间，在死时间内不参与分配! !222/1)(16)(54. 5bRRWtWtn第130页/共236页第一百三十页，共236页。（2 2）. .有效有效(yuxio)(yuxio)塔板数和有效塔板数和有效(yuxio)(y

39、uxio)塔板高度塔板高度 单位柱长的塔板数越多，表明(biomng)柱效越高。 用不同物质计算可得到不同的理论塔板数。 组分在tM时间内不参与柱内分配。需引入有效塔板数和有效塔板高度：有效有效有效nLHYtYtnRR222/1)(16)(54. 5222/1)(16)(54. 5YtYtnRR理第131页/共236页第一百三十一页，共236页。（二） 塔板数和塔板高度(god) 柱效：也叫柱效能 理论塔板数n 有效(yuxio)塔板数neff 理论塔板高度H H=L/n 有效(yuxio)塔板高度 Heff Heff =L/neff222/1)(16)(54. 5WtWtnRR2,22/1,

40、)(16)(54. 5WtWtnRReff第132页/共236页第一百三十二页，共236页。222)(02Rttecc得出色谱流出曲线得出色谱流出曲线(qxin)(qxin)方程：方程： C0:进样的浓度tR:保留(boli)时间:标准偏差第133页/共236页第一百三十三页，共236页。1 1 较好地解析了色谱曲线形状较好地解析了色谱曲线形状2 2 2 2 浓度极大点浓度极大点CmaxCmax的位置是的位置是tR (tR (即即VR)VR)3 3 3 3 计算计算(j sun)(j sun)评价柱效评价柱效塔板理论塔板理论(lln)(lln)成功之处成功之处: :第134页/共236页第一百

41、三十四页，共236页。第135页/共236页第一百三十五页，共236页。（3 3）. .塔板理论塔板理论(lln)(lln)的理解的理解 (1)当色谱柱长度一定时，塔板数当色谱柱长度一定时，塔板数 n 越大越大(塔板高度塔板高度 H 越小越小)，被测组分在柱内被分配的次数越多，被测组分在柱内被分配的次数越多，柱效能，柱效能(xionng)则越高，所得色谱峰越窄。则越高，所得色谱峰越窄。 (2)不同物质在同一色谱柱上的分配系数不同，用有效塔板数和有效塔板高度不同物质在同一色谱柱上的分配系数不同，用有效塔板数和有效塔板高度(god)作作为衡量柱效能的指标时，应指明测定物质。为衡量柱效能的指标时，应

42、指明测定物质。 (3) (3)柱效不能表示被分离组分的实际分离效果，当两组分的分配系数柱效不能表示被分离组分的实际分离效果，当两组分的分配系数K K相同时，无论该相同时，无论该色谱柱的塔板数多大，都无法分离。色谱柱的塔板数多大，都无法分离。 (4) (4)塔板理论无法解释同一色谱柱在不同的载气流速下柱效不同的实验结果，也无法指出影响柱效塔板理论无法解释同一色谱柱在不同的载气流速下柱效不同的实验结果，也无法指出影响柱效的因素及提高柱效的途径。的因素及提高柱效的途径。第136页/共236页第一百三十六页，共236页。三. 速率(sl)理论-影响柱效的因素（一）（一）. . 范范. .弟姆特（弟姆特

43、（Van DeemterVan Deemter）方程式气相）方程式气相色谱速率理论色谱速率理论(lln)(lln) H = A + B/u + Cu H = A + B/u + Cu H H：理论：理论(lln)(lln)塔板高度，塔板高度， u u：载气的线速度：载气的线速度(cm/s)(cm/s) 减小减小A、B、C三项可提高柱效；三项可提高柱效； 存在着最佳流速存在着最佳流速(li s)； A、B、C三项各与哪些因素有关？三项各与哪些因素有关？第137页/共236页第一百三十七页，共236页。A涡流(wli)扩散项（eddy diffusion） A = 2dp dp：固定相的平均颗粒(

44、kl)直径：固定相的填充不均匀因子 固定相颗粒(kl)越小dp，填充的越均匀，A，H，柱效n。表现在涡流扩散所引起的色谱峰变宽现象减轻，色谱峰较窄。（动画）（动画）第138页/共236页第一百三十八页，共236页。B/u 分子(fnz)扩散项molecular diffusion） B = 2 Dg ：弯曲因子，填充柱色谱，1。 Dg：试样组分分子(fnz)在气相中的扩散系数（cm2s-1） (1) 存在着浓度差，产生纵向扩散; (2) 扩散导致色谱峰变宽，H(n)，分离变差; (3) 分子(fnz)扩散项与流速有关，流速，滞留时间，扩散; (4) 扩散系数：Dg (M载气)-1/2 ； M载

45、气，B值。（动画）（动画）第139页/共236页第一百三十九页，共236页。 k为容量因子； Dg 、DL为扩散系数; dp：固定(gdng)相的平均颗粒直径;df 液膜的厚度。 减小担体粒度，选择小分子量的气体作载气，降低固定(gdng)相液膜厚度，可降低传质阻力。C u 传质阻力项 传质阻力包括(boku)气相传质阻力Cg和液相传质阻力CL即： C =（Cg + CL）gpgDdkkC22)1 (01. 0（动画）（动画）LfLDdkkC22)1 (32第140页/共236页第一百四十页，共236页。（二）范氏方程（二）范氏方程(fngchng)讨论讨论 1、颗粒、颗粒(kl)大小与粒度范

46、围大小与粒度范围 （1）颗粒）颗粒(kl)太大，填充均匀性越差太大，填充均匀性越差 ,（2） dP 太小气阻大，固定相颗粒太小气阻大，固定相颗粒(kl)直径一般直径一般4060，6080，80100目。目。 A = 2dp 第141页/共236页第一百四十一页，共236页。2.2.载气流速载气流速(li s)(li s)与柱效与柱效最佳流最佳流速速(li s)(li s)载气流速高时：载气流速高时： 传 质 阻 力 项 是 影 响 柱 效 的 主 要传 质 阻 力 项 是 影 响 柱 效 的 主 要(zhyo)(zhyo)因素，流速因素，流速，柱效，柱效。载气流速低时：载气流速低时： 分 子

47、扩 散 项 成 为 影 响 柱 效 的 主 要分 子 扩 散 项 成 为 影 响 柱 效 的 主 要(zhyo)(zhyo)因素，流速因素，流速, ,柱效柱效 。H - u曲线与最佳流速：曲线与最佳流速： 由于流速对这两项完全相反的作用，流速对柱效的总影响使得存在着一个最佳流速值，即速由于流速对这两项完全相反的作用，流速对柱效的总影响使得存在着一个最佳流速值，即速率率(sl)方程式中塔板高度对流速的一阶导数有一极小值。方程式中塔板高度对流速的一阶导数有一极小值。02CUBdUdHBCAH2minCBuopt/第142页/共236页第一百四十二页，共236页。(三）影响谱带变宽的其它三）影响谱带

48、变宽的其它(qt)因素因素1、非线性分配色谱、非线性分配色谱2、载体表面活性吸附、载体表面活性吸附(xf)中心造成的拖尾峰中心造成的拖尾峰3、 柱外效应柱外效应第143页/共236页第一百四十三页，共236页。当溶质(rngzh)浓度较低时，K为常数，Cs与Cm成线性关系，其相应的色谱过程称为线性色谱。CSCM1、非线性分配(fnpi)色谱第144页/共236页第一百四十四页，共236页。CMCSCSCM非线性色谱。其具有以下几个特点：a、溶质洗脱峰不再是对称的正态分布，而是有“拖尾”或“伸舌”现象；b、样品的保留值可变。线性色谱中同一样品的保留值是常数，只随样品不同而变化；c、色谱峰的峰高与

49、浓度不是(b shi)线性关系。在线性色谱中峰高与组分是线性关系。峰高是定量分析的重要数据。在非线性色谱中，峰高增加的速率随浓度的增加而逐渐降低，因而峰高不能作为定量分析的指标。第145页/共236页第一百四十五页，共236页。（3 3）. .气相色谱速率理论气相色谱速率理论(lln)(lln)的要点的要点 (1) (1)组分组分(zfn)(zfn)分子在柱内运行的多路径与涡流扩散、浓度梯度所造成的分子扩散及传分子在柱内运行的多路径与涡流扩散、浓度梯度所造成的分子扩散及传质阻力使气液两相间的分配平衡不能瞬间达到等因素是造成色谱峰扩展柱效下降的主要原质阻力使气液两相间的分配平衡不能瞬间达到等因素

50、是造成色谱峰扩展柱效下降的主要原因。因。 (2)通过选择适当通过选择适当(shdng)的固定相粒度、载气种类、液膜厚度及载气流速可提高柱效的固定相粒度、载气种类、液膜厚度及载气流速可提高柱效。 (3) (3)速率理论为色谱分离和操作条件选择提供了理论指导。阐明了流速和柱温对柱效及分离的影响。速率理论为色谱分离和操作条件选择提供了理论指导。阐明了流速和柱温对柱效及分离的影响。 (4) 各种因素相互制约，如载气流速增大，分子扩散项的影响减小，使柱效提高，各种因素相互制约，如载气流速增大，分子扩散项的影响减小，使柱效提高，但同时传质阻力项的影响增大，又使柱效下降；柱温升高，有利于传质，但又加剧了但同

51、时传质阻力项的影响增大，又使柱效下降；柱温升高，有利于传质，但又加剧了分子扩散的影响，选择最佳条件，才能使柱效达到最高。分子扩散的影响，选择最佳条件，才能使柱效达到最高。第146页/共236页第一百四十六页，共236页。（二）（二）. Giddings. Giddings方程式液相色谱速率理论方程式液相色谱速率理论液相色谱与气相色谱的的主要区别在于液相色谱与气相色谱的的主要区别在于(ziy)(ziy)液液体和气体性质的差异体和气体性质的差异第147页/共236页第一百四十七页，共236页。1958年，Giddings 和Snyder等提出(t ch)液相色谱速率方程式：第148页/共236页第

52、一百四十八页，共236页。uDCHmmd第149页/共236页第一百四十九页，共236页。uDdCHsfss2uDdCHmpmm2uDdCHmpmssm2第150页/共236页第一百五十页，共236页。第151页/共236页第一百五十一页，共236页。第152页/共236页第一百五十二页，共236页。第153页/共236页第一百五十三页，共236页。第154页/共236页第一百五十四页，共236页。在高效液相色谱(s p)中, 液体的扩散系数仅为气体的万分之一，则速率方程中的分子扩散项B/U较小，可以忽略不计，即： H = A +B/u+ C u 故液相色谱(s p)H-u曲线与气相色谱(s

53、p)的形状不同，如图所示。提高柱内填料装填的均匀性和降低粒度提高柱内填料装填的均匀性和降低粒度选用选用(xunyng)低粘度的流动相或适当提高柱温低粘度的流动相或适当提高柱温 第155页/共236页第一百五十五页，共236页。第156页/共236页第一百五十六页，共236页。色谱(s p)峰越窄，理论塔板数就越_，理论塔板高度就越_，柱效能就越_。 第157页/共236页第一百五十七页，共236页。一、 分离度: :评价分离情况的综合(zngh)(zngh)指标 塔板理论(lln)和速率理论(lln)都难以描述难分离物质对的实际分离程度。即柱效为多大时，相邻两组份能够被完全分离。 难分离物质对

54、的分离度大小受色谱过程中两种因素的综合影响：保留值之差色谱过程的热力学因素； 区域宽度色谱过程的动力学因素。 色谱分离中的四种情况如图所示：第四节 分离度与基本(jbn)色谱分离方程式第158页/共236页第一百五十八页，共236页。讨论(toln)(toln)： 色谱分离色谱分离(fnl)中的四种情况的讨论：中的四种情况的讨论： 柱效较高，柱效较高，K(分配系数分配系数)较大较大(jio d),完全分离；完全分离； K不是很大，柱效较高，峰较窄，基本上完全分离；不是很大，柱效较高，峰较窄，基本上完全分离；柱效较低，柱效较低，K较大较大(jio d),但分离的不好；但分离的不好； K小，柱效低

55、，分离效果更差。小，柱效低，分离效果更差。第159页/共236页第一百五十九页，共236页。分离(fnl)度的表达式：R=0.8：两峰的分离程度可达：两峰的分离程度可达89%；R=1：分离程度：分离程度98%；R=1.5：达：达99.7%（相邻（相邻(xin ln)两峰完全分离的标准）。两峰完全分离的标准）。21)1()2()(2WWttRRR第160页/共236页第一百六十页，共236页。令令W2=W1=W（相邻两峰的峰底宽近似相等（相邻两峰的峰底宽近似相等(xingdng)），引入相对保留值和塔板数，可），引入相对保留值和塔板数，可导出下式：导出下式：akknR1141aa第161页/共2

56、36页第一百六十一页，共236页。1. 分离分离(fnl)度与柱效的关系度与柱效的关系nR 因为 Rn所以HnLn1或已知RnHL，或所以nR 因为HRLR1或2121221)(LLnnRR第162页/共236页第一百六十二页，共236页。2 分离(fnl)度与容量比的关系（容量因子） kkR100RkRkkk，1，峰扩张，的影响对时RtRk变慢时，Rkk10改变改变k 的方法的方法:改变柱温和改变柱温和(wnh)相比相比第163页/共236页第一百六十三页，共236页。3 分离度与柱选择(xunz)性的关系（选择(xunz)因子） aa1R因为R，所以aaa1，无法分离01Ra的影响都很大微

57、小变化对Ra一倍R2 . 11 . 1a增大的最有效方法是选择合适(hsh)的固定液。第164页/共236页第一百六十四页，共236页。第165页/共236页第一百六十五页，共236页。221R16）（有效aan有效）（HL221R16aa已知任何已知任何(rnh)两项，可求第两项，可求第三项三项4. 分离分离(fnl)度、柱效和选择性参数关系度、柱效和选择性参数关系第166页/共236页第一百六十六页，共236页。有效n .)1(2kkn)1(41aa有效nR第167页/共236页第一百六十七页，共236页。于折光率检测器，要求选择与组分折光率有较大差别的溶剂作流动相，以达到最高灵敏度。第1

58、68页/共236页第一百六十八页，共236页。4）高纯度。 否则基线不稳或产生杂峰，同时可使截止波长增加；5）低的粘度。 若使用高粘度溶剂，势必(shb)增高压力，不利于分离。常用的低粘度溶剂有丙酮、甲醇和乙腈等；但粘度过低的溶剂也不宜采用，例如戊烷和乙醚等，它们容易在色谱柱或检测器内形成气泡，影响分离。第169页/共236页第一百六十九页，共236页。 （一）流动相对分离的影响(yngxing) n由色谱柱（固定相）性能决定， 主要受溶剂种类的影响(yngxing)， k受溶剂配比的影响(yngxing)。 2211-4nkkR第170页/共236页第一百七十页，共236页。 （二）流动相的

59、强度和选择性 溶剂的极性（强度） 正相色谱：溶剂极性越强，洗脱能力(nngl)(nngl)越强 反相色谱：极性弱的溶剂洗脱能力(nngl)(nngl)强 溶剂的选择性 不同种类的溶剂，分子间的作用力不同，故选择性不同 混合溶剂（二元或多元流动相）第171页/共236页第一百七十一页，共236页。（一）高效液相色谱(s p)中的速率理论 van Deemter方程 ： H = A + B / u + C u1.涡流扩散项 A 2dp A与填充物的平均直径dp的大小和填充不规则因子有关三、分离(fnl)条件的选择第172页/共236页第一百七十二页，共236页。2.纵向扩散项 B / u纵向扩散项

60、系数为 B = 2 Dm 式中： 弯曲因子， Dm组分在流动相中的扩散系数Dm与流动相的粘度（）成反比，与温度成正比。由于(yuy)液体的粘度比气体大得多（约102倍），且在常温下操作，因此组分在液相中的扩散系数只有气体中的1/105，故在液相色谱中B可以忽略。第173页/共236页第一百七十三页，共236页。 3 传质阻抗 由三个系数组成(z chn)： C Cs CmCsm Cs固定相传质阻抗 Cm流动相传质阻抗 Csm静态流动相传质阻抗 第174页/共236页第一百七十四页，共236页。 GC中，固定液的传质(chun zh)阻抗起决定作用， CCs。而HPLC中， “固定液”是键合在载

61、体表面固定液官能团的单分子层，厚度df可以忽略。因此，Cs可以忽略。sfssDdC2（1）固定相传(xingchun)质阻抗第175页/共236页第一百七十五页，共236页。（2）流动相传质阻抗Cm 由于在流路中心的流动相中的组分分子还来不及扩散进入流动相和固定相界面，就被流动相带走，因此总是比靠近填料颗粒与固定相达到分配(fnpi)平衡得分子移动得快些，从而使色谱峰变宽。 Cm与固定相颗粒粒度dp得平方成正比，与组分分子在流动相中得扩散系数成反比。m是由柱和填充的性质决定(judng)的因子第176页/共236页第一百七十六页，共236页。（3）静态(jngti)流动相传质阻抗Csm 由于固

62、定相的多孔性，使部分流动相滞留在固定相微孔内。流动相要与固定相进行质量交换，必须先扩散到微孔内。如果固定相的微孔多，且又深又小，传质阻抗就大，使峰展宽就严重。 Csm固定相颗粒粒度dp得平方成正比，与组分分子在流动相中得扩散系数成反比。 sm与颗粒微孔中被流动(lidng)相所占据部分的分数及容量因子有关。第177页/共236页第一百七十七页，共236页。第178页/共236页第一百七十八页，共236页。H=A+Cmu+Csmu 原因：化学键合相，液体流动相, 结果(ji gu)：HPLC的实验条件应该是：小粒度、均匀的球形化学键合相；低粘度流动相，流速不宜过快；柱温适当。 HPLC中的速率(

63、sl)理论第179页/共236页第一百七十九页，共236页。1. 固定相：极性键合相氰基键合相：分离含双键(shun jin)的化合物氨基键合相：分离多官能团化学物如甾体、强心苷、糖类等2. 流动相：烷烃+极性调节剂如正己烷+异丙醚（二）正相键合相色谱法的分离(fnl)条件第180页/共236页第一百八十页，共236页。（三）反相键合相色谱法的分离(fnl)条件1. 固定相：非极性键合相短链烷基键合相：分离极性化合物苯基键合相：分离芳香化合物和多羟基化合物ODS：分离各种类型的化合物2. 流动相：水+极性调节剂+抑制剂极性调节剂：甲醇(ji chn)、乙腈抑制剂：弱酸（HAc）、弱碱（NH3）

64、、缓冲液（磷酸盐、醋酸盐）第181页/共236页第一百八十一页，共236页。（四）反相离子对色谱法的分离(fnl)条件1. 固定相：非极性键合相选用表面覆盖度高的键合相：C8、C182. 流动相：极性溶剂(rngj)+离子对试剂离子对试剂：季铵盐：分析酸类或带负电的物质烷基磺酸盐（硫酸盐）：分析碱类或带正电荷的物质流动相pH：使试样组分与离子对试剂全部离子化有机溶剂(rngj)：被测组分或离子对试剂的疏水性越强，需有机溶剂(rngj)的比例越高。第182页/共236页第一百八十二页，共236页。第四节 高效液相色谱分析方法(fngf)一、定性分析方法(fngf) HPLC的定性方法(fngf)

65、与GC相似，可分为色谱鉴定法及非色谱鉴定法两类。 1色谱鉴定法 保留时间或相对保留时间对照。 2化学鉴定法 分离后收集组分定性。 第183页/共236页第一百八十三页，共236页。3 3两谱联用鉴定法两谱联用鉴定法 （1 1）两谱联用法：用）两谱联用法：用 HPLC HPLC制备纯组分，用光制备纯组分，用光谱仪器鉴定。谱仪器鉴定。 （2 2）两谱联用仪：能同时获得定性）两谱联用仪：能同时获得定性(dng (dng xng)xng)、定量信息。如、定量信息。如HPLCHPLCUVUV、HPLCHPLCFTIRFTIR及及 HPLCHPLCMSMS等。等。 第184页/共236页第一百八十四页，共

66、236页。 二、定量分析方法二、定量分析方法 液相色谱法的定量方法与气相色谱法相液相色谱法的定量方法与气相色谱法相同，常用外标法及内标对比法等进行定量分同，常用外标法及内标对比法等进行定量分析。析。1 1外标法外标法 以待测组分的纯品作对照物质，以待测组分的纯品作对照物质，对比求算试样含量的方法称为外标法。对比求算试样含量的方法称为外标法。 可分为外标工作曲线可分为外标工作曲线(qxin)(qxin)法、外法、外标一点法及外标二点法等。标一点法及外标二点法等。2 2内标法内标法 分为工作曲线分为工作曲线(qxin)(qxin)法、内法、内标一点法、内标二点法、内标对比法及校正标一点法、内标二点法、内标对比法及校正因子法等，在因子法等，在HPLCHPLC中最常用内标对比法。中最常用内标对比法。 第185页/共236页第一百八十五页，共236页。1 1、相对、相对(xingdu)(xingdu)分子量分子量分子量分子量20002000，凝胶色谱，凝胶色谱(s p)(s p)柱柱分子量分子量20002000，但同时，但同时(tngsh)(tngsh)分子量相差分子量相差10%10%，凝胶色谱