生物工程大实验基因工程实验内容

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1、生物工程大实验基因工程生物工程大实验项目一览表序号实验名称实验项目名称实验类型实验要求学时每组人数1酶工程实验淀粉酶产生菌的筛选及菌株鉴定综合性必做83淀粉酶的提取设计性必做43淀粉酶固定化及其性质测定综合性必做632基因工程实验 PCR技术扩增产淀粉酶的细菌16SrDNA设计性必做63DNA重组与转化综合性必做63外源基因在大肠杆菌细胞中的表达综合性必做633发酵工程实验微生物生长曲线的测定设计性必做33淀粉酶产生菌发酵条件的优化设计性选做83果酒酵母的流加培养与分批培养综合性选做83果酒的酿造综合性必做73生物工程大实验基因工程教案实验一 PCR技术扩增产淀粉酶的细菌16SrDNA序列一、

2、 实验目的和内容目的.学习PCR 扩增细菌16SrDNA序列方法掌握PCR基本操作技术，以及琼脂糖凝胶电泳技术内容：1）细菌基因组DNA的提取 2）16S rDNA 序列pcr扩增 3）琼脂糖凝胶电泳二、实验原理1985年美国Cetus公司的Kary Mullis等人设计并研究成功的一种体外核酸扩增技术(polymerase chain reaction PCR),这是一种类似于DNA的天然复制过程，以待增的DNA为模板，在体外由引物介导的酶促合成特异DNA片段的方法。将目的基因DNA在高温（94）下解链成为单链模板;人工合成的一对与目的基因两侧序列相互补的寡聚核苷酸引物在低温（30-60）下

3、分别与变性的目的的基因片段两侧的两条链的部分序列互补结合；在中等温度（65-75）下由耐热DNA聚合酶（Taq酶）将dNTP中的脱氧单核苷酸加到引物3-OH末端，并以此为起点，沿着模板以5 3方向延伸，合成一条新的互补链。新合成的DNA链的起点是加入的引物在模板DNA链两端的退火位点决定的。图2-1-1PCR的原理由于PCR反应中，双链DNA高温变性成单链，引物与模板单链DNA低温退火（配对）适温下引物延伸三个步骤反复循环，每一循环所形成的DNA分子均能成为下一循环的模板，所以PCR的特定靶DNA产物以指数方式递增，在数小时内，经过30个循环后，理论上可使DNA扩增至109倍。原来对单拷贝基因

4、进行探测 和分析时需用10ul基因组DNA，现在可以减少到ng水平。1、设汁和选择高效而特异性强的引物是PCR成败关键。引物（primer)是指两段与待扩增靶DNA序列侧翼片段具有互补碱基特异性的的寡核苷酸(单链DNA片段)。引物包括引物1和引物2两种。引物1是5端与正义链互补的寡核菅酸，用于扩增编码链或mRNA链；引物2是3端与反义链互补的寡核苷酸，用于扩增DNA模板涟或反密码链。当两段引物与变性双链DNA的两条单链DNA模板退火后，两引物的5端iJ决定了扩增产物的两个末端位置，而扩增的片段长度等于两个引物间的序列片段长度。引物的长度大约为20-30个寡核苷酸，一般可以用DNA合成仪合成。根

5、据统计学计算，长约17个碱基的寡核营酸序列在人的基因组DNA(3109bp)中可能出现的概率为1次，因此只要引物不少于16个孩苷酸，即能保证PCR扩增的序列特异性。如果引物过短，会产生非特异性结合，而过长会造成浪费。计引物的原则：引物应是DNA序列的一段高度保守区，即与引物结合的靶DNA序列片段必须是已知的，与两个引物结合的两个片段之问的靶DNA序列则未必清楚。引物3端的保守性很重要，尽量要求使用非简并性密码或简并性较低的密码，如尽量不要选择具有六个密码子的氨基酸。每条引物内部应避免具有明显的二级结构(发夹结构)。所谓发夹结构是指发夹柄至少含有4个碱基配对，而发夹环至少有3个碱基，这种结构尤其

6、避免在引物的3端出现。如3GATCTGATGC A T G G 5CTAGACTACG C C A尽可能选择碱基随机分布的序列，即避免具有多聚嘌呤、多聚嘧碇或其他异常序列。引物中G+C碱基含量以40一60为佳。两个引物之间不应有互补序列，尤其是在引物的3末端的互补碱基。不能多于5个，否则会引起“引物间二聚体，一旦形成二聚体，则引物序列就不能很好地与模板结合，从而妨碍PCR扩增。根据实验需要可以在引物的5端引入适当限制酶切位点，以便PCR产物的亚克隆即进入载体分子中。此外在限制酶切位点的5前面还要添加限制酶的保护碱基24个。如一16SRDNA基因的两端序列为：5-CA GTT ATG CGC A

7、AA TTT AAT AAA -AGC GCC GGC GTT CAA TAA TCG-3上游引物:5-GCGGATCCCAGTTATGCGCAAATT-3 24 base GC=50% (BamHI)下游引物：5GCGAAGCTTGATTATTGAACGCCGG-3 25 base GC=50.5% (HindIII)（SalI）此外设计的引物还有简并引物和嵌套引物简并引物是一类由多种寡核苷酸组成的混合物，彼此之间仅有一个或数个核苷酸的差异。如果PCR扩增引物的核苷酸组成顺序是根据氮基酸顺序推测而来，就需要合成简并引物(见附录)。 如 G K P T I A5一GGN AARCCNACNAT

8、MGCN一3，嵌套引物(nested primers)是为了尽可能减少非靶序列的扩增而设计的。其具体的操作程序是，利用第一轮PCR扩增产物作为第二轮PCR扩增的起始材料(DNA)，同时除使用第一轮的一对特异引物(SPl和APl)之外，另加两个同模板DNA结合位点处在头两引物之间的新引物(，SP2和AP2)。在第二轮扩增产物中，含有能够同这一组多引物杂交的错误扩增产物的可能性是极低的，所以应用嵌套引物技术能够使靶DNA序列得到有效的选择性扩增。2、循环参数：RCR扩增是由变性、退火（复性）和延伸三个步反复循环实现的，其中每一步骤的温度、时间以及循环次数等参数是非常重要的。变性（denaturat

9、ion）：模板DNA变性即双链温度和控制是非常重要的，变性是高温短时。一般为94、30秒-1分钟。对GC含量高的靶DNA序列，宜用较高的变性温度，若变性不充分，会影响PCR产物产量，反之过度变性（温度过高、时间过长）会中愉酶的失活。止前PCR都加入一个94、5分钟预变性反应。退火（annealing）:其温度和时间取决于引物和长度、碱基组成及在反应体系中的浓度，一般退火温度低于扩增的融解温度（melting temperature,Tm）5。如GC含量约50%长20个碱基引物，其退火温度为50。Tm=4（G+C）+2X（A+T）+35-2n n引物的长度旨物的寡核甘酸长度为16-35碱基，其中

10、的G+C含量在35%以上，此方法计算的Tm值适合于70以下的情况。两个引物的Tm有差别时，则根据Tm低的一方引物Tm值设定退火温度。延伸（extension）:其温度取决于DNA聚合酶的最适温度，一般用TaqDNA聚合酶常用72（70-75）且1分钟延伸中足以完成2kb的序列。1kb碱基序列则延伸时间1分钟足够。延伸步骤的时间取决于靶序列的长度、浓度和延伸温度，靶序列越长、浓度越高、延伸温度越低，则所需的延伸时间越长，反之所需要时间则短。循环次数（cycle）：一般为30个（25-40个）周期，如果循环次数过高（超过40次以上）会增加非特异性产物的量及复杂度。此外PCR扩增时，反应物上面要加一

11、层石蜡油，以减少PCR反应过程中的液体蒸发，有利于维持反应体系的热稳定和盐浓度。PCR反应中的Taq DNA聚合酶最初是由H.A.Erlich于1986年从一种生活温度高达75的热泉中的细菌，即栖热水生菌(Thermus aquaticus)中分离纯化出来的。在补加有四种脱氧核苷三磷酸(dNTP)的反应体系中，Tap砌酶能以高温变性的靶DNA分离出的单链DNA为模块板从分别结合在扩增区段两端的引物为起点，按53方向合成新生互补链DNA。利用Taq酶扩增DNA片段的缺陷是产物易产生序列错误。PCR技术特点是灵敏、简单、快速及特异性强，且对样品纯度无特殊要求，已广泛用于基因克隆，基因诊断，DNA序

12、列多型性分析、构建cDNA文库基因体外操作和基因分析。三、实验试剂1、模板DNA，如染色体DNA（见实验1-1）或质粒DNA（见实验4-1）2、引物3、Taq酶、10缓冲液、MgCl2、Dntp mixture、重蒸水、石蜡油4、DNA标准marker、进口琼脂糖（argarose）5、TE缓冲液：10mmol/L Tris-Cl (pH8.0)、1mmol/L EDTA6、6上样缓冲液：0.25%溴酚蓝（bromophencl blue,BPB）、40%蔗糖、10mmol/L EDTA(pH8.0) 4保存7、氯仿/异戊醇：按氯仿：异戊醇=24：1（v/v）的比例加入异戊醇。8、酚/氯仿/异

13、戊醇（PCI）：按酚与氯仿/异戊醇=1：1的比例混合饿酚氯仿，即得酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）9、3mol/L的NaAc(PH5.2)10、 预冷的无水乙醇、预冷70%乙醇0.2 ml eppendorf 管、微量移液器、吸头、制冷机动车辆、冰盒、PCR扩增仪、低温离心机、微波炉、电泳槽、电泳仪、手提紫外灯。四、实验方法（一）细菌基因DNA的提取参见实验书P87采用SDS法提取。（一）、SDS提取法 1） 将50 毫升新鲜的菌液中混匀取1。5毫升到离心管离心8000转/分钟,5分钟。弃上清。2） 用TE PH 8.0溶液,1.5ML洗涤菌体1次，8000,5分钟（10：1（v /w）体积

14、），弃上清3） 0.4毫升TE溶液 重悬菌体； 4）加入20 SDS，0.6毫升溶液至终浓度10，充分混匀后55 水浴2 h，每隔20min 振荡摇匀； 5）加入等体积的Tris饱和酚：氯仿：异戊醇（25：24：1，体积比v/v/v），0.6毫升，振荡10 min 后12000 rpm 离心10 min，上清保留； 6）重复步骤,4，直至有机相和水相之间没有明显的蛋白为止； 取时不要中间浑浊的白色物上清保留7）加入等体积的氯仿（与你吸过来的上清一致体积），振荡10 min 后12000 rpm 离心10 min；上清保留8）上清加入2 倍体积（与你吸过来的上清一致体积）冰预冷的无水乙醇和1/5

15、体积的3Mol/L 的醋酸钠PH5.2，用玻璃棒将DNA 卷出； ( 如果这一步骤看的不是很明确，放在-20度冰箱放20分钟，实在量很少的就离心12000 rpm 离心10 min；取沉淀)9）用冰预冷的70 乙醇洗涤DNA 丝，风干后，用100微升TE 溶解DNA；获得细菌总DNA,放在-20度冰箱保存。10）0.7% 琼脂糖电泳检测DNA （二）PCR扩增DNA1、取一个0.2ml eppendorf 管，在基中添加以下各种成分反应液反应液：ddH2O 33ul 模板DNA 2.55ul(100-200ng)*1 上游引物（10umol/L） 2.5ul 下游引物（10umol/L） 2.

16、5ul 10倍缓冲液 5ul MgCl2(25mmol/L) 3ul dNTPmixture(10mmol/L) 1.5ul(各20nmol) Taq酶（5U/ul） 0.25ul(2.5U)总体积50ul2、稍作离心（如果是利用非盖子加热型的PCR仪器添加20ul石蜡油于反应管中，防止样品水分的蒸发）。3、将反应管放入 PCR仪中，按下列条件设计好程序，进行PCR反应。4、反应在程序： 94条件下使模板DNA变性5min.变性 94 1min30cycles退火 55 1min延伸 72 1.5min 最后在72条件进行延伸7-10min。5、反应结束（大约3.5小时）后*2，取5ul反应液

17、用0.8% 琼脂糖凝胶进行电泳（用标准做marker）,鉴定PCR产物是否存在以及大小。*36、电泳确认后，吸弃反应管中的石蜡油，将下层液移至新的eppendorf管中。7、加入200ulTE缓冲液，加入300ul酚/氯仿/异戊醇，上下颠倒混匀，室温条年下12000rpm离心5分钟。8、将上层水液转移到新的eppendorf管中，然后添加1/10体积（约10ul）的3mol/L的NaAc(Ph5.2)和2.5倍体积（约0.75ml）的冰冷无水乙醇。*49、-20冰箱中放置30min以上。*510、4条件下、1200rpm离心15min.11、弃上清，添加ml的冰冷70%乙醇。12、4、1200

18、0rpm离心5min。13、弃去上清，将eppendorf管置于吸水纸上，室温干燥约10分钟。14、30ulTE液溶解沉淀，电泳确认回收到PCR产物后，置于-20备用。（三）琼脂糖凝胶电泳1用胶带将洗净、干燥的制胶板的两端封好，水平放置在工作台上；2调整好梳子的高度；3称取0.24 g琼脂糖于30 ml 0.5TBE中，在微波炉中使琼脂糖颗粒完全溶解，冷却至45-50C时倒入制胶板中；4凝胶凝固后，小心拔去梳子，撕下胶带；5将电泳样品与溴酚蓝混合后将样品依次点入加样孔中；pUC18 5l + ddH2O 3l + 溴酚蓝2l 共10l于0.5ml tube中混合后点样；6将制胶板放入电泳槽中，

19、加入电泳液，打开电泳仪，使核酸样品向正极泳动；7电泳完成后切断电源，取出凝胶，放入0.5g/ml的溴化乙锭（EB）溶液中染色1015 min，清水漂洗后置于紫外透射仪上观察电泳结果，并照相记录。五、附注五、注意事项1、设计的引物可以委托公司去合成。合成后拿到的引物DNA是粉末状附在离心管中。所以拿到引物后，须先离心后再开启，以免分扬损失。然后加入适量的无菌ddH2O。一般1OD引物干粉的质量相当于33ug ,每个引物的分子量计算公式：MW=(#A313.21)+(#G329.21)+(#C289.18)+（T304.20）-61.96(#A即碱基A的个数，其余类推)。也可按单个核苷酸的平均分子

20、量法近似计算MW=碱基个数324.5。所以合成引物的微摩尔数（umol）=OD值33ug/碱基数324.5。如拿到一管1OD的24个碱基的引物，即33/24324.50.0042umol=4.2nmol,所以只要加入420ul的ddH2O充分溶解就可以获得10umol/L浓度的引物。2、PCR反应的灵敏度很高，为了防止污染，使用的0.2ml的eppendorf管和tip都必须是新的、无污染的，实验操作需戴上手套。3、使用工具酶的操作必须在冰浴条件下进行，使用后剩余的工具酶应立即放回冰箱中。4、注意工具酶的加样次序为：水、缓冲液、DNA，最后加酶，如将酶直接加入到10倍浓缩缓冲液中，会引起酶的严

21、重失活。5、实验操作务必小心，如弃上清时注意不要将沉淀一同弃去。6、经酚/氨仿/异戊醇抽提提后，吸取上清液时别把中间的白色层吸入，其中含有蛋白质等杂质。7、引物的使用浓度一般为10-50pmol,浓度过高易形成引物二聚体或会增加非特异性产物；过低则影响效率。六、结果与分析评议经PCR扩增，产淀粉酶的细菌16SrDNA分子量接近1600bp,成功。*1、PCR反应的DNA模板量为10ng-1ug*2、此样品可暂时放在4冰箱中保存。*3、此步聚的具体操作见实验2-2的DNA电泳*4、沉淀DNA时加入盐类的目的是中和链上的电荷，使DNA易于形成沉淀。*5、-20冰箱中放置过夜沉淀效果更好。6、在反应

22、体系中添加试剂、样品，须根据它们的实际浓度及时调整添加试剂的体积量。实验二 重组DNA和转化【实验目的】掌握重组DNA和转化的技术一、实验原理由于外源基因与载体构成的重组DNA分子性质不同、宿主细胞的不同，将重组子导入宿主细胞的具体方法也不相同。植物和动物细胞的外源DNA导入完整细胞通常采用相应的病毒感染方法，细菌细胞的转化方法是基于物理学和生物学原理建立起来的。重组DNA导入的受体细胞有原核和真核两类。前者包括大肠杆菌、枯草杆菌等：后者包括酵母、哺乳动物细胞、昆虫细胞等。用原核细胞作受体，既可作为基因文库(由克隆载体组建)的复制、扩增场所，也可作为外源基因的表达系统。而真核细胞受体，一般仅作

23、为基因的表达系统之用。下面主要介绍大肠杆菌转化方法：(1)化学转化法：利用CaCl2处理感受态受体细胞，然后通过热休克(heat shock)处理，即置于42。C高温热激90秒，热休克后，需使受体菌在不含抗菌素的培养液中生长至少半小时以上，使其表达足够的蛋白，以便能在含抗菌素的平板上生长菌落。此外利用PEG也能促使转化。(2)电穿孔法(electroporation)：对预先制备好的感受态细胞施加短暂、高压的电流脉冲，在受体细胞质膜上形成nm大小的微孔，使外灏DNA能直接通过微孔，或作为微孔闭合时所伴随发生的膜组分重新分布而进入细胞质中。对于大肠杆菌来说，大约50微升的细菌与DNA样品混合，置

24、于装有电极的槽内，选用大约25kV和200欧的电场强度处理46ms，即可获得理想的转化效率。重组DNA转化率较低，般在0.l以下，转化率的高低对于一般重组克隆实验关系不大，但在构建基因文库时，保持较高的转化效率至关重要。影响转化率的因素很多：受体细胞方面，除了具备限制、重组缺陷型性外，还应与所转化的载体DNA性质相匹配，如pBR322转化大肠杆菌Jm83株，其转化率不高于1O3/ugDNA;但若转化ED8767株，则可获得106/ugDNA的转化率。载体DNA及重组DNA方面，载体本身的性质决定了转化的高低，不同的载体DNA转化同一受体细胞，其转化效率明显不同，载体的空间构象对转化率也有明显影

25、响，超螺旋结构的载体质粒往往具有较高的转化率，经体外酶切连接操作后的载体DNA或重组DNA由于空间难以恢复，其转化率一般要比具有超螺旋结构的质粒低两个数量级。对于以质粒为载体的重组分子而言，分子量大的转化效率低。到目前为止，大于30kb的重组质粒很难进行转化。此外重组DNA的构型与转化效率有关，在宿主细胞中，环状重组DNA分子不易为宿主核酶酶水解，较相同分子量的线状重组DNA稳定性高，环状重组质粒转化率较分子量相同的线性重组质粒高10-100倍。因此重组DNA大都构成环状双螺旋分子：操作方面，受体细胞的预处理或感受态宿主细胞的制备对转化率影响较大。一般未经特殊处理的培养细胞对重组DNA分子不敏

26、感，难以转化成功。转化率与外源基因踞宿主染色体DNA同源性有关，外源基因来源与宿主亲缘关系越近，越易整合到宿主染色体中，转化率越高，否则易为宿主核酸酶所降解，降低转化率。因此选择宿主时须考虑外源性基因的光源。转化体系中重组DNA浓度与纯度对转化率也有一定影响，在一定的浓度范围内，浓度越高，转化率越高，重组DNA纯度越高，转化率越高。二、实验试剂1、X-gel:2%母液（用二甲基甲酰配置，-20备用）工作浓度40ul平板20ml2、IPTG：100mmol/L母液（-20备用），工作浓度40ul平板20ml3、抗生素、氯苄青霉素（ampicillin）母液100mg/ml,工作浓度100ug/m

27、l卡那霉素（kanamycin）：母液50mg/ml,工作浓度50ug/ml4、LB液体培养基：1%蛋白胨、0.5%酵母粉、1% NaC15、含抗生素的LB固体培养基制备平板6、感受态细胞（实验5-1）7、连接产物（实验4-3）三、实验用具超净工作台、离心机、42恒温水浴锅、小试管、牙签、37培养箱、培养皿、电泳仪器、制冰机、冰盒、eppendorf管、微量移液器、吸头。四、实验方法1、制备含有适当抗生素LB培养基平板。2、取一管100ul的感受态细胞（如果是冰冻保存的则需要在冰上化冻后，进行操作）加入重组质粒（质粒与目的基因）的连接产物5ul（不要超过10ul）轻轻用枪吹打均匀（不可以用Vo

28、rtex）。3、冰浴20min。4、然后42、保温90秒钟（或37、保温5min）迅速放入冰中，冰浴3-5min。5、添加1ml的LB培养基，使细胞恢复正常生长状态。6、37振荡培养1小时（160-225rpm）7、3000rm离心5分钟。8、弃去1ml上清，余下全部样品（约0.1ml）用枪轻轻吹匀，吸至含有Amp抗生素的LB培养基平板上，另添加20ul的20mg/mlX-gal和40ul的100mmol/L IPTG，均匀涂布。9、正面放置37培养箱中30min后，倒置培养8-12小时。五、注意事项1、进行转化时的质粒DNA量应是感受态细胞总量的110以下。2、IPTG须用二甲基甲酰胺或二甲

29、基亚砜(DMSO)配置，且须用锡纸封裹以防受光照而被破坏，并应存放在-20冰箱中。3、IPTG是针对具有lacIq基因型的大肠杆菌诱导表达lacZ而添加的，而对于不具有lacIq的菌株则没有添加的必要。因为lacIq是lacI的突变型，能产生大量阻遏蛋白，抑制lac基因的转录。4、倒平板的培养基用量一般是每个培养皿20ml左右。5、对需显色反应的筛选培养基还需要将平板放于4冰箱中3-4小时，使显色反应充分，兰色菌落更明显。六、结果与评议PEG法制各的感受态细胞的转化：l、在PEG法制备的100“I感受态细胞中加入O1ug质粒，冰浴条件下静止20min。2、加入830ul的TSB、50u1 DM

30、SO以及20uI的lmol/L葡萄糖。3、37的摇床培养1小时。4、取100ul在含有适当抗生素(质粒所带有的标记抗生素)的LB培养基平板上涂布。5、剩余900u1离心后，浓缩为大约100ul菌液，涂布于同样的平板上。6、将平板置于37培养箱中培养一晚。试剂：1、TSB: LB培养基（pH6.5）、10%PEG（6000）、10mmol/L MgC12、10mmol/LmgSO4、5% DMSO（DMSO使用时添加）,4下保存。2、DMSO（二甲基亚砜）3、1mol/L葡萄糖实验三 外源基因在大肠杆菌中的诱导表达和检测【实验目的】1了解外源基因在原核细胞中表达的特点和方法【实验原理】将外源基因

31、克隆在含有lac 启动子的表达载体中，让其在Ecoli 如中表达。先让宿主菌生长，lacI 产生的阻遏蛋白与lac操纵基因结合，从而不能进行外源基因的转录及表达，此时宿主菌正常生长。然后向培养基中加入lac 操纵子的诱导物IPTG(异丙基硫代-D-半乳糖)，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，则DNA 外源基因大量转录并高效表达。表达的蛋白可经SDS-PAGE检测：蛋白质在加热变性以后与SDS（十二烷基磺酸钠）结合，带上负电荷，在电场的作用下，向正极移动，结果按分子量大小排列在胶板上，含量多的蛋白带纹粗。亦可经Western杂交印迹检测(实验五十五)。【实验操作】（一）外源基因在大肠杆菌中的诱导表达1

32、. 含外源基因的表达菌株在LB(含50 g/mL Amp)培养基中预培养过夜(操作注意无菌)。 2. 100 mL TM 培养基加入100L 50mg/mL Amp，使终浓度达50g/mL 。按1/50-1/100 比例加入过夜培养的上述LB 培养液。 3. 于37C恒温摇床，250r/min，培养3 h左右，使其OD600值达0.7-0.8（此OD值可视预实验而定，此为经验值）。 4. 加入50L 1 mol/L IPTG，终浓度达0.5 mmol/L，进行外源基因的诱导表达。 5. 于37C恒温摇床，250r/min，继续培养4-5 h（培养时间也要视蛋白表达情况而定）。 6. 4低温离心

33、，4 000 r/min，20 min，收获菌体，弃上清。菌体放-20存放备用。 （二）SDS-PAGE1. 将表达后的菌体与2上样缓冲液按1：1混匀于微量离心管中。2. 用超声波破碎仪脉冲10次，每次10秒。中间间隔时放入冰中降温。3. 将上述微量离心管插入水漂中，放在电磁炉锅里的沸水中煮35min。然后立即插入冰中。（可在-20C冰柜中保存）。4. 按照教师的演示组装电泳玻璃并用细橡胶管密封底部和侧面然后用夹子夹住。插入梳子后在玻璃上距离梳子齿底部1cm的地方做一个标记。5. 配制10%分离胶。按顺序和量取下列溶液混在一个50mL的小烧杯中：Acrylamide-bis 3.96 mL 1

34、M Tris PH8.8 4.38 mL dd Water 3.432 mL 10% SDS 118.8 mL TEMED 9.9 mL10%APS 118.8 mL6. 加完APS后拿起烧杯轻轻转动几下底部将溶液混匀后，立刻缓缓倒入玻璃夹缝中，直到液面与所作的标记齐平。剩下的胶液留在小烧杯中，倾斜放置。然后在上部用1000ml微量移液器轻轻地沿玻璃壁来回移动加满双蒸水（尽可能不破坏下面的胶液）。静置30min。直到烧杯中剩余的溶液凝固。倒出蒸馏水，并倒置玻璃尽可能将水倒尽。7. 配浓缩胶：按顺序和量取下列溶液混在一个50mL的小烧杯中：Acrylamide-bis 0.675 mL0.5MT

35、ris pH6.8 0.563 mLdd water 3.165 mL10% SDS 45 mLTEMED 7.5 mL10% APS 45 mL8. 加完APS后拿起烧杯轻轻转动几下底部将溶液混匀后，立刻倒入玻璃夹缝中，液面与玻璃上边缘齐平。然后再慢慢插入梳子，静置约20min。烧杯中剩下的溶液倾斜放置直到溶液凝固。9. 小心拔出梳子以后，用注射器针头（剪平尖部）吸取梳子齿形成的加样槽中的水，并修平加样槽底部的胶面。10. 选取几个形态好的加样槽，在一张纸上做好对应的标记，用微量移液器在侧面的一个加样槽中加入20mL 蛋白分子量，其它槽中加入1020mL自己制作的样品。11. 加完样品后，再

36、用微量移液器吸取电泳缓冲液小心把加样槽液面都补平。电泳槽上部倒满电泳缓冲液，电泳槽的下部倒入一半电泳缓冲液（约180ml）。 12. 接好电极，将电流调至10mA，待溴酚蓝移到分离胶后，在将电流调至18mA，电泳约23h，期间随时观察电泳槽上部的液体是否有泄漏。当溴酚蓝移到玻璃距底部0.5cm时切断电源。13. 在一个搪瓷盘里准备适量的考马斯亮蓝染色液。14. 倒掉电泳槽中的缓冲液，取下玻璃，把分离胶从玻璃上剥离倒染液搪瓷盘里。15. 染色2h后，将染液倒回瓶子里以备重复使用。把胶移入脱色液，过夜。16. 观察脱色后胶里的蓝色带纹，与对照比较或寻找异常粗的带纹，并比较其分子量，判断是否是预期的

37、基因产物。【注意事项】1. 转化后的大肠杆菌必须在含有适当抗生素的LB平板上进行培养 2. 丙烯酰胺单体和交联剂N，N亚甲基双丙烯酰胺有神经毒性，在称量和配制时要带一次性手套，称量时最好也戴上口罩。 3. 凝固后一般不再有毒性，但考虑到存在没有完全交连的分子，实验结束后不宜直接用手拿取，要先用清水漂洗5-10分钟。 4. 室温较低时胶液不易凝固，可以在槽中加37温水。 5. SDS很容易漂浮在空气中而吸入体内，称量时最好在通风橱中进行，或戴上口罩。 【思考题】1. LB培养基中加入抗生素的目的是什么？ 提示筛选的作用，2. 原核表达蛋白的原理是什么？提示答案要点：将外源基因克隆在含有lac 启动子的表达载体中，让其在Ecoli 如中表达。先让宿主菌生长，lacI 产生的阻遏蛋白与lac操纵基因结合，从而不能进行外源基因的转录及表达，此时宿主菌正常生长。然后向培养基中加入lac 操纵子的诱导物IPTG(异丙基硫代-D-半乳糖)，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，则DNA 外源基因大量转录并高效表达。