基因工程总结

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1、主要内容:第一章 基因操作的基本技术 核酸制备；质粒及质粒载体；细菌的转化；凝胶电泳；核酸探针；限制性内切酶、酶切图谱及分子克隆用酶第二章 PCR技术第三章 核酸分析与合成第四章 噬菌体载体及粘粒第五章 目的基因的准备和重组及重组子的鉴定第六章 基因在原核及真核体系中的表达 真核基因在大肠杆菌中的表达；哺乳动物基因工程；研究DNA与蛋白质相互作用的方法第七章 植物基因工程第八章 基因工程研究进展 人类基因组计划；基因诊断、基因治疗和转基因；反义技术序言：1.什么是基因工程？基因工程是如何诞生的？答：在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其他载体分子中，构成遗传物质的新组合，并使之掺入到原先没有这类分

2、子的宿主细胞中，并能持续稳定的繁殖。2.基因工程的两个基本特征？答：（1）跨越天然的物种屏障（2）确定的DNA扩增3.基因工程的步骤和内容？答：酶切分离目的基因重组DNA分子转移至受体细胞增殖获得筛选目的重组子(提取目的基因供进一步研究重组目的基因功能表达)4.基因工程可以应用于哪些方面?答：(1)带来体外蛋白质化学的革命:甲型干扰素，红细胞生成素。（2）对检测技术的贡献：提供大量高纯靶，提高准确性；病原体检出（HCV HBV HIV）；遗传病诊断。（3）直接的遗传性疾病治疗和生物体改造：转基因动植物。（4）促进对生命现象本质机理的研究：胰岛素基因与糖尿病、癌基因与抗癌基因。5.什么是“安全”

3、的宿主载体体系？答：失去自我迁移能力，可以是营养缺陷性，在自然环境下无法生存。第一章 基因操作基本技术1、提取细胞总RNA的原则是什么？如何实施？为什么?答: 原则：抑制RNA酶活性实施：（1）高温：180，2小时，灭活RNase（2）二乙基焦炭酸乙酯（DEPC）,油状有毒, 是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。（3）使用对RNase有强烈乙酯作用的细胞裂解剂，如盐酸胍、异硫氰胍（裂解细胞、抑制酶活性、解聚核糖体）（4）带手套、口罩：阻断RNA酶来源，加少污染机会。（5）季节因素（温度）：RNase降解RNA温度高活性高，需要低温进行。2.如何进行总RNA制品

4、质量控制？答：1）RNA的浓度和纯度测定A260nm 1 OD=40 mg/ml RNA要求 A260nm/A280nm=2.0 (1.7-2.0或2.0) A260nm/A230nm 2.02）RNA的完整性 变性琼脂糖凝胶电泳检查 28S：18S2：13）总RNA制品的保存溶液法（TE或0.5%SDS 方便 但不稳定)悬液法（溶液加3V乙醇 可靠 但不方便） 3.染色体DNA制备的原则是什么？各有哪些主要试剂？作用？答：原则：祛除蛋白及细胞碎片，祛除RNA，保持DNA分子完整。主要试剂及作用：SDS（破坏细胞膜结构、变性蛋白质、解聚）EDTA（抑制酶活性）Proteinase K（蛋白酶消

5、化蛋白质）4.如何进行DNA样品的鉴定？答： A260nm 1 OD=50 mg/ml DNA要求 A260nm/A280nm 1.7 A260nm/A230nm 2.05. 有哪些方法可以进行DNA片段的制备？是如何进行的？答：（1）低熔点琼脂糖（羟乙基 60C-65 C熔化，结果较纯）（2）透析袋法：需要把样品浓缩，把核酸沉淀，而去掉缓冲液。（3）苯酚抽提法（4）反复冻融法：多次冻融使凝胶收到破坏，释放其中DNA，但回收率低（5）电洗脱法 （6）硝酸纤维素膜离心法（7）试剂盒6.什么是质粒？质粒有几类？答：质粒是一类亚细胞有机体，存在于细胞质中独立于染色体的遗传成分，由环状双链DNA组成的

6、复制子。分为：F质粒（致育质粒，可以通过接合，在供体和受体间传递遗传物质）R质粒（抗性质粒，带有抗性基因，可使宿主菌对某些抗菌素产生抗性）Col质粒：带有编码大肠杆菌素的基因。降解质粒：可使宿主代谢特殊分子 侵入性质粒：使宿主菌具有致病能力7.什么是质粒的转移？什么是质粒的迁移？迁移原理？答：质粒的转移：从一个细胞自我的转移到原来不存在这种质粒的另一个细胞去。质粒的迁移：由共存的接合型质粒引发非接合型质粒的转移过程。原理：当相容性的接合质粒和非接合质粒在同一细胞中，非接合质粒中mob编码的核酸酶作用其特异位点bom，使bom位点发生单链断裂而出现缺口，构象转变为缺口环状构象。当有接合性质粒中F

7、因子能够导致性须的合成，提供转移装置，则可以转移。如果没有，缺口可能还原维持两种构象的动态平衡。8.掌握质粒拷贝数的定义？质粒的复制类型？答：定义：生长在标准培养条件下，每个细菌细胞中所含有的质粒DNA分子的数目。非标准培养条件下，每个细菌细胞染色体平均具有的质粒DNA分子的数目。类型：一类是严紧型质粒，当细胞染色体复制一次时，质粒也复制一次，每个细胞内只有12个质粒；另一类是松弛型质粒，当染色体复制停止后仍然能继续复制，每一个细胞内一般有20个左右质粒。9.什么是质粒的不相容性？答：在没有选择压力的情况下，两种亲源关系密切的不同质粒不能在同一个宿主细胞中稳定存在。10.掌握用作克隆载体的基本

8、条件是什么？为什么？答：(i) 具若干限制酶单一识别位点：可提供多种选择，具有多个同一种酶切位点则可能被切碎(ii) 具有复制起点：可导入宿主细胞，也是质粒自我增值必不可少条件（iii）具有选择标记：便于筛选（iv）具有较小的分子量和较高的拷贝数：操作简单，可携带较大片段的基因，并有利于载体的稳定。11.掌握LacZ的筛选原理是什么？答：是重组子筛选的一种方法： 是根据载体的遗传特征筛选重组子，如-互补、抗生素基因等。现在使用的许多载体都带有一个大肠杆菌的DNA的短区段，其中有-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），它并

9、不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到-半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能，这种载体适用于可编码-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞。因此，宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。这样，lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为-互补。由-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。然而，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无-互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，又称为蓝白斑筛选。如用蓝白

10、斑筛选则经连接产物转化的钙化菌平板37温箱倒置培养12-16hr后，有重组质粒的细菌形成白色菌落。12、掌握以碱裂解法提取质粒主要用什么试剂？各有什么作用？几大步骤中各会发生怎样的现象？答：溶液I（溶液呈黄色悬浊液）：葡萄糖（维持渗透压，保持结构完整性、用于悬浮）、Tris（维持一定粒子强度及PH值）、EDTA（螯合金属离子，抑制DNA酶的作用）。溶液II（溶液变粘稠，流动性下降）：NaOH（高浓度，释放出的物质在强碱条件下变性形成沉淀）、SDS（去膜剂，使膜溶解，释放细胞内物质）溶液III（很多白色沉淀，流动性较好）：KAC pH4.8（中和溶液II的碱性，染色体DNA不能复性，而质粒是小分

11、子可以复性重新溶解，以此来分离染色体DNA与质粒，剩下的沉淀是细胞碎片和不能溶解的DNA）进一步：CsCl（密度梯度离心）、NaCl（密度梯度离心）、Sepharose（凝胶过滤）。14、掌握什么是感受态？什么是转化？ca2+诱导感受态的原理是什么？答：感受态：在特殊处理或正常生长的某个时期，细胞的一种敏化的可以接受外源DNA的状态。自然条件下的转化：一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株的DNA而导致性状特征发生遗传性改变的生命过程。原理：Ca2+诱导的完整细胞的转化适用于革兰氏阴性细菌（如大肠杆菌等），其原理是Ca2+与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜

12、出现空隙。15.什么是电泳？如何制备RNA变性凝胶？答：（1）蛋白质核酸等大分子在电场的作用下，在缓冲液中涌动的现象。原理：由于合算分子带负电，置于电场中的分子以一定的速度移向适当电极。迁移率（迁移速度）与电场强度和分子携带电荷成正比，与分子的摩擦系数成反比（与分子的大小、极性、介质粘度有关），从而把不同分子分开 。（2）甲酰胺凝胶 尿素凝胶 羟甲基汞凝胶16.掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的特点。答：分辨力高、容量大（10ug）、回收片段纯度高。但制备时间长。17.掌握PFGE的原理和应用。答：脉冲电场凝胶电泳。原理：制备染色体长片段加在琼脂糖凝胶上的电场方向、电流大小及作用时间交替变化，两电场方向

13、垂直，DNA分子的迁移方向随所用的电场方向周期性变化而不断改变。特点：施加交变电场，分离分子大小范围5kb2Mb，脉冲时间定向时间18.影响琼脂糖凝胶DNA电泳的因素有哪些？答：（1）DNA分子的大小（2）琼脂糖浓度（3）DNA的构象：I超螺旋II开环III线状（4）电压（5）嵌入染料（6）离子强度19、什么是核酸探针？用核酸作探针的原因。核酸探针的特性。答：定义：能识别特异碱基序列的有标记的一段单链DNA(或RNA)分子，一段与被测定的核苷酸序列（靶序列）互补的带标记的单股核苷酸。原因：信息量丰富，不同生物含可区别的DNA序列，稳定性（不像蛋白等不易保存）特性：一般为单链探针：杂交速度快/效

14、率高，浓度高，可进行标记，可检测点突变。敏感性高、特异性强、简便。20、掌握核酸探针的标记方法及其原理。答：（1）切口平移：限量DNase I在待标记的双连DNA的每一条连上产生若干个单连缺口;在DNA聚合酶I的作用下53外切，并在53合上新底物（探针），标记一条链。（2）末端转移。（T4DNA聚合酶特性：在无dNTP时，可以从任何3-OH外切；在四中dNTP均存时，聚合活性占主导地位）首先在无dNTP时，用T4DNA聚合酶作用下，序列降解产生的两个突出的末端；然后终止加入dNTP，有些加标记，有些不加，则T4DNA聚合酶表现聚合作用。（3）随机引物标记：引物很短，仅留个碱基，这样在引物上找到

15、的接合位点多，呈现随机性；DNA聚合酶不具有从头合成的能力，必须要有引物添加在3端羟基上，标记出来的探针是双链。（4）体外转录：非细胞状态下完成转录，借助一定的载体及外源DNA插入载体的克隆位点，采用合适的限制性内切酶将载体线性化，上游启动子起始转录，在RNA聚合酶的作用下以带标记的dNTP为底物合成新链。21、掌握核酸探针的分子杂交类型、原理及其比较和适用性。答：原理：分子杂交是通过配对碱基对之间的非共价键（主要是氢键）结合，从而形成稳定的双链区。分类：Southern印迹杂交（DNA）、Northern印迹杂交（RNA）、斑点杂交（操作快，较为粗略）、原位杂交（针对总DNA，可用于菌落、噬

16、菌斑、组织）22、非放射性标记物质有什么？非放射性显示体系是如何工作的？答：光促生物素标记、酶促生物素标记、酶促半抗原标记、化学催化酶标记24、掌握II型限制性内切酶的识别特性和切割特性。什么是同尾酶？答：识别特性:识别由4-8个核苷酸组成的呈回文结构的特定序列。切割特性：产生粘性端或钝端。粘性末端分为5突出（5有几个游离碱基）、3突出。同尾酶（isocaudomers）： 来源不同的限制酶，识别及切割序列各不相同，但却能产生出相同的粘性末端，这类限制酶称为同尾酶。25、掌握II型限制性内切酶的识别特性与切割片段大小之间的关系。28、什么是星号活力？产生星号活力的原因。答:星号活力（ star

17、 activity）：非标准反应条件下，内切酶识别切割能力下降，识别特异性下降产生原因：甘油（限制性内切酶保存在甘油中）、盐（来自于样品，一般 可以被除去）、PH、有机试剂（可能在粗提样品时被加入而未除净）；酶浓度大于10%时会引起星号活力，故不能多加；酶质量不好也易产生星号活力。30、T4DNA 连接酶的功能及其用途。答：（连接单位定义：16C 30内能使20ml 体系中5 mg l/HindIII 的6个片段有50%连接成lDNA的量。）功能：5-P+3-OH 需Mg2+ ATP用途：（1）同酶或同尾酶切产物的连接（2）接头与连接子的连接（3）末端改造后的平端连接31、什么是接头，什么是连

18、接子？答：接头：指的是连接两个分子或同一个分子两末端的一段DNA序列，是人工合成的寡核苷酸，两端有限制酶识别序列。连接子：指的是合成的具有限制性酶识别序列的核苷酸片段,利用连接子时,将其与外源DNA片段连接后,用相应的酶切割,则可产生粘性末端。32、碱性磷酸酶、S1酶、Bal31酶、 Klenow酶的功能及其用途是什么？答：碱性磷酸酶：去磷酸化防止载体自连S1酶：切割单链末端修饰、切开回折、RNA作图Bal31酶：53/35外切诱发基因的缺失突变、酶谱Klenow酶：末端放射性标记DNA聚合酶I大片段，只是从DNA聚合酶I全酶中去除53外切酶活性。有dNTP情况下，呈现DNA聚合酶活性，在没有

19、dNTP情况下呈现外切酶活性第二章 PCR技术1、什么是PCR?其原理什么？PCR反应的典型过程怎样？答: 定义：聚合酶链反应又称为PCR扩增技术，是一种高效、快速、特异性的体外DNA聚合程序。在体外的无细胞体系中模拟天然DNA复制过程的使目的DNA的量增加的反应。原理:类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核糖核苷酸引物。PCR由变性退火延伸三个基本反应步骤构成。步骤：（1）模板DNA变性：模板DNA经加热至94左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物接合，为下轮反应作准备。（2）模板DNA与引物的退火：模板DNA

20、经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对接合。（3）引物的延伸：DNA模板_引物结合物在TapDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。重复循环变性_退火_延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”。2、PCR反应中的引物设计有什么样的原则？答：（1）引物间配对碱基不能超过六个，尤其是3端引物间配对碱基不能超过2个；（2）引物内配对碱基不超过6个；（3）GC%，所占%比低，则Tm低（4）末端保守性：引物3端必须与模板完全匹配（5）兼并碱基（可用次黄嘌呤代替任意碱基）3、什么是

21、热启动？答：指在PCR反应中，由于Taq聚合酶在常温下也具有延伸引物的活性，因此为保证扩增产物的纯度，PCR反应的主要成分（模板和引物等）在延伸前才加入。6、难于扩增得到长片段产物的原因及其解决办法？答：原因：（1）3端得错配：此种情况在生物体内也存在，但体内的DNA聚合酶具有校正功能，而用于PCR扩增的Taq酶不具这种功能。（2）高温下脱嘌呤或脱嘧啶、而使Taq酶不能通过（3）反应添加剂、PCR循环参数、模板的完整性（模板越长越不稳定）等影响（4）TaqDNA聚合酶会自动脱落。解聚方法：发展新酶或合成能力强的酶； 三羟甲基甘氨酸可增加PH稳定性。8、如何进行PCR 污染的控制？答：设阴阳对照

22、；操作分区；材料分装（小包装）；加样顺序；使用专门仪器；重复实验。9、如何判断PCR产物的特异性？答：PCR产物是否为特异性扩增，其结果是否准确可靠，必须对其进行严格的分析与鉴定，才能得出正确的结论。PCR产物的分析，可依据研究对象和目的不同而采用不同的分析方法。凝胶电泳分析：PCR产物电泳，EB染色紫外成像仪下观察，初步判断产物的特异性。PCR产物片段的大小应与预计的一致，特别是多重PCR，应用多对引物，其产物片段都应符合预计的大小，这是起码条件。琼脂糖凝胶电泳：通常应在1-2%的琼脂糖凝胶，供检测用。聚丙烯酰胺凝胶电泳:6-10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离效果比琼脂糖好，条带比较集中，可用于科

23、研及检测分析。酶切分析：根据PCR产物中限制性内切酶的位点，用相应的酶切、电泳分离后，获得符合理论的片段，此法既能进行产物的鉴定，又能对靶基因分型，还能进行变异性研究。分子杂交：分子杂交是检测PCR产物特异性的有力证据，也是检测PCR产物碱基突变的有效方法。Southern印记杂交：在两引物之间另合成一条寡核苷酸链（内部寡核苷酸）标记后做探针，与PCR产物杂交。此法既可作特异性鉴定，又可以提高检测PCR产物的灵敏度，还可知其分子量及条带形状，主要用于科研。斑点杂交：将PCR产物点在硝酸纤维素膜或尼膜薄膜上，再用内部寡核苷酸探针杂交，观察有无着色斑点，主要用于PCR产物特异性鉴定及变异分析。核酸

24、序列分析：是检测PCR产物特异性的最可靠方法。10、利用PCR技术如何进行点突变？答: DNA分子中单个或几个碱基的变化可以使遗传的结构发生改变。11、什么是锚定PCR？应用于怎样的研究？答：用于扩增已知一端序列的目的DNA。在未知序列一端加上一段多聚dG的尾巴，然后分别用多聚dC和已知的序列作为引物进行PCR扩增。 锚定PCR（Anchored PCR, A-PCR）主要用于分析具有可变末端的DNA序列，Loh等用A-PCR对人外周血淋巴细胞T细胞受体-链的mRNA的多变性进行了分析。先可用于T细胞、肿瘤及其它部位抗体基因的研究。12、什么是不对称PCR？应用于怎样的研究？答：用不等量的一对

25、引物，PCR扩增后产生大量的单链DNA(SSDNA).这对引物分别称为非限制引物与限制性引物，其比例一般为1001。 得到单链，更适宜测序，单链还可作为探针。13、什么是表达子PCR? 应用于怎样的研究？答：引入酶切位点，将PCR产物克隆；引入噬菌体启动子，制备单链探针。14、什么是反向PCR？应用于怎样的研究？答：PCR只能扩增两端序列已知的基因片段，反向PCR可扩增中间一段已知序列，而两端序列未知的基因片段不扩增。 反向PCR的目的在于扩增一段已知序列旁侧的DNA，也就是说这一反应体系不是在一对引物之间而是在引物外侧合成DNA。15、什么是原位PCR? 应用于怎样的研究？答：就是在组织细胞

26、里进行PCR反应，它结合了具有细胞定位能力的原位杂交和高度特异敏感的PCR技术的优点。原位PCR既能分辩鉴定带有靶序列的细胞，又能标出靶序列在细胞内的位置，分子和细胞水平上研究疾病的发病机理和临床过程及病理的转归有重大的实用价值。16、什么是RAPD？应用于怎样的研究？答：RAPD即随即扩增多态DNA分析：两个物种的个体之间，亲缘关系越近其相应PCR扩增的带型就越相似，繁殖差异悬殊，利用这种原理的技术成为RAPD，应用于生物多样性分析。（单个人工合成的随机多态核苷酸序列为引物）。第三章核酸分析与合成3、末端终止法进行DNA测序的原理。答：DNA链中核苷酸以3,5-磷酸二酯键连接，合成DNA所用

27、的底物是 2-脱氧核苷三磷酸。2,3ddNTP与普通dNTP不同，它们在脱氧核糖的3位置缺少一个羟基。在DNA聚合酶作用下通过三磷酸基团掺入到延伸的DNA链中，但由于没有3羟基，不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键，因此，正在延伸的DNA链不能继续延伸。在DNA合成反应混合物的4种普通dNTP中加入少量的一种ddNTP，链延伸将与偶然发生但却十分特异的链终止竞争，产物是一系列的核苷酸链，其长度取决于引物末端到出现过早链终止位置间的距离。在4组独立酶反应中分别采用4种不同的ddNTP，结果将产生4组寡核苷酸，它们将分别终止于模板链的A、C、G或T位置。6、核酸的化学合成都有哪些方法？现在常用的是哪

28、种？其原理和过程是什么？答：（1）磷酸二酯法：付产物多、产率低、操作复杂(2)磷酸三酯法:核苷间的磷酸基以三酯存在。付产物少、磷酸基被保护可用硅胶柱分离、产率高、反应时间短速度快(3)亚磷酸三酯法：反应速度快、可固相合成原理：末端核苷（3的第一个碱基）固定在高分子化合物上（聚苯乙烯纤维、硅胶、微孔玻璃珠）循环反应洗涤除去未反应物和付产物、简化分纯、加快速度7、合成寡核苷酸纯化方法有哪些？各有怎样的应用范围和局限？答：脱盐：（乙醇沉淀、分子筛、反相柱C18）纯度低OPC柱纯化：（DMT）有短链、不适合基因合成和DNA序列分析、不宜纯化多于40mer的oligo HPLC纯化：吸附于反相柱的差异、

29、用于PCR反应；基因合成和DNA序列分析（较纯，40mer、Grich不适用、设备要求高）PAGE纯化：可用于任何反应（最纯、无限制、但费事、有毒）8、寡核苷酸化学合成的实际用途？答：（1）基因合成的元件（2）核苷酸序列分析的引物（3）核酸分子杂交的探针（4）突变研究第四章噬菌体载体及粘粒1、l噬菌体载体的类型及其比较。答：（1）插入型载体:只有一个位点外源基因在此插入。（2）替代性载体:具有两个插入位点两个位点之间的序列在外源基因插入后被取代。主要区别是容量不同和插入位点的不同，替代性载体容量较大。4、什么是柯斯质粒载体？有怎样的特点？答：一类由人工构建的含有 DNA的 cos序列和质粒复制

30、子的特殊类型的质粒载体。（容量：3145kb ）特点：具有l噬菌体的特性（环化）；具有质粒载体的特性；高容量。柯斯克隆 优点：容量大、非重组体少问题：分子内重组成多聚体（碱性磷酸酶处理） 基因间连接（电泳分级分离）6、噬菌体展示载体的工作原理。答：在丝状噬菌体颗粒一端的表面，存在3-5个基因III编码的蛋白质（功能：噬菌体颗粒的正确组装，作用于大肠杆菌雄性细胞F性须的吸附过程）。当外源DNA片段被插入在噬菌体展示载体的基因III编码序列中，在两者读码结构保持一致的情况下，就会产生由克隆基因与基因III联合编码的融合蛋白。用于构建噬菌体表面展示文库等。第五章目的基因的准备和重组及重组子的鉴定1、

31、什么是cDNA文库和基因组DNA文库？各有怎样的优缺点？答：cDNA文库：以mRNA为模板，经反转录酶催化，在体外反转录成cDNA，与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。 cDNA文库具有组织细胞特异性，比基因组DNA文库小的多，从中获得的是已经过剪接、去除内含子的cDNA。基因组DNA文库：指将某生物的全部基因组DNA用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度的DNA片段，再与适合的载体在体外重组并转化相应的宿主细胞获得的所有阳性菌落。整个克隆群体就包含基因组的

32、全部基因片段总和。cDNA基因文库的优点：病毒RNA的研究（只能构建cDNA文库）、筛选简单、cDNA文库直接是表达序列、可用于测定基因结构（内含子 外显子）、时间调节基因表达特征分析。缺点：无调节序列、低丰度mRNA克隆难（从文库中难以获得）2、如何计算构建文库时的规模？其影响因素有哪些？答：Clerke&Carbon公式：N=ln(1-p)/ln(1-f/g)N：文库的规模，即想要获得某一DNA片段所需文库大小。p：概率，获得某一片段的可能性。f/g：特异mRNA拷贝数/总mRNA种类可克隆片段大小/基因组总长度影响因素：mRNA丰度、克隆基因的大小(载体容量) 3、cDNA文库构建过程及

33、其关键步骤的处理和分析。答：（1）RNA的制备及纯化总RNA的提取mRNA的纯化-oligodT-纤维素柱层析特异mRNA的富集（mRNA分级分离、 蔗糖密度梯度离心）特异mRNA的分析鉴定* mRNA体外翻译（麦胚、兔网织红细胞）* RNA电泳-Northern Blot（2）cDNA两链的合成(RNA酶H法、自身引物法、试剂盒)（3）双链cDNA分子与载体的连接：同聚物加尾、inker-连接子 （4）重组体导入宿主：转化、转染、电脉冲 、4、cDNA双链合成过程。答：（1）利用RNA酶H，以oligo （ dT ）作为引物进行逆转录合成RNA-DNA杂合体。（2）自身引物法：以oligo

34、（ dT ）作为引物，合成3-OH，自身作为引物合成另一条链、用S1切开使平端化。（3）运用试剂盒5、什么是同聚物加尾？答：在载体和要插入的DNA片段分别加上poly A和poly T，形成粘性末端；使片段练到载体上。6、cDNA文库的检测方法及其原理？答：、遗传检测：利用载体提供的表型特征、插入基因功能表达、物理检测：凝胶电泳（重组体插入片段分子量增大，但此方法操作麻烦）、免疫化学检测：*标记抗体探针*免疫沉淀（免疫沉淀是利用抗体特异性反应纯化富集目的蛋白的一种方法。） 、转译筛选法*杂交抑制的转译-丰富mRNA*杂交选择的转译-低丰度mRNA-insulin、正负筛选法：组织特异性、发育阶

35、段特异性、特殊处理后基因表达差异7、基因组DNA文库如何制备？8、基因组DNA文库构建时，为防止外源DNA片段之间的连接，可采用哪些措施？答：（1）将待连接的DNA片段根据载体的装载量分级分离（2）用碱性磷酸单酯酶除去DNA片段的末端磷酸基团 （3）用TdT酶在DNA片段的末端上增补同聚尾末端 第六章基因在原核及真核体系中的表达1、真核基因在大肠杆菌中的表达存在的问题及其解决办法。答：理论上的困难: 遗传机制的差异基因结构（cDNA代替基因组DNA）转录信号（SD）（使用原核启动子及SD序列）细菌蛋白酶（引入突变体-抑制基因）mRNA结构、蛋白的后加工（无法解决）2、真核克隆基因在大肠杆菌中表

36、达的基本条件。答：（1）启动子（含启动子才能表达）、（2）含有SD序列、（3）正确插入方向（起始密码子靠近启动子）4、提高克隆基因在大肠杆菌中表达效率的途径。答：、启动子的结构对表达效率的影响（-35与-10间17bp最高活性）、转译起始序列对表达效率的影响转录不翻译区转译起始的保守序列：AUG、SD(UAAGGAGGU的部分或全部）、核糖体的结合位点有一个或几个终止密码子、含全部或部分PuPuUUUPuPu 其他：SD后的4碱基4 A或4T（GC则25%-50%）、起始密码子左边UAU、CUU最好，UUC UCA AGG 下降20倍、启动子同克隆基因间距离对表达效率的影响（不确定，与通过探测

37、得知。、质粒拷贝数对表达效率的影响（条件致死型载体）一般越多越好、转录终止区对克隆基因表达效率的影响终止区存在的必要性：（1）转录产物越长，RNA聚合酶转录一分子mRNA所需的时间就相应增加，外源基因本身的转录效率下降；（2）如果外源基因下游紧接有载体上的其它重要基因或DNA功能区域，如选择性标记基因和复制子结构等，则RNA聚合酶在此处的转录可能干扰质粒的复制及其它生物功能，甚至导致重组质粒的不稳定性；（3）过长的mRNA往往会产生大量无用的蛋白质，增加工程菌无谓的能量消耗（4）过长的转录物往往不能形成理想的二级结构，从而大大降低外源基因编码产物的翻译效率 、质粒分离的不稳定性对效率的影响*质

38、粒分配由par控制*克隆该基因*保持选择压力*反选择：质粒含CI， 宿主是溶源化细菌，其噬菌体启动子缺陷、密码子的使用频率(bias)密码子的偏爱性6、外源DNA导入哺乳动物细胞的方法及其原理和特点。答：(i)磷酸钙转染技术；(ii)DEAE-葡聚糖转染技术；(iii)聚阳离子-DSMO转染技术；(iv)电穿孔技术；(v)显微注射技术；(Vi)原生质体融合技术。7、什么是电穿孔法？什么是脂质载体法？有怎样的特点?答：（1）电穿孔(electroporation)是指在高压电脉冲的作用下使细胞膜上出现微小的孔洞。从而导致不同细胞之间的原生质膜发生融合作用的细胞生物学过程。(几乎所有类型的细胞，都

39、可以成功地使用电穿孔技术进行基因转移。此项技术具有操作简便，基因转移效率高等优点。)（2）脂质体(liposomes)是一种人造的脂质小泡(lipid vesicles)，外周是脂双层，内部是水腔。用它作载体可以把外源DNA导入培养的哺乳动物细胞。(制备简单，易消毒;包装的DNA 4 C长期不失活;毒性低，包装容量大;保护DNA免受核酸酶降解;效率低)9、研究DNA与蛋白质相互作用的方法及其原理。答：凝胶阻滞试验(gel retardation assay)原理：DNA结合蛋白运动变缓应用：研究转录因子及DNA的作用；突变对该作用的影响DNaseI足迹试验(footprinting assay

40、)原理：DNaseI随机切割，相差一个核苷酸，产生10类片段（在不同分子上）应用：研究转录因子与DNA作用的确切位点及突变对该作用的影响甲基化干扰试验 原理：甲基化作用干扰蛋白与DNA的作用，硫酸二甲酯(DMS)可使G甲基化，利于六氢吡啶切割应用：研究作用的确切位点；同理可研究A，但不能研究T、C体内足迹试验（DMS自然渗透）酵母杂交系统(yeast hybrid systems)：体内识别编码与目标蛋白作用的蛋白基因方法天然状态，弱，短(1) 双杂交系统在细胞内检查两种蛋白质是否相互作用结合的实验系统。构建这两种蛋白质分别与反式激活转录因子的DNA结合结构域(BD)及转录激活结构域(AD)相

41、连的融合蛋白表达载体，转入同一个细胞中表达，如果这两种蛋白质能够相互结合，就会将AD带到BD所识别结合的转录序列位置上，激活下游特定报道基因的表达而被检测。应用：受体-抗体作用，免疫反应，细胞结构缺陷：bait有内在DNA结合及激活活性时 蛋白不能稳定表达或定位于核 蛋白不能正确折叠或后加工(2)单杂交系统(one-hybrid system)分离与一个顺式作用元件结合的蛋白基因(3)三杂交系统(three-hybrid system)由蛋白、激酶、小分子、RNA介导的BD-X与AD-Y的作用10、什么是酵母杂交系统其工作原理及特点。答：体内识别编码与目标蛋白租用的蛋白基因方法。酵母双杂交系统

42、是将待研究的两种蛋白质的基因分别克隆到酵母表达质粒的转录激活因子(如GAL4等)的DNA结合结构域基因和GAL4激活结构域基因，构建成融合表达载体，从表达产物分析两种蛋白质相互作用的系统。第七章 植物基因工程1、什么是Ti质粒？什么是转座子示踪技术及其原理。答： （1）Ti是在根瘤土壤杆菌细胞中存在的一种染色体外自主复制的环形双链DNA分子。它控制根瘤的形成，可作为基因工程的载体。（2） 转座子示踪技术：根据植物或细胞的表型变异进行基因分离的有效手段。其方法是：用带有转座子的隐性纯合植物材料与所需分离的显性基因纯系亲本杂交，筛选因转座子插入而表现为隐性性状的突变品系。然后用已克隆的转座子为探针

43、，对突变株系进行Southem分析，通过常规分子克隆(如构建基因文库)分离目的基因片段。接着再以该基因片段为探针，从正常的显性基因纯系亲本中克隆出相应系列。2、什么是基因挽救技术？什么是cDNA差异显示技术？答：（1）有选择压力性状植株 基因组 连入穿梭载体 转入农杆菌 转化受体细胞 在选择压力下选择抗性植株 以T-DNA为探针选择目标基因（2）cDNA差异显示技术：该实验方法是针对从特定细胞或组织类型的mRNA池来源的样品用PCR技术对其中许多的cDNA基因一起进行扩增和显示的实验方法。原理：将锚定cDNA的3末端引物与随机引物加入反应混合液，用PCR技术进行双链cDNA产物的扩增。过比较两

44、种不同细胞类型或在不同生长条件下同种细胞类型来源的扩增cDNA产物的电泳带谱，能够用于鉴定其表达基因图谱的差异。3、植物的遗传转化方法。答：A以载体为媒介的基因转化（1）土壤农杆菌Ti质粒介导的遗传转化长度：200250kb 章鱼碱 胭脂碱 转化载体：共整合载体-pBR322含Ti基因及外源基因，导入农杆菌，同源重组使外源基因整合于Ti质粒双元载体系统-一个Ti提供Vir功能，另一个有目的基因、选择标记、移动复制功能 转化系统：叶盘转化系统：新切的叶圆片+农杆菌 筛选培养基 转化细胞 再生植株（2）植物DNA病毒介导的基因转移花椰菜花叶病毒、雀麦条斑病毒、双子座病毒缺点：外源DNA易被排斥、易

45、丧失感染力、寄主范围狭窄B、DNA的直接转移法(1)电击法: (2)基因枪法 ：钨或金 0.42.0m m (3)激光微束穿孔法(4)显微注射 (5)脂质体介导法(liposome) (6)多聚物介导法 PEG(7)花粉管通道法第八章 基因工程研究进展2、人类基因组计划包括哪几方面的内容？答：作图 (Mapping)：将染色体或DNA上的标记定位（14万个基因） 3、什么是遗传连锁图？什么是物理图？答：遗传连锁图(genetic linkage map) ：采用遗传学分析方法（两点、三点作图）将基因或其他DNA序列标定在染色体上；单位-cM（厘摩-1%交换率）物理图(physical map)

46、 ：有关构成基因组的全部基因的排列和间距的信息，它是通过对构成基因组的DNA分子进行测定而绘制的。（采用分子生物学技术直接将DNA 分子标记、基因或克隆标定在基因组实际的位置上；1cM=1000kb(人)；BAC库间重叠关系）4、名词解释：EST、STS、RFLP、MS、CpG island、YAC、BAC、DNA杂交测序、芯片答：EST（表达序列标签）：从一个随机选择的cDNA 克隆，进行5端和3端单一次测序挑选出来获得的短的cDNA 部分序列。STS（序列标签位点）：作为基因组物理图中位置标志的已知小段单拷贝独特的DNA序列。RFLP（限制片段长度多态性）：用同一种限制性内切酶，完全酶切来

47、源于同一物种不同个体的基因组DNA，从而获得长度各异的DNA片段(酶切谱)。MS（微卫星）：基因组中由短的重复单元(一般为16个碱基)组成的DNA串联重复序列。CpG island （CG岛，衍生作图标记）：基因组中稳定的成簇的飞甲基化GC片段YAC（酵母人工染色体）：YAC 人工染色体载体是利用酿酒酵母的染色体的复制元件构建的载体。BAC（细菌人工染色体）：由大肠杆菌单拷贝F质粒衍生而成的，可用于克隆基因组大片段DNA及构建基因组文库的克隆载体。DNA杂交测序：运用DNA分子变性后复性过程中碱基互补配对原理的测序法。芯片：一段人工合成的碱基序列，在探针上连接一些可检测的物质，根据碱基互补的原

48、理，利用基因探针到基因混合物中识别特定基因。5、YAC和BAC克隆体系各有怎样的优缺点？答：YAC：容量大。线性不稳定、有共克隆现象使结果不可信。BAC：容量大、电击转化、经典筛选方法、环状（不易被合算酶降解）、稳定性高（环状、单拷贝）。14、什么是RNAi？RNAi的工作原理及其特点。答：RNA干涉，是由双链dsRNA介导的、由特定酶参与的特异性基因沉默现象,它在转录水平、转录后水平和翻译水平上阻断基因的表达。i. 高效性：1100 nmol/L的双链RNA浓度对基因沉默的效果是一致的ii. 特异性：2123个碱基对中有12个碱基错配会大大降低对靶mRNA的降解效果。iii. 需要ATPiv. 位置效应：siRNA对mRNA的结合部位有碱基偏好性，GC含量较低的mRNA被沉默效果较好。v. 竞争效应vi. 可传播性系统性的RNAi包括了SID1介导的双链 RNA在细胞间的运输