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1、XXXX医院检验科微生物实验室血液及骨髓标本细菌学检验标准操作规程编号：MYCH/ 版本：第1版 第0次修改页数：第 5 页 共 5 页血液及骨髓标本细菌学检验标准操作规程1目的规范血液及骨髓标本细菌学检验标准操作规程，确保检验结果准确可靠。2适用范围血液及骨髓。3标本3.1 标本类型 血液及骨髓。3.2 标本采集3.2.1 采血时间 抗菌药物治疗前，发热初期或高峰时抽血。3.2.2 采血频率 对怀疑菌血症的成年病人，推荐同时在不同部位采集23套（每套包括一瓶需氧瓶、一瓶厌氧瓶或者两套需氧瓶），对感染性心内膜炎和真菌血症则应多次采集；婴幼儿病人，推荐同时在不同部位采集2套，可不做厌氧培养。3.
2、2.3 采血量 以培养基的1/10为宜，成人一次采血510ml，婴幼儿12ml。3.2.4 骨髓标本 用骨髓穿刺针从髂骨采集。3.3 标本拒收标准3.3.1 血培养瓶破裂或有明显污染。3.3.2 培养瓶标识与化验申请单不符。3.3.3 用过期的培养瓶采集标本、采血量不足等。3.3.4 对于不合格标本，应及时通知采集人员重新留取标本。3.4 标本保存 采集标本后立即送到实验室，不能及时送检可置室温，切勿放冰箱。冬季血培养瓶在送检过程中应采取一定的保温措施。4试剂、仪器4.1 革兰染液、氧化酶试剂、3%过氧化氢、血琼脂平板、巧克力平板、麦康凯平板、相关生化试剂等。4.2 BACT/Alert 3D
3、或BACTEC 9000全自动血培养系统、VITEK鉴定系统。成人需氧培养瓶、厌氧血培养瓶、儿童血培养瓶、革兰阴性菌鉴定卡(GNI+)、革兰阴性菌药敏卡(GNS)、革兰阳性菌鉴定卡(GPI)、革兰阳性菌药敏卡(GPS)、真菌鉴定卡(YBC)、药敏纸片、ATB板条等。4.3 接种针、接种环、电热灼烧器、显微镜、孵育箱、C02培养箱等。4.4 试剂的有效期和使用参照试剂说明书。5细菌鉴定和药敏质控参见质量管理程序。6检验步骤接收标本，立即对标本进行标号。门诊病人要同时登记住址，联系电话等病人信息。6.1 自动化培养 将血培养瓶置全自动血培养仪中。当标本有菌生长时，仪器发出阳性报警，应立即用无菌注射
4、器抽取瓶内培养液作直接涂片革兰染色，镜检，将结果向临床医师报告，同时转种血琼脂平板、麦康凯平板或加做巧克力平板，并进行直接药敏试验，置35、5%CO2培养箱培养1824小时。从琼脂平板上挑取菌落进行涂片染色及触酶和氧化酶试验。革兰阳性菌和革兰阴性菌分别选用GPI及GNI上机进行细菌鉴定和药敏试验或者做K-B法药敏试验。6.2 手工培养6.2.1 将血培养瓶35孵育箱，经1820小时孵育在血琼脂平板或巧克力平板上盲目转种一次。6.2.2 盲目转种后，培养瓶继续孵育至第5日，每日观察一次有无菌生长，并摇匀继续培养，根据肉眼观察，对有细菌生长迹象，取菌悬液涂片作革兰染色，同时分离培养，接种需氧血琼脂
5、平板、麦康凯平板或加做巧克力平板，并进行直接药敏试验，置35、5%CO2培养箱培养1824小时。次日纯培养再进行鉴定及药敏试验。6.3 特殊培养6.3.1 布鲁菌属 通常将血液接种到双相血培养瓶内，培养环境应5%10%CO235，每48小时观察有无细菌生长，若无细菌生长应继续培养，阴性应培养至30日后才可发出报告。6.3.2 乏养菌 该细菌生长需要巯醇复合物和维生素B6。在血培养基中需加盐酸-磷酸吡多醛(0.001%)或L-半胱氨酸(0.05%0.1%)或两者皆有，否则乏养菌不能生长。血培养物转种血琼脂平板上，然后交叉划线接种金黄色葡萄球菌，靠近金黄色葡萄球菌有乏养菌生长。6.3.3 L型细菌
6、 在培养基中含有10%蔗糖或甘露醇时，才适合L型细落生长。6.3.4心内膜炎特殊致病菌 如果常规血培养72小时阴性而病人临床症状仍提示感染性心内膜炎，应提高培养基的营养或补加添加剂。有利于分离营养要求苛刻、生长缓慢的革兰阴性杆菌，如人心杆菌、侵蚀艾肯菌、金氏菌、伴放线杆菌、军团菌等细菌，应延长培养至24周，然后转种特殊的培养基。血液、骨髓7. 操作流程置血培养瓶中需氧培养厌氧培养耐养试验血培养仪报警、挑取培养物涂片、染色转种平板35培养1824h直接药敏细菌种类观察菌落特征及涂片、染色二级报告一级报告仪器或手工细菌鉴定及药敏试验三级报告（最终报告）8. 结果报告8.1 阳性结果报告 报告通常分
7、为三级。8.1.1 一级报告 阳性报警血培养瓶应进行涂片革兰染色，将涂片结果电话（或其他方式）通知临床，同时记录报告的日期、时间、内容以及接收报告人的姓名。血培养阳性应列为危急值。8.1.2 二级报告 报告直接药敏试验结果。直接药敏试验，将血培养阳性标本进行革兰染色，如涂片找到细菌，根据革兰染色结果选择药敏所用培养基（Muller - Hinton培养基或含5%羊血Muller - Hinton琼脂平板），取阳性肉汤标本约0.2 ml，用无菌棉签均匀涂布于琼脂表面，根据革兰染色结果选择所用抗菌药物的纸片，如镜检见革兰阴性杆菌，选择肠杆菌科常用的抗菌药物纸片；若为革兰阳性球菌，成对排列，选择葡萄
8、球菌用的抗菌药物纸片。然后置35，孵育67小时读取初步药敏结果。次日纯培养再进行菌株鉴定和药敏试验，发送最终报告。最终结果如与初步报告不符，应及时与临床沟通，并在书面最终报告注明变更内容。8.1.3 三级报告 报告细菌种属、药敏试验、结果评价和建议。8.2 阴性结果报告 血培养72小时未见细菌生长，应通知临床医师，以便作相应处理，但培养瓶要继续培养至第5日，方可发出阴性报告。如果发现有菌生长，可补发报告。8.3 对发出报告进行销号，并作好菌名或无菌及报告日期登记。8.4 传染病（伤寒沙门菌）报医务部和（或）防保科。8.5 传染病菌种保存（伤寒沙门菌），交疾病控制中心复核。9注意事项9.1 抽血
9、后无需更换针头即可注入血培养瓶中。9.2抽血前即应贴好标签，标签不能覆盖条形码。9.3 若不能立即送至实验室，应置于35温箱或室温，绝不可放置于冰箱。9.4 有自动血培养仪的实验室，应建立24小时值班制，可及时处理阳性报警标本。9.5 如不同部位采集的两瓶血培养瓶出现一瓶阳性一瓶阴性，或者出现两瓶均为阳性，检测结果均为凝固酶阴性葡萄球菌，这两种情况都应该向临床报告和沟通。10临床意义引起败血症的多为耐药性金黄色葡萄球菌、某些革兰阴性杆菌及部分球菌；疖、痈、脓肿和化脓性骨髓炎继发的败血症主要由金黄色葡萄球菌和l3溶血链球菌引起；尿道、胆道、胃肠道炎症和黏膜损伤引起的败血症以大肠埃希菌最常见；烧伤
10、后铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌多见。伤寒和副伤寒于病程第12周做血液细菌培养，伤寒和副伤寒沙门菌的检出率可达80% - 90%。11危急值报告仪器报警阳性标本直接涂片、革兰染色，确定细菌种类，应立即向临床报告细菌涂片结果。参考文献1 中国合格评定国家认可委员会CNAS - GL23：2008医学实验室质量和能力认可准则在临床微生物学检验领域的指南20082 周庭银编著临床微生物学诊断与图解，第二版，上海：上海科学技术出版社,20073 叶应妩，王毓三，申子瑜主编全国临床检验操作规程，第三版南京：东南大学出版社.20064 Murray PR. Manual 0/F Clinical Microbilogy.9th ed. Washington：ASM Press, 20075 徐英春、倪语星、王金良主编。血培养操作规范。上海：上海科学技术出版社，2002编写人签名复审人签名审批人签名生效日期姓 名：XX编写日期:2011-05姓 名：XXX复审日期：2011-06姓 名：XXX批准日期：2011-062011-07
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