辅助T细胞分化

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1、Help T 细胞的分化调控CD4 Th细胞激活后分化为功能不同的Th1和Th2效应细胞，Th1细胞分泌IL2、IFN yTNFB等介导细胞免疫应答、 迟发型超敏反应和器官特异自身免疫性疾病在宿主抗胞内病原感染中 起重要作用。Th2细胞产生IL4、IL5、IL6、IL9、IL10、IL13等细胞因子介导体液免疫应答、 过敏性和感染性疾病在拮抗胞外病原体(如细菌、寄生虫 ) 、 B 细胞增殖分化以及哮喘病等方面具有重要作用。近年来，人们对初始CD4 +T细胞分化为Th1或Th2细胞的机制进行了广泛而深入的研究，已取得一些共同的认识：双信号刺激活化CD4+T细胞,活化信号传向胞内、启动多条信号转导

2、通路 ，激活转录因子、继而转录因子结合到目的基因的启动子区、促 使原癌基因、细胞因子基因及其受体基因表达。细胞因子可经自分泌和旁分泌作用促使T细胞克隆扩增，之后分化为功能各异的 Th1 和 Th2 效应细胞，部分分化为记忆细胞。在 Th 细胞分化过程中 ,细胞因子被认为是最主要的因素。1、TCR 和协同刺激信号1.1 TCR- CD3TCR与 MHCH:抗原肽复合分子的结合为 T细胞激活所需的第一信号。TCR2CD3激活后,CD3 的免疫受体酪氨酸活化基序 ( Immune receptor tyrosinebased activation motifs ， ITAM) 可转导 胞外刺激信号。

3、研究发现，在无IL4和IL12的T细胞分化早期,TCR活化信号影响Th1PTh2的 分化决定：MEKPERK激活、Ca2 +流增加驱使T细胞向Th1分化；PKC激活或钙调磷酸酶部分 阻断则驱使T细胞向Th2分化。另外，弱TCR活化信号能激活 Ca2 +流信号诱导IL4合成， 促使T细胞向Th2分化；强TCR活化信号可激活 MAPK通路诱导IFN2y合成，促使T细胞向 Th1分化。TCR触发时间的长短也影响 Th细胞的分化；IL12存在时，短暂的TCR触发启动 Th1分化，长时间的TCR触发则启动Th2分化。1.2 CD4CD4为T细胞的辅助受体，在 T细胞活化早期能与 MHC H类分子结合，并

4、通过蛋白酪氨酸 激酶LcK转导信号，LcK缺失的CD4+T细胞可出现Th2分化障碍,Tec家族激酶Rik和Itk (Lek下 游分子 )在 Th2 分化过程中亦起重要作用。1.3 CD28 及其同系物CD28与活化APC上的B7.1 (CD80)或B7.2(CD86)的结合为T细胞活化提供第二个信号。IL4、 IL5以及IL10的产生需要 CD28协同刺激,CD28能增加胞内转录因子 NF-AT2 (nuelear factor of activated T cells 2)的累积，缺失时CD4 + T细胞仅分泌IFN。B7分子敲除的APC实验研究亦证 实IL4的产生和Th2分化高度依赖于B7

5、 ,而有实验发现CD28能导致膜脂质微小区域的重组 和持续的酪氨酸磷酸化，但CD28介导Th2分化的分子机制目前尚不清楚。最近,Skapenko等发现记忆T细胞CD28能启动IL4基因转录，并激活PI3激酶、JNK-SAPK以及p38 MAP通 路,CD28-B7诱导Th2分化要依赖于IL4的表达、p38以及ERK-MAP通路的激活。因此,CD8 可能可以放大诱导 Th2分化的TCR活化信号。CTLA4是 CD28的同系物，表达于活化T细胞，与B7结合的亲和力是 CD28的10倍，缺乏CTLA4 可出现多克隆T细胞激活增殖紊乱。CTLA4敲除T细胞能分泌高浓度IL4和IL5,提示CTLA4 在

6、Th2分化诱导中起下调 CD28的作用。诱导性协作刺激因子(inducible costimulator ,ICOS)是近来发现的 CD28同系物，亦表达于活化 T细胞。与 CD28和CTLA4不同的是，ICOS不与B7结合,而与B7RP1 (B7的同系物之一)结 合。ICOS缺失小鼠T细胞分泌的IL4明显降低，而 IFNy未见异常。因此，ICOS能潜在地调节T 细胞的分化发展。2、IL12众多来源的IL4能通过STAT6诱导Th2分化，但最初驱使分化的IL4源自何处，目前尚不清楚。 IL4 基因定位于 11 号染色体 ,此部位还有 IL5、IL13 基因。在 IL4 和 IL13 基因位点处

7、发现了 与Th2分化相关的几个 DNA酶I高敏感位点,提示:在Th2分化时伴随有这些 Th2型细胞因子 基因位点的染色质重组。已证实核小体上组蛋白的高乙酰基化与IL4、IL5、IL13等基因相关，且这种Th2特异的高乙酰基化依赖于STAT6和GATA3并伴随IL4、IL13基因的转录表达。目前在 IL13 基因位点上游 1. 6kbp 处， 发现了一段保守的 GATA3 反应元件 (GATA3 response element ,CGRE)序列，它能与 GATA3组蛋白乙酰基转移酶复合物以及RNA聚合酶n结合,并具有增强上述 Th2 型细胞因子基因启动子的作用。通过对 IL4 基因启动子的研究

8、 ，亦发现 多个与IL4基因表达有关的转录因子 ，如NFAT2AP1GATA3cmaf以及JunB等。另外,IL13能 与IL4受体a链结合，调节Th2分化；IL26能上调细胞因子信号抑制分子1 ( suppressor ofcytokine signaling1 ，SOCS1) 表达而抑制 Th1 分化，同时促进活化 CD4+T 细胞分泌 IL4 诱导 Th2 分化。3、转录因子3.1 NF2ATNF2AT家族有 5 个成员:NF2AT1 (NF2ATp)、NF2AT2 (NF2ATc)、NF2AT3 NF2AT4 NF2AT5 , 均有高度保守的 DNA 和钙调磷酸酶结合位点。前 4 者位

9、于胞浆中 ，NF2AT5 则位于胞核内。 钙调磷酸酶磷酸化介导NF2AT的核内转运，而RasPRaf2MEK2ERK等蛋白激酶的激活使得NF2AT与AP21结合，形成NFAT2AP1复合物与DNA结合。许多表达于活化 T细胞的基因启 动子或增强子处均存在 NF2AT结合位点，如IL2、IL4、IL25、IFNy等。敲除NF2AT2的小鼠,IL4 等 Th2 型细胞因子表达受抑制 ，呈现 Th2 分化缺陷 ，敲除 NF2AT1 或同时敲除 NF2AT1 和 NF2AT4 小鼠却出现截然相反的结果。 这说明 NF2AT1、NF2AT2 能与 IL4 启动子的 NFAT2AP1 位点结合，功能各异地

10、调节IL24转录。Porter等报道，ERK1 JNK3 p38a参与了 NF2AT的磷 酸化调节，并能抑制NF2AT2的核转运。3.2 GATA23GATA23属于GATA家族,表达于初始CD4+ T细胞和朝Th2分化的Th0细胞，是Th2分化调节 的重要转录因子。过度表达 GATA23 的转基因小鼠 T 细胞能表达 IL4、IL5、IL6、IL10 和 IL13 等Th2型细胞因子 mRNA,通过反义技术抑制GATA3表达，这些Th2型细胞因子 mRNA的表达亦受抑制。然而 ，IL4 基因近侧启动子区并不存在 GATA23 结合位点 ，因此有人认为 GATA23 可能是一个 Th2 特异的

11、增强子 ，或是作为一个局部控制区域 (如在 IL4、IL5、IL13 区 域) 存在。在STAT6敲除的T细胞中，GATA23亦能诱导Th2型细胞因子表达，导致Th2分化，并在IL4 基因定位处发现 Th2特异的DNA酶I高敏感位点 侗时,GATA3能与NF2AT结合而诱导IL5 启动子的活性。近来研究发现一种称为FOG ( Friend of GATA)的结构分子，该分子表达于初始Th 细胞，起抑制 GATA23 的作用。3.3 c2mafc2maf是基本区域 P亮氨酸拉链(basic region/leucine zipper)转录因子，特异表达于 Th2细胞， 是最早被克隆的 Th2特异

12、性转录因子。以往认为，c2maf激活后不影响其它 Th2型细胞因子的表达 ，只是通过选择性地与 IL24 近侧启动子结合 ，诱导 IL24 表达促使 Th2 分化。最近，哈佛 医学院的研究人员发现，c2maf亦可通过IL22Ra (CD25)介导但不依赖IL4的途径促使Th2分 化。c2maf灭活或敲除时,Th2分化和相应细胞因子分泌照常进行，推测可能与IL13的补偿作 用有关。3.4 T-betT-bet （亦称T-box 21）能激活IFNy表达,是新近发现的 Th1特异性转录因子。T-bet能诱导 IFN-y等位基因染色质重组和转录激活IFN-y基因,亦能诱导IL12RB2亚单位表达，促

13、使Th1分化。若将T2bet导入已分化的 CD4 Th2细胞，出现IFN2 丫分泌增强，IL4、IL5等Th2型细胞因 子产生受阻，细胞朝Th1分化。研究发现,T2bet诱导的Th1分化不依赖于IL12-PSTAT4或IL18 , 但受IL4-PSTAT6的抑制。然而,STAT与T2bet之间的关系目前尚不清楚。3.5 CPEBP 和 JunB与c2maf类似,CPEBP家族成员（如CPEBP ）亦能与IL4启动子结合，是内源性IL4表达的潜 在诱导因子。同时,CPEBP亦能抑制IL22和IFN-y RNA的合成，但不影响其它Th2型细胞因子。 JunB属于c-jun转录因子家族，选择性表达于

14、Th2效应细胞，能与AP21特异结合,激活IL-4转 录。JunB介导的IL-4表达需要JNK激酶和c2maf的协作，并能诱导分化中的 Th2细胞产生 IL-5、IL-6 和 IL-10。4、Th 细胞分化中的信号通路4.1 JAK-STATJAK-STAT是细胞因子受体介导的主要信号转导通路。IL-12能通过STAT4介导Th1细胞分化，IL-4可通过STAT6介导Th2细胞分化。然而,STAT介导的目的基因尚不清楚，在IL-4启动子 附近亦未发现STAT结合位点。尽管 STAT4或STAT6基因敲除实验显示IFN-y或 IL-4依然正 常分泌，但缺少STAT信号时GATA23 T-bet以

15、及细胞因子的表达则大受影响。推测STAT与GATA23、c2maf 、T2bet 等转录因子密切相关 ，阐明这些内在的联系有助于搞清Th 细胞分化的分子机制。 Bcl26 由于能与 STAT6 竞争相同的结合位点 ，被认为是 Th2 的负向调节因子。 新近发现SOCS5能通过与IL-4R的相互作用，负向调节IL-4PSTAT6通路,从而抑制Th2分化。4.2 MAPK哺乳动物的MAPK信号通路包括细胞外信号调节激酶（ERK）、c-Jun N端激酶（JNK）P应激激活的蛋白激酶 （SAPK） 、P38MAPK 以及 ERK5PBMK1 四条途径。每条通路均通过保守的三级酶 促级联反应*MAPKK

16、KMAPKK（MKK）宀MAPK+激活转录因子，调节特定基因的表达。ERK位于癌基因Ras下游,Ras等不同激活信号通过 Raf2MEK1途径激活ERK通常称Ras2ERK!路，包括ERK1和ERK2前已述及TCR激活信号能激活 MEKPERK促使Th1分化。H2Ras转基因小鼠 研究却发现,Ras2ERK通路经非TCR激活信号激活后，能上调JAK1激酶活性，促进STAT6酪氨 酸磷酸化并提示Ras-ERK与 JAK-STA通路之间存在交叉。 可见,Ras2ERK通路与Th细胞分化 的确切关系尚待研究。p38蛋白有4种亚型：p38- a p38-氏p38- 丫和p38- & MKK3、MKK6

17、是其主要的蛋白激酶 ，应 激或炎症刺激等情况下可被激活。p38 激活后的直接底物为 MAPK 激活的蛋白激酶（MAPKAPK）22P3，其目的基因启动子中含有CRE或能与CREBPATF和 AP21家族相互作用敏感的反应元件。p382a、MKK3P6等转基因动物实验发现抑制p38MAPK通路的激活,IFN2冰平明显下降。由于IFN2y启动子近侧和远侧功能性活化元件处存在c-junPATF2结合位点以及一系列其它ATF结合位点，且近侧IFN2y元件携带c-junPATF2结合位点，呈现Th1特异性。 因此,p38MAPK通路可能通过激活IFN2 丫转录，促使Th1细胞分化。JNK亦是一种应激激活

18、的蛋白激酶，包括JNK1P2P3激活的磷酸化级联反应为MEKK1 ,2t MKK4PSEK1 JNKPSAPK（MKK亦能激活 JNK）。JNKPSAPK能使 c2jun、ATF22 等磷酸化并 增加其转录活性 ，促进 c-fos、c-Jun、ATF22 调节基因的表达。 JNK2 基因敲除研究发现小鼠 IFN2注平降低,Th1免疫应答缺陷，但Th2免疫应答不受影响。将 IFN-y加入JNK2缺失的T 细胞中则能恢复上述缺陷，产生正常的Th1免疫应答。JNK1敲除的小鼠呈现强烈的 Th2免疫 应答,即使在Th1条件下亦产生大量IL-4、IL-5和IL10等Th2型细胞因子，进而发现JNK1敲

19、除小鼠核内 NF-AT2 水平上升 ,提示 JNK1 能负向调节核内 NF2AT2 的水平 ,从而影响 Th2 型细 胞因子产生。4.3 NF- kBPI- kB正常情况下,NF2k B与其抑制因子 I-k B存在于胞浆中。随着上游激酶（NF-kB诱导激酶或MEKK1）的激活,I- k B激酶活化并出现I- k B蛋白磷酸化,导致它们与 NF- k B分离并降解，而游 离的NF2xB则转入胞核内转导激活目的基因。NF-启因子在Th细胞分化中的作用研究目前刚起步。已有研究发现 ,抑制 NF2k B 活性可阻断 GATA23 表达和 Th2 型细胞因子产生。5、结语细胞分化过程本质上是细胞基因的按

20、序表达和选择性表达的结果,因此 ,细胞分化调控的基本规律就是基因表达调节。 对于 Th 细胞分化而言 ,最终表现为控制细胞应答的有关基因的活化 与表达 ,细胞信号转导通路在此起了重要的中介作用。 近几年 ,Th 细胞分化机制研究进展迅速 已认识到 TCR 活化信号、辅助受体以及细胞因子环境等因素共同介导了 Th1PTh2 细胞的分 化方向 ,并逐步深入到转录因子、 信号转导、 基因调控水平。 我们相信 ,Th 细胞分化的复杂性、 调节的精确性以及信号通路和相关因子的交叉性等问题的最终阐明,必将给免疫性疾病的药物治疗带来重大突破。TCR sb hi ic lioncmTCRp RearrHnge

21、menl.f. fiCD4-潭TCRTHYMUSDfApoptosisBLOODSeledion HQ MHQJ+ SeledlicnMHQ声f I削c，Th fDIQiTCR6b- Raarrangemafit *Pre-TCRMHC seleclmnTCR* Rearran9*mertiSBledion hih IMHC 鼻 UyApoptosis-M 5TA16相关通路指标:T-Cell Activation:Regulators of T-Cell Activation:CD2, CD276, CD47, DPP4, CD3D, CD3E, CD3G, CD4, CD7, CD80,C

22、D86, CD8A, CD8B,FOXP3,ICOSLG, IRF4, LAG3, LCK, MAP3K7 (TAK1), MICB, NCK1, TNFSF14,VAV1.T-Cell Proliferation:CD28, CD3E, ICOSLG, IL1B, IL10, IL12B, IL18, NCK1, RIPK2, TNFSF14.T-Cell Differentiation:ADA, APC, BCL2, BLM, CD1D, CD2, CD27 (TNFRSF7), CD4, CD80, CD86,EGR1, IL12B, IL15, IL2, IRF4, NOS2 (iNO

23、S), PTPRC, SOCS1.T-Cell Polarization:CCL3, CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CD274, CD28, CD4, CD40LG(TNFSF5), CSF2 (GM-CSF), CXCR3, CXCR4, IFNG, IL12A, IL12RB1, IL12RB2, IL18R1, IL2, IL4, IL4R, IL5, TGFB1.Regulators of Th1 and Th2 Development:CD2, CD4 0 (TNFRSF5), CD5, CD7, CSF2 (GM-CSF), IFNG,IL10, IL

24、12A, IL13, IL3, IL4, IL5, TLR2, TLR4, TLR9.Th1 & Th2 Differentiation:CD28, CD40 (TNFRSF5), CD40LG (TNFSF5), CD86, IFNG, IL12A, IL12B,IL12RB1, IL12RB2, IL18, IL18R1, IL2, IL2RA, IL4, IL4R, IL6.B-Cell Activation:Antigen Dependent B-cell Activation:CD28, CD4, CD4 0 (T NFRSF5), CD40LG (TNFSF5), CD80, FA

25、S(TNFRSF6), FASLG (TNFSF6), IL10, IL2, IL4.Other Genes involved in B-Cell Activation:ADA, CXCR5, ICOSLG, IL6, IL7, MS4A1, TGFB1.B-Cell Proliferation: BCL2, CD27 (TNFRSF7), CD40 (TNFRSF5), CD81, IL10, IL7, PTPRC.B-Cell Differentiation: ADA, AICDA, BLNK, CD27 (TNFRSF7), IL10, IL11, IL4, RAG1.Other Imm

26、une Cell Activation:Macrophage Activation:IL13, IL4, TLR1, TLR4,TLR6.Neutrophil Activation:IL8.Natural Killer Cell Activation:CD2, IL12A, IL12B, IL2.Leukocyte Activation:CX3CL1.通路研究工具:细胞谱系鉴定系列胰岛素抵抗系列T细胞和B细胞激活 系列终末分化指标系列PCR Array of Cell Lin eage Iden tificati onPCR Array of In sulin Resista neePCRAr

27、ray of T-Cell & B-Cell ActivationHU-CLI-084HU-INR-084HU-TCA-084PCRArray of Terminal DifferentiationHU-TDM-084MarkersPCR Array:PCR ArrayQ-PCR array是信号通路基础 生物学研究和临床疾病研究的重要 工具。这种功能分类芯片运用成熟的 SYBR Green荧光定量PCR技术， 专注于一个信号通路中基因的表达 水平检测。与传统的高密度表达谱芯 片相比，Q-PCR array具有针对性 强、灵敏度高、准确可靠等优点。芯 片上的基因包括了与研究对象有确 定关系的基

28、因，或至少是与研究对象 的关系有待考证的基因。 如果研究对 象是某一生物学通路的基因，则使用 针对该类基因的功能分类基因芯片 比使用高密度表搭配芯片更加有效 便利。BioTNT QPCR芯片特点:|灵敏度高，样本使用量低；|线性范围广，可同时检测表达水平差异大的基因；|每个基因的检测引物优化后保证高扩增率和产物单- l重复性高，Ct值的平均差异只有 0.25个循环;BioTNT QPCR Array芯片操作流程:BioTXT PCR.-Vrav实验操作示意图Is RNA抽提；RNA逆转录成为CDNA；2s CDNA 加入 BioTXT 氏a： ：im?染料 PCR PzlIX AM10AQ112 ,加样至 qPCRArray3、在QPCR仪器上进行QPCR实验4s数据分析:d