质粒DNA的提取、纯化及验证

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1、质粒DNA的提取、纯化及验证姓名：肖风 学号： 201000100122 2010 级生物工程一、【实验目的】1、掌握碱变性提取法的原理及各种试剂的作用， 掌握碱变性法提取质粒 DNA 的方法。2、掌握质粒DNA勺纯化方法，即用酚、氯仿抽提法除去质粒中的蛋白质。3、学习并掌握凝胶电泳进行 DNA的分离纯化的实验原理，凝胶的制备及电泳方法及凝胶中DNA的分离纯化方法。二、【实验原理】1、碱变性提取法提取和纯化质粒DNA的方法很多，目前常用的有：碱变性提取法、煮沸法、 羟基磷灰石柱层析法、EB氯化铯密度梯度离心法和 Wizard法等。其中，碱变 性提取法最为经典和常用，适于不同量质粒DNA勺提取。

2、该方法操作简单，易于 操作，一般实验室均可进行。提取的质粒 DNA纯度高，可直接用于酶切、序列测 定及分析。 碱变性提取质粒DN1般包括三个基本步骤：培养细菌细胞以扩增 质粒；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒 DNA。在细菌细胞中，染色体DNA以双螺旋结构存在，质粒DNA以共价闭合环状形式存 在。细胞破碎后，染色体DNA和质粒DNA匀被释放出来，但是两者变性与复性所 依赖的溶液pH值不同。在pH值高达12. 0的碱性溶液中，染色体DNA勺氢键断 裂，双螺旋结构解开而变性；共价闭合环状质粒DNA勺大部分氢键断裂，但两条 互补链不完全分离。当用pH值4.6的KAc（或NaAc）高盐溶液调节碱性溶液至

3、中 性时，变性的质粒DNA可恢复原来的共价闭合环状超螺旋结构而溶解于溶液中； 但染色体DNA不能复性，而是与不稳定的大分子 RNA蛋白质一 SDS复合物等一 起形成缠连的、 可见的白色絮状沉淀。 这种沉淀通过离心， 与复性的溶于溶液的 质粒DNA分离。溶于上清液的质粒DNA可用无水乙醇和盐溶液，使之凝聚而形 成沉淀。由于DNA与 RNA性质类似，乙醇沉淀DNA的同时，也伴随着RNA沉淀， 可利用RNase A将RNA降解。质粒DNA溶液中的RNase A以及一些可溶性蛋白， 可通过酚氯仿抽提除去，最后获得纯度较高的质粒 DNA。2、琼脂糖凝胶电泳凝胶电泳技术操作简单而迅速，分辨率高，分辨范围极

4、广。此外，凝胶中DNA的位置可以用低浓度荧光插入染料如溴化乙锭 (EB)或SYBRGold染色直接观 察到，甚至含量少至20 Pg的双链DNA在紫外激发下也能直接检测到。需要的话， 这些分离的DNA条带可以从凝胶中回收，用于各种各样目的的实验。分子生物学实验中， 常用的两种凝胶为琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶。 这两种凝胶能 灌制成各种形状、 大小和孔径， 也能以许多不同的构型和方位进行电泳。 琼脂糖 凝胶电泳易于操作，适用于核酸电泳，测定DNA勺相对分子质量，分离经限制酶 水解的DNA片段，进一步纯化DNA等。琼脂糖凝胶电泳是一种常用的方法。在溶液中，由于核酸有磷酸基而带负电荷，在电场中向正极移动。

5、DNA在琼脂糖凝胶中的电泳迁移速率主要取决于下面 6个 因素：(1) 样品DNA分子的大小：电泳时，线性双螺旋DNA分子是以头尾位向前迁 移的，其迁移速度与相对分子质量 (所含碱基 )的对数值成反比， 这是因为大分子 有更大的摩擦阻力。(2) DNA分子的构象：相对分子质量相同而构象不同的DNA分子，其迁移速率不同。在抽提质粒DNA过程中，由于各种因素的影响，使超螺旋的共价闭合环状结 构的质粒 DNA(covalently closed circular DNA ，cccDNA)的一条链断裂，变成 开环DNA(open circle DNA，oeDNA分子，如果两条链发生断裂，就转变为线状 D

6、NA(1iner DNA L DNA)分子。这三种构型的分子有不同的迁移率。一般情况下， 超螺旋型迁移速度最快，其次为线状分子，最慢的是开环状分子。(3) 琼脂糖浓度：琼脂糖浓度直接影响凝胶的孔径，一定大小的 DNA片段 在不同浓度的琼脂糖凝胶中的泳动速度不同。 通常凝胶浓度越低， 则凝胶孔径越 大，DNAt泳迁移速度越快，因此，相对分子质量越大，选用的凝胶浓度应越低。 电泳所用电场：低电压条件下，线性DNA片段的迁移速率与所用电压 成正比，电压越高，带电颗粒泳动越快，但随着电场强度的增加，不同长度 DNA 泳动的增加程度不同，因此凝胶电泳分离 DNA的有效范围随着电压上升而减少。 为了获得D

7、NA片段的最佳分离效果，电场强度应小于 5 V/cm。(5) 缓冲液： 缓冲液的组成和离子强度直接影响迁移率。 当电泳液为去离子水（ 如不慎误用去离子水配制凝胶 ） ，溶液的导电性很少，带电颗粒泳动很慢，DNA几乎不移动；而在高离子强度下（如错用10X电泳缓冲液）,导电性极高，带 电颗粒泳动很快，产生大量的热，有时甚至熔化凝胶或使DNA变性。 温度：琼脂糖凝胶电泳时，不同大小DNA片段的相对电泳迁移率在430C内无变化，一般琼脂糖凝胶电泳多在室温下进行，而当琼脂糖含量少于0. 5%时，凝胶很脆弱，最好在4C下电泳以增加凝胶强度。三、【实验材料】 恒温振荡培养箱，高速冷冻离心机，漩涡振荡仪，水浴

8、锅； 1.5mL 离心管， 50mL 离心管，不同型号的吸头，微量移液器等。菌体：E.coli DH5 a受体菌，具有Ampr标记的质粒pUC19微波炉，电泳仪，制胶槽，电泳槽，梳子，锥形瓶，电子天平，手套，紫外灯， Eppendorf 管，刀片，塑料薄膜等。酶切后的DNA羊品或其他待分离纯化的DNA羊品；琼脂糖，TAE缓冲液，溴化乙 锭（EB），6X上样缓冲液，DNA相对分子质量标准物 DNA Marker入/Hind III ， 5 mol/L pH5.2 的醋酸钠，无水乙醇。四、【实验步骤】（一）、实验前准备1、LB培养液+1%葡萄糖按照附录所示配方配制LB培养液，并添加1%葡萄糖，11

9、5C灭菌30min, 分别分装于100mL锥形瓶中20mL 300mL锥形瓶中50mL同时配制固体培养基 用于活化菌株。2、枪尖：1000卩L （蓝色）、200卩L （黄色）、20卩L （白色），灭菌备用3、 离心管：1.5mL离心管于500mL锥形瓶中，50mL离心管2支，灭菌备用4、吸管：10mL吸管，灭菌备用（二 ）、质粒提取1 、细胞培养在含有氨苄青霉素的LB平板上挑去携带有质粒pUC19的 E.coli单菌落，接种 于20mL含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37C振荡培养过夜。将过夜培养液吸 取23mL接种到50mL含有氨苄青霉素的LB培养基中，37C培养46h,即到 达菌体生长的对

10、数晚期。2、 质粒提取2.1. 取30mL菌液于50mL灭菌离心管中，在7000r/min条件下离心5min， 弃去上清液，收集菌体细胞。空管质量为 15.570g。2.2. 向离心管中加入5mL冰箱预冷的溶液I，加入溶液I主要是为了打散 菌体，使菌体沉淀转变成为均匀的菌悬液， 为下一步破碎菌体做准备， 可剧烈振 荡，此时细胞尚未破裂，不用担心染色体断裂。为节省时间，可在漩涡振荡仪上 混匀。通过步骤（ 1）离心，弃去上清液，将离心管倒置，使上清液全部流尽， 用吸水纸擦干，称量菌体质量，为 15.742-15.570=0.172g 。2.3. 按湿菌体质量：溶液I体积=100mg 1mL的比例加

11、入用冰箱预冷的溶液I （2mL，剧烈振荡，使细菌完全分散，将离心管置于碎冰中冰浴5min2.4. 以2倍体积加入新配制的溶液U （4mL，轻摇轻加，至半透明溶液形 成。此步是DNA变性的关键步骤，加入溶液II后，菌悬液pH上升到12左右， 为强碱性，破坏大肠杆菌（G-）细胞壁，此时，溶液变粘稠、透明，无菌块残留， 因为染色体DNA与质粒DNA均变性溶解于强碱溶液中，蛋白质也溶于溶液中，但 质粒DNA双链不完全分离。因此步染色体DNA释放，故动作必须轻柔，不能剧烈 震荡，否则染色体DNA会断裂成小片段，不形成沉淀，而溶解于溶液中，与质粒 DNA昆合在一起，不利于质粒DNA提纯。可缓慢上下颠倒离心

12、管数次，既要使试 剂与染色体DNA充分作用，又不破坏染色体的结构。2.5. 以1.5倍溶液I体积量加入冰箱预冷的溶液川（3ml）,轻加轻摇，慢 慢颠倒数次，使之在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，然后将离心管置于冰上10min,此时有白色絮状沉淀物。此步是质粒DNA复性的关键步骤。动作要轻柔， 理由同上。同时可减少对质粒 DNA的破坏，使其保持超螺旋闭环结构。2.6. 12000r/min离心15min,将上清液轻轻转移到另一洁净离心管中，向上清液中加入1/10体积的3mol/mL的NaAc和2倍体积的冰无水乙醇，混匀， -20 C下静置30min,沉淀DNA2.7. 女口（6）中离心15mi n,

13、小心弃去上清液，将离心管倒置于纸巾上，以使所有的液体流出2.8. 向沉淀物中加入70汇醇3mL不打散沉淀洗涤一遍。12000r/min 离心5min,弃去上清液，将离心管倒置于纸巾上，室温干燥。2.9. 将DNA沉淀溶于ImLTE缓冲液中，加入RNase A (终浓度大于50 卩 g/mL)。37 T 保温 0.5 1h。3质粒DNA的纯化3.1. 将上述DNA溶液平分在2个1.5mL的微量离心管中，每管0.5mL,分 别加入等体积的Tris饱和苯酚溶液，混匀，7000r/min离心5min,取上层清液 到另一洁净微量离心管中。 离心后， 苯酚位于离心管的最下方， 蛋白质层位于中 间，溶解有质

14、粒DNA勺水层位于最上方。离心管从离心机里取出后，尽量减少晃 动，以免蛋白层污染DNA水溶液，使分界面模糊、不清晰，不利于下一步分离。 使用苯酚等有腐蚀性的有机溶剂时， 一定要戴橡胶手套， 注意安全。 一旦皮肤被 苯酚等污染，立即用大量水清洗。3.2. 加入等体积苯酚 :氯仿( 1:1 )混合液，混匀， 7000r/min 离心 5min， 取上层清液到另一洁净微量离心管中。3.3. 加入等体积氯仿溶液，混匀，7000r/min离心5min,取上层水相到另 一洁净微量离心管中。3.4. 加入 2倍体积的无水乙醇， 1/10 体积的 3mol/L NaAc 溶液，混合均 匀，于-20 C沉淀0.

15、5h以上。沉淀质粒DNA可采用无水乙醇，需在低温条件下静 置。由于细胞裂解时同时释放出一些酶类， 低温条件可保证DNA水解酶类保持在 低活性，以减少其对DNA的降解。用70%勺乙醇洗涤质粒DNA沉淀，主要目的是 利用乙醇中的水分溶解残余盐类等杂质。在加入 RNaseA前洗涤去盐类，可保证 酶活不受其影响。3.5. 12000r/min离心15min,收集沉淀，弃去上清液并干燥。3.6. 在沉淀 DNA中，加入 70%乙醇200卩L,不打散沉淀洗涤一次， 12000r/min离心1min，小心弃去上清液，将离心管倒置于纸巾上使所有的液体 流出，室温干燥。3.7. 用50卩L TE溶液重新溶解DN

16、A温和震荡几秒钟，备用。溶解沉淀 时，为获得最大量产品，应逐滴加入溶剂，边加边摇；尽量少转动离心管，避免过多样品粘于壁上导致损失。4 DNA 纯度检测（ 0.9%琼脂糖凝胶电泳法）4.1. 制板4.1.1. 称量0.36g琼脂糖，放入锥形瓶中，加入 40mL 1X TAE缓冲液，在 微波炉中加热，使琼脂糖融化。4.1.2. 待凝胶温度降至大约55C以下（手持瓶子不烫手，即感觉热但能握 得住）。4.1.3. 在模具上插入一个合适的梳子形成加样孔（如果待回收的DNA体积较大时，可用透明胶带将几个相邻的梳齿封住，使之形成较大的孔） 。梳齿的位 置应在托盘底面上0.51.00mm,这样琼脂糖浇灌到托盘

17、时将形成符合要求的加 样孔。4.1.4. 将凝胶倒入准备好的制胶模具中，等凝胶完全冷却凝固后变成乳白 色不透明状（月30min）,将梳子轻轻拔出。4.1.5. 用拇指和食指轻移胶版两侧，将凝胶体放入加有TAE缓冲液的电泳槽中，并且使电泳缓冲液高出凝胶表面。4.2. 电泳4.2.1. 取3卩L质粒样品+1卩L电泳载样液，在塑料薄膜上用微量移液管吹 吸混匀， 加入到凝胶孔中， 枪尖应没入液面但在凝胶面上方正对点样孔处。 吹洗 法混匀少量液体时需注意避免产生气泡， 增加操作难度和误差。 用微量移液器吸 进液体时应该小心， 避免产生气泡；吹出液体时， 不要将液体从针尖口完全吹出， 要留一滴在针尖口处，

18、可预防气泡的产生。同时，溶解沉淀时，针尖应该在沉淀 的最高处吹吸，可使沉淀慢慢溶解， 不至于损失。注意，在塑料薄膜上混匀 buffer 和DNA羊品时，枪尖不要太倾斜，以免吹走液滴。4.2.2. 取适量上样缓冲液和一定量的待分离纯化的DNA羊品（如酶切产物、PCFT物等）滴在塑料薄膜上，混合均匀后一同加入到凝胶孔中，样品应沉于孔底（混合液比重大）。此外，在相邻的加样孔中加入合适的 DNAMarker （如入/Hind III 3 卩 L）。4.2.3. 点样完成后，盖好电泳槽盖子，选择适当的电泳压（一般是5V/cm）以及电泳方向，打开电源开关，开始电泳，DNA羊品从负极向正极移动4.24 当前

19、沿DNA接近胶的前端时，切断电源，停止电泳（大约1h, 100V , 打开槽盖。4.2.5. 用溴化乙锭染色10min后，用凝胶成像仪观察，记录结果。六、【实验结果及分析】实验结果图：图1各组质粒DNA电泳条带结果分析：1、 从胶的左边开始，各条带分别是：（1）pUC19（ 2）DNAmarker（3）-（ 14） 为各组提取的质粒DNA带2、从左开始第三条带是我们组的电泳带。以左边第二条为例，从上到下依次 是：蛋白质，染色体DNA杂带，开环质粒DNA带，线形质粒DNA带，超螺旋质粒 DNA带（主带），RNA带。3、 由图可见，我们组提取的质粒 DNA羊品中，染色体DNA蛋白质带明显比 其他一

20、些组和marker带亮，说明抽提的不太干净，含少量杂蛋白，纯度不高。原因是在纯化的过程中未能将蛋白质除尽， 吸取上清的时候也可能带进少量的蛋 白质。4、我们提取出的质粒DNA中开环质粒DNA和线性质粒DNA勺电泳条带不清晰， 由亮度可知含量也较少。相对来说，开环质粒DNA的含量比线性的要多一点。而 超螺旋质粒DNAt相对于其他组较暗，说明所提取的该质粒含量较少，操作不如其他组规范，损失了部分 DNA。七、【实验总结】我们组提取的质粒 DNA 的数量和质量不够理想，掺杂了少量的蛋白质与染 色体 DNA ，而所要提取的超螺旋质粒 DNA 含量较少，原因是多方面的，其一是 在质粒提取的过程中，用碱处理时，染色体 DNA 可能没有完全被打散；其二是 质粒纯化的过程中， 吸取上清液时混入了蛋白质， 且操作次数少， 蛋白可能有部 分没有变性。