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1、连接反应总体积为10 a L,体系组成如下:回收纯化的PCR扩增目的基因片段7.0aL10X Ligation buffer1.0aLT 载体( 10ng/ a L)1.0aLT4 DNA ligase1.0aL共 10.0ul混均后，4C连接18-24小时，连接所得克隆载体命名为TA-VP4-STI。 转化操作方法1）取一管-80C保存的感受态细胞，置冰上融化；一次转化感受态细胞的建议用量为 50-100ul,应注意所用DNA体积不 要超过感受态细胞悬液体积的十分之一。以 100ul 为例:2）加入连接物（50ul的感受态细胞能够被1ng超螺旋质粒DNA所饱和），轻轻旋转离心管以混匀内容物，
2、冰浴 30min；3）将离心管置于42C热击60-90秒，然后迅速置冰浴2-3分钟，该过程不要摇动离心管；4）向每个离心管中加入500ul液体LB培养基（不含抗生素），混匀 后置于37C摇床振荡培养45分钟（150转/分钟）；目的是使质粒上 相关的抗性标记基因表达，使菌体复苏。5）将离心管内容物混匀，吸取 100ul 已转化的感受态细胞加到含相 应抗生素的LB固体琼脂培养基上（含50 ug/ml氨苄青霉素），用无 菌的弯头玻棒轻轻将细胞均匀涂开。将平板置于室温直至液体被吸收，倒置平板，37C培养12-16小时。至红、白斑区分明显为止。涂布用量可根据具体试验来调整：如转化的DNA总量较多，可取更
3、少 量转化产物涂布平板；反之，如转化的DNA总量较少，可取200-300ul 转化产物涂布平板。如果预计的克隆较少，可通过离心（4000rpm,2min）后析除部分培养液，悬浮菌体后将其涂布于一个平 板中。（涂布剩余的菌液可置于 4C保存，如果次日的转化菌落数过 少可以将剩下的菌液再涂布新的培养板）注意事项：1、感受态细胞应保存在-70C，不可多次冻融和放置时间过长，以免 降低感受态细胞的转化效率。2、进行转化操作时，应根据相应温度及无菌条件的要求进行。3、为防止转化试验不成功，可以保留部分连接反应液，以重新转化， 将损失降到最低。4、氨苄青霉素(Amp)：使用前用无菌纯水配制母液，浓度为50mg/mL
目的基因片段与克隆载体质粒的连接操作步骤
