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1、4. 应用 ModFitLT 软体分析 DNA 直方图4.1 概述ModFitLT 是由美国 VeritySoftwareHouse 公司设计，专门用於流式细胞术中进行细胞周期分析的软体。它通过对 DNA 含量直方图进行曲线拟合，能快速计算出分析细胞周期各时相细胞的含量、G1/S/G2M 细胞的百分比，并测量肿瘤细胞的 DNA 指数DNAIndex、及析凋亡细胞亚二倍体所占的比例。此外，2.0 版本还增加了“同步化分析”和“增殖分析”的功能，可分别进行同步化细胞和增殖细胞的研究SynchronizedorDrugPerturbedCells，对於研究凋亡细胞生物学与药理的同仁，实为一大利器。本
2、软体有苹果电脑与 PCWin98/NT 两种版本，皆内建有 65 种数学模型，可弹性运用以因应不同的 DNA 直方图分析。从事直方图分析时ModiFitLT 软体允许使用者应用四种基本方式操作:1AutomaticAnalysis2ManualAnalysis3Synchronization 精灵4Proliferation 精灵。 以下之范例练习可让您熟悉 ModiFitLT 软体的四种基本分析功能， 我们将以四个已储存之数据档案来练习 DNA 直方图之分析。这四个数据档案之档名及样品资料如下：档案名样品SampleLM.FCS4.2 自动分析1. 从苹果功能表下进入 ModFitLT 以启
3、动该软体，并在随后出现的对话方框上按 OK 。ModFitLT 软体有一套 S 期评估功能，可以依照您所制定的范围，评估该样品中 SPhase 比例是属於少量、中度或多量的，并在报告中显示出可信度。软体若还没有被实验室其他人设置过，那麽当你进行分析时，将会出现一个关於S 期评估的询问方框，提供了 3 个选项：马上设置 S 期的临界值；以后再提醒我设置 S 期的临界值；不需要启动 S 期评估这项功能。若你需要这项评估，你必须输入你们实验室获得的具有统计意义的各种组织的二倍体或者异倍体的 S 期的临界值， 如没有，则不必启动这项功能。暂时关闭 Sphase 评估功能2. 从 Editmenu 指令
4、板中选择 SPhaseCutoffs，并将ActivateAssessmentSystem 改成，以取消 SPhase 评估功能。软体中虽有预设值，但各医院医检师必须键入自定的范围才能有真实的评估功能，因此软体一般会在分析数据时，要求使用者”EntryyourownSPhasecutoff.”。在此练习中，我们先暂时关闭此一功能。3. 按 OK 表示接受此一选项。开启一数据档案4. 在工具板中点击 File 钮以开启档案。并在随后出现的 OpenFile 对话方框上寻找 Sample1m.fcs 数据档案，路径为 MacHD:/BDApplication:/ModFitfolder，快按两下以
5、开启该档案匣。5. 选择该档案匣中 SampleLM.fcs 数据档案，并选择 Open 以载入此档。6. 在 ChooseParameterForAnalysis 对话方框中选择 FL2A 为 DNA 参数，点击 OK。7. 如果想要圈选单一细胞，点击 DefineGate1 。8. 在随后出现的 DefineGateParameter 对话方框中选用 FL2W 为 X 参数项， FL2A为 Y 参数项。点击 OK。9. 修改多角形区域以包含所有单一细胞参考下页之范本 。点击 OK 表示接受此一区域设定。10. 再按一次 OK 。软体会从指定的磁碟中读入SampleLM 的 DNA 数据，我
6、们已准备好了可以进行数据分析。11. 在工具板中单击 Auto 键。此指令要求软体去执行自动分析功能。它会去扫描 DNA 直方图，定出尖峰位置，确定倍体，选择一最适合的数学函数来进行非线性的最小二乘法分析（nonlinearleastsquareanalysis），最后显示结果，而所有这些分析过程仅须几十秒钟的时间。Channels04080120160200Number040080012001600ModFitLTV2.0Win32Dateacquired:18Jan1995File:Samplelm.fcsSource:samplelm.fcsCase:PATIENTIDAnalysist
7、ype:AutomaticanalysisPrep:Fresh/FrozenDIPLOID:100.00DipG0G1:61.14at76.29DipG2M:9.49at150.53DipS:29.36G2/G1:1.97DipCV:2.24TotalSPhase:29.36ExtraPop:Debris:1.18Aggregates:0.00ModeledEvents:11444RCS:1.839DiploidB.A.D.:0.58noaggsSPhaseAssessment:TissueType:BreastModeltype:DiploidDiploidS:HighCalculatedp
8、value:p选择倍型：异倍体，二倍体，四倍体；Diploid：样品中只有一群细胞；Aneuploid：样品中除了正常细胞外，含有异倍体肿瘤细胞。圈选此一选项应在 OneAneuploid 或 TwoA选其一；Tetraploid：样品中除了正常细胞外，还有一群双套细胞。NoAggrogate/aggrogate 选择细胞聚集体分析模式： 用来告知软体样品中是否含有细胞团块， 选 如果您没有把握， AutoDetect（软体自行判断有无需要拟合聚集体） ；NoDiploidS/Diploid 告知软体在 Diploid 细胞族群中是否存在有 SPhase 细胞：如异倍体的 G0/G1 期峰与二
9、倍体 G0/G1 期峰明显分开我们对每一个细胞周期的 S 期都能够进行拟合，则选择 FitDiploidS；如异倍体的 G0/G1 期峰与二倍体 G0/G1 期峰靠得非常近，则选择 NoDiploidS；Visible/IndistinctG2M：选择能否看得见明显的 G2/M 期峰（软体将自动把 G2/M 期峰的位置固定在两倍於 G0/G1 期峰的位置；FitApoptosis/NoApoptosis 选择是否拟合凋亡（告知软体，DNA 直方图第一个峰是Apopsis 造成的 SubG1 峰） ；选择有无标准参照物：NoStandards，OneStandard，TwoStandards，告
10、知软体样品中，有掺入已知 DNA 含量的标准品，如鸡红血球，其预设位置为 DNA 图中的首峰。 ；根据这些资料，软体选择分析的模式并将其显示在对话窗的下部；单击 OK 确认并关掉对话窗。1. 按工具列上的 Range 钮。此时软体会尝试确认每个峰所在的位置，并将Range 放置於不同的峰上，一般而言，这些定位范围是不须调整的，如若软体对於各个峰的确认不太正确，你可依下表移动 Range，将其放在正确的位置：A1 肿瘤细胞之 G0/G1 峰；移动 A1 将其放置在异倍体 G0/G1 峰的中心位置。A2 肿瘤细胞之 G2/M 峰；移动 A2 将其放置两倍於异倍体 G0/G1 峰的道数，即异倍体G2
11、/M 期的位置。D1 正常细胞之 G1/G1 峰；确认 D1 是否在二倍体的 G0/G1 期峰上，这个 Range 不一定将整个峰都包括在内，只要在峰的中心位置即可。D2 正常细胞之 G2/M 峰；移动 D2 将其放置於二倍体 G2/M 期峰的中心位置或是两倍於 G0/G1 期峰的位置。E1 将 E1 放置在碎片峰的起始，应从原点延伸至首峰之根部。E2 最后，需要将 E2 放在这个直方图的最右边，用来识别碎片的终止位置。G1 第二群异倍体肿瘤细胞之 G0/G1 峰或双套肿瘤细胞之 G0/G1 峰。G2 第二群异倍体肿瘤细胞之 G2/M 峰或双套肿瘤细胞之 G2/M 峰。T1 如果 DNA 直方
12、图有 T1 出现，你可以不去移动它的位置，它只是用来启动软体分析聚集体的功能。Apop 凋亡细胞之 SubG1 峰。2. 这样，各个 Range 都各就各位了，可以开始进行资料分析了。3. 单击工具板中的 Fit 键，软体开始以最小二乘法来拟合曲线（nonlinearleast ，并进行统计。squaresfit）4. 分析完毕后，你需要检查一下分析图，以确保分析模式很好地拟合你的样本，如果不是，最好确定你的分析模式选择是否恰当，以及 Range 的放置是否正确。5. 此时可编辑报告形式、储存、或列印报告。4.4Synchronization 同步化精灵2.0 版本的 ModFITLT 软体增
13、加了分析细胞系的同步化程度的功能。先启动软体并暂时关闭 Sphase 评估功能: 重复范例练习一之步骤 13.开启一数据档案: 重复范例练习一之步骤 410.开启 Synchronization 精灵8. 打开 Analysis 功能表，点击 SyncWizard键，选择 Createoreditmodel 这时出现一个对话窗，引导你根据你的样本的特殊性选择不同的分析模式。9. 首先你要选择的是：重新建立一个同步化分析模式还是修改原有的模式；然后打开所要分析的样本的原始资料。分析模型之设定10. 点击工具板中的 G0G1 键，确定 G0/G1 期峰的位置，以及标准偏差；软体还允许你锁定峰的位置
14、或是在一定范围内自动调节；11. 点击工具板中的 G2M 键，确定 G2/M 期峰的位置，或是 G2/G1 的比值；12. 点击工具板中的 SPhase 键，选择用於拟合分析 S 期的图形的形状、数目及图形与图形之间的间隔；预设值为 5 个等聚的梯形函数。13. 点击 Other 键，选择是否需要分析碎片和聚集体；14. 点击 Report 键，选择报告的内容，例如是否报告所有部分的百分比，是否需要平均值，是否需要 G0G1 峰的CV，是否需要关於统计学方面的一些结果等等。15. 我们现在可以开始进行资料分析了。再同步化精灵方框中点击 Analyze 键，精灵便会依您所设置之拟合条件进行资料分
15、析，报告应与前面图例相类似。调整分析用模型如果您觉得分析的结果不完美，可以改变分析用数学模型。假定您希望三个 SPhase 函数来定量早、中、晚 S 期细胞比例，并且改用梯型函数，而非长方型函数来分析数据，你可以修改。20. 点击精灵工具板上第二键，SynchronizationWizarddialog 会出现。OntheStarttabtheWizardhasswitchedfromCreatetoEditthecurrentsynchronizationmodelautomatically. 可以改变分析用数学模型。21. 点击 SPhase22. 将 NumberofCompartmen
16、ts 从 5 改成 3.，再点击 Analyze 键，软体会重新分析资料，产生报告（新报告中 S 期细胞只有三组） 。开启并分析另一组数据23. 点击精灵工具板上第一键，会出现 Open 对话方框。24. 在硬碟中寻找下一笔资料，点击 Open 以叫出资料档。资料一被同步化精灵叫出，便会自动进行分析、产生报告。25. 重复上一步骤直到所有资料都分析完毕。26. 点击精灵工具板上第三键退出同步化精灵功能，点击 Yes 确认之。4.5 运用 ModFITLT 进行细胞增殖分析ModFITLT2.0 可对用跟踪染料染色的细胞系进行增殖状况的研究。1. 进入 ModFITLT 软体，点击工具板中的 F
17、ile 键，选择将要分析的资料档案；2. 选择 FL2H 作为 DNA 分析的参量；3. 打开 Analysis 功能表，点击 ProliferationWizard 键，选择 Createoreditmodel。4. 这时出现一个对话窗，引导你根据你的样本的特殊性选择不同的分析模式。5. 首先你要选择的是：重新建立一个同步化分析模式还是修改原有的模式；6. 点击工具板中的 Parent 键，确定代表亲代群体的峰的位置；7. 点击 Generations，选择所要分析的子代的数目，样本获取的细胞数，以及子代和子代之间的间隔；8. 点击 Other，选择是否需要分析背景噪音及不对称的细胞分裂；9. 点击对话窗中的 Analysis，软体自动开始分析，并给出结果。结果中包括亲代所占的百分比和平均萤光道数，各个子代所占的百分比和平均萤光道数，增殖指数，非增殖部分的比率，分裂错误指数，子代之间的间隔，背景噪音占的比率，用於分析的细胞数及 RCS 值等等。
细胞周期分析软件modfit lt操作说明
