结核分枝杆菌效应T细胞检测试剂盒上海铭源数康生物芯片有限公司

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1、结核分枝杆菌效应 T 细胞检测试剂盒（酶联免疫斑点法）说明书【产品名称】通用名称：结核分枝杆菌效应 T 细胞检测试剂盒（酶联免疫斑点法）英文名称： Diagnostic Kit for effector T cell to Mycobacterium tuberculosis （enzyme-linked immunosorbentspot, ELISPOT ）商品名称： FS-Spot【包装规格】 32 人份/盒【预期用途】本产品采用酶联免疫斑点（ ELISPOT ）法检测并计数人新鲜外周静脉抗凝血分离所得淋巴细胞中结核特异抗原刺激活化的效应 T细胞，适用于临床疑似结核病的辅助诊断。细胞免疫

2、是结核菌感染后机体的主要免疫形式。 人体内的 T细胞受结核抗原刺激致敏， 形成活化的效应T细胞，结核病患者外周静脉血中存在结核分枝杆菌特异的效应 T细胞。这些 T细胞在体外受到结核分枝杆菌特异性抗原刺激后可分泌细胞因子 干扰素（ Interferon ，IFN- ）。结核菌素试验仍是国内临床上诊断结核病的常用手段， 以PPD试验为主； ELISPOT 试验和 -干扰素检测是目前最新的产品形式， ELISPOT 技术因具有灵敏度高、单细胞水平，活细胞功能检测、操作简便经济，可以进行高通量筛选的优点而迅速被用于免疫学检测领域。【检测原理】从全血中分离出来的 T 细胞，经过洗涤排除本底干扰并通过计数

3、保证标准数量的待测细胞，在体外培养过程中受包含 ESAT-6 和 CFP 10 两个特异性片段的重组融合抗原刺激后分泌 IFN- 。ELISPOT检测是高灵敏度的，在细胞分泌的细胞因子 IFN- 扩散稀释前，直接被反应板上预包被的高亲和力、高特异性的 IFN- 单抗捕获， 通过加入生物素标记的抗体结合 IFN-的不同抗原决定簇， 并且通过碱性磷酸酶标记的链亲和素结合生物素进行一步放大作用， 显色底物溶液在原位被酶分解形成深蓝色斑点。每一个斑点代表一个 干扰素分泌细胞（结核特异的效应 T 细胞）。通过对斑点计数可以判断体内是否存在对结核杆菌敏感的效应 T 细胞。本产品选用的结核分枝杆菌特异性刺激

4、抗原为基因工程重组 ESAT-6 -CFP10 融合抗原，该抗原在在卡介苗菌株及大部分环境分枝杆菌中缺失， 因此不受卡介苗接种和大部分环境分支杆菌感染的影响。但据文献报道当感染 堪萨斯分枝杆菌 (M.kansasii) ，苏尔加分枝杆菌 (M.szulgai) ，海氏分枝杆菌(M.marinum) 戈登分枝杆菌 (M.gordonae)时，用本产品同类试剂盒检测有可能存在交叉影响。但是在国内鉴别诊断为这些分枝杆菌感染的病例极少，很难获得相关病例。本产品检测样本要求为新鲜外周静脉抗凝血，不能长时间保存，因而本产品未作此类分杆菌交叉影响的研究。【主要组成成份】1、本试剂盒提供的材料1、反应板 96

5、 孔 由 128 孔板条组成， 32 人份/盒，包被有小鼠抗人 -干扰素单抗2、特异性刺激抗原 1.8ml 1 瓶 主要成分为结核特异重组抗原，血清白蛋白和抑菌剂3、阳性对照刺激物 1.8ml 1 瓶 主要组分为植物血凝素 PHA ，血清白蛋白和抑菌剂4、浓缩标记抗体 60l 1 管 含有生物素标记的小鼠抗人 -干扰素单抗5、浓缩酶结合物 60l 1 管 含有碱性磷酸酶标记的链亲和素6、浓缩洗涤液 50ml 1 瓶 主要成分为磷酸盐缓冲液、表面活性剂7、显色液 6.0ml 1 瓶 含 5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸（ BCIP ）和氯化硝基四氮唑蓝（ NBT ）2、不同批号的试剂盒组分不得混用或

6、互换。3、本试剂盒未提供但实验所需的设备及材料上海铭源数康生物芯片有限公司 7-1II 级生物安全柜（推荐）或洁净工作台淋巴细胞分离：人淋巴细胞（ PBMC ）分离液（推荐使用 GE 的 Ficoll-PaqueTMPlus）或者淋巴细胞分离采血管（推荐使用 BD 的 CPT 管）水平离心机：离心力能达到 1600g，温控（ 18-25）PBMCs 计数设备和试剂：使用血球计数板及台盼兰在显微镜下计数或者全自动血细胞计数仪细胞培养箱： 371，5%CO2洗板设备：合适的自动洗板机或者手动洗板放大镜（ 10 倍）移液器及消毒的加样吸头、 EP 管无菌的细胞培养基：细胞培养基（ RPMI-1640

7、 ）、无血清培养基（ AIM-V ）PBS 缓冲液（ pH7.4）双蒸水或去离子水【适用仪器】校正视力目测或放大镜（ 10 倍）条件下目测。【储存条件及有效期】28冷藏保存，有效期为 12 个月。开封后各组分需在 2 个月内使用完毕，且不超过成品有效期，具体日期详见包装盒。【样本要求】1.标本采集： 使用新鲜肝素锂或柠檬酸钠抗凝的真空采血管无菌抽取待检人员外周静脉血 4-5 ml ，颠倒使抗凝液和血液混匀待用；放置室温（ 18-25）小于 4 小时，勿冷冻或冷藏。注：每个实验室应确定 PBMC 的收集与分离程序，以获得足够数量和活力的 PBMC 。我们建议按以下方法收集与分离 PBMC 。2.

8、 外周血单个核细胞（ PBMCs）的分离： 分离淋巴细胞必须严格无菌操作（1）将含抗凝血的采血管颠倒混匀避免血液分层。（2）按 2-3:1 的比例将抗凝血缓缓加入到含淋巴细胞分层液的灭菌离心管中 , 形成明显界面 ,在室温下 1000g 离心 20 min；或按淋巴细胞分离液使用说明书进行操作，可见外周血单个核细胞（ PBMC ）存在于云雾状层中。3. 外周血单个核细胞的洗涤与记数： 每个检测孔必须加入 25 万个淋巴细胞，错误记数会导致结果的不正确（1）吸取淋巴细胞层至灭菌离心管中。（2）加入预热至 37的 RPMI-1640 培养液 8 ml，轻轻吹打混悬后，于室温下 600g 离心 10

9、 min。（3）弃去上清，加入预热至 37的 RPMI-1640 培养液 6 ml，轻轻吹打混悬后，于室温下 600g 离心8 min，弃去上清。（4）加入 250l 预热至 37的无血清培养基重悬细胞沉淀。 取 10 l 细胞悬液加入 40 l 0.4%台盼蓝，混匀后取 10 l 台盼蓝混合细胞液加入血球计数板， 在显微镜下计数， 然后用预热至 37的无血清培养基配制浓度为 2.5 106 个/mL 的细胞悬液至少 300l 待用。上海铭源数康生物芯片有限公司 7-2【检验方法】1.加样及培养： 加入刺激物、培养必须严格无菌操作每份待测样本需 3 个反应孔： 1 个空白对照孔和 1 个阳性对

10、照孔必须同每个样本的检测一起进行。（1）取出实验所需数目的反应板条、特异性刺激抗原、阳性对照刺激物平衡至室温待用，未用的板条连同干燥剂放回封口袋及铝箔袋中。（2）在反应孔内加入下列试剂：50 l 无血清培养基至每个空白对照孔；50 l 阳性对照刺激物至每个阳性对照孔；50 l 结核杆菌特异性刺激抗原至每个检测孔；（3）每孔加入 100l 配制好的浓度为 2.5 106 个/mL 的细胞悬液， 使得每孔加入的细胞数量为 2.5105个。（4）将反应板放入湿润的培养箱在 37、5% CO2 培养 18-20 小时，培养期间避免移动、碰撞培养箱。2.斑点形成及计数： 不需要保证无菌操作（1）计算实验

11、所需用量，用 PBS 稀释浓缩标记抗体及浓缩酶结合物（ 1：200 稀释）成工作液，现配现用；用双蒸水或者去离子水稀释浓缩洗涤液（ 1：10 稀释）成 1 洗涤液。（2）将反应板取出， 弃培养上清液， 加入 200 l 4预冷的双蒸水或者去离子水裂解细胞 10 min（-20放置 5 min ，然后 4放置 5 min ），用 1 洗涤液洗板 7 次，200 l/孔，1min/ 次，最后一次洗板后拍干。（3）在每个孔中加入 100 l 标记抗体工作液，置 37孵育 1 小时。（4）弃液体，用 1 洗涤液洗板 5 次，200 l孔/ ，1min/次，最后一次洗板后拍干，加入 100 l 酶结合物

12、工作液，置 37孵育 30min。（5）取出显色液，平衡至室温。（6）弃液体，用 1 洗涤液洗板 5 次，200 l 孔/ ，1min/ 次，最后一次洗板后拍干，每孔加入平衡至室温的显色液 50 l，置 37闭光显色 15 分钟至斑点大小肉眼清晰可见，如下图 1 所示：图 1：实验结果示意图（7）可见板底显示蓝紫色斑点， 用双蒸水或者去离子水洗涤反应孔以终止反应， 将板放入 37烘箱干上海铭源数康生物芯片有限公司 7-3燥 4 小时或者室温干燥过夜。（ 8）计数着色的斑点，每一个点代表一个分泌 干扰素的 T细胞。质量控制1.通常正常结果，空白对照孔没有或有很少的斑点而阳性对照孔斑点数超过20

13、个。2.空白对照孔斑点数超过20 个有可能是污染造成，建议重新采集标本检测。3.当阳性对照孔斑点数少于 20 个时，结果判断应慎重，参见【检验结果的解释】 。结果判断空白对照孔斑点数阳性对照孔斑点数检测孔斑点数 -空白对照孔斑点数结果判定 16 阳性结果 20 11、 12、 13、 14、 15 灰区（建议重新检测） 11 阴性结果13 16 阳性结果2011、 12、 13、 14、 15 灰区（建议重新检测） 11结果无效，建议重新检测空白对照孔 阳性对照孔 检测孔斑点数结果判定斑点数 斑点数13空白对照孔斑点数 20 2020（检测孔斑点数） 2（空白对照孔斑点数） 阳性结果（检测孔斑

14、点数） 2（空白对照孔斑点数） 阴性结果（检测孔斑点数） 2（空白对照孔斑点数） 阳性结果 结果无效（检测孔斑点数） 2（空白对照孔斑点数） 建议重新检测空白对照孔斑点数结果判定 20结果无效，建议重新检测注：若阳性对照孔斑点数小于空白对照孔斑点数，则质控系统无效，结果无效，建议重新检测。【参考值参考范围】本产品检测结果参考值为 13 个斑点；当（检测孔斑点数）减去（空白对照孔斑点数）为132时，被定义为“灰区” 。【检验结果解释】1.“阳性 ”结果说明样本中存在针对结核杆菌的效应T细胞。2.“阴性 ”结果说明样本中可能不存在针对结核杆菌的效应T细胞。3.阳性对照孔斑点数应当超过20 个或遍布

15、整个反应孔（斑点数量太多） 。当阳性对照孔斑点数少于 20个时，除非检测孔根据结果解释和判断标准确定为“阳性 ”，那么此检测结果有效，否则建议重新采集上海铭源数康生物芯片有限公司 7-4标本进行检测。4.基于生物学和反应体系的原因，当（检测孔斑点数）减去（空白对照孔斑点数）为 132 时，此结果被定义为“灰区” ，应当利用所有可利用相关的临床信息进行判断。建议重新采集标本复查。【检验方法的局限性】1.仅供专业人士使用。2.本产品仅用于体外辅助诊断， 其结果解释仅为整体临床情况的一个参考， 临床医生需结合受试者的症状、体征或其他实验室和影像学结果等进行综合判断。3.改变细胞吹打、洗涤、计数方法、

16、孵育时间或温度，可能影响最终的结果，因此尽量避免。4.检验结果阳性不能完全确定受试者体内存在针对结核分枝杆菌的特异性细胞免疫反应； 检验结果阴性并不能完全排除受试者体内不存在针对结核分枝杆菌的特异性细胞免疫反应。5.本产品临床试验已验证的人群为成年人（包括老年人）。免疫功能丧失（ T 细胞丧失分泌功能）人群不能用本品检测。6.本产品不适用于区分潜伏性感染和活动性结核；不适用于判断结核病的严重程度或疾病进展情况。7.检验结果出现假阳性， 可能是该检测者为结核潜伏感染者， 也可能是样本被污染或操作不当； 检验结果出现假阴性，可能是该检测者的淋巴细胞功能异常，或者操作不当。8.据文献报道9 当感染堪

17、萨斯分枝杆菌 (M.kansasii) ，苏尔加分枝杆菌 (M.szulgai) ，海氏分枝杆菌(M.marinum) 戈登分枝杆菌 (M.gordonae)时，用本产品同类试剂盒检测有可能存在交叉影响。但是在国内鉴别诊断为这些分枝杆菌感染的病例极少，很难获得相关病例。本产品检测样本要求为新鲜外周静脉抗凝血，不能长时间保存，因而本产品未作此类分杆菌交叉影响的研究。当怀疑上述细菌感染时有必要进行鉴别诊断。【产品性能指标】经 1200 例临床试验表明，本品：灵敏度：本品对活动性肺结核病例检出灵敏度为 82.3% ，其中菌阳检出率为 88.3%，菌阴检出率为77.1%。特异性：为 84.0%，本品能

18、较好地区分活动性肺结核患者与正常人，肿瘤患者、非结核肺炎患者有部分交叉。精密度：用本品在同一块板上对同一样本进行 10 次平行检测，检测孔均为阳性，各孔斑点数 CV 不超过 25%。干扰性：临床样本中常见的干扰物（胆红素 0.1mg/ml 、血红蛋白 2.5mg/ml 、甘油三油酸酯 20mg/ml ）对本产品检测结果未有明显干扰，但为了保证试验结果的稳定可靠，建议临床尽量避免使用干扰性样本。使用三批本产品对类风湿病人的血样进行检测，特异性为 87.5%，结果表明类风湿因子对阴性样本的检测结果无明显干扰。【注意事项】1.使用前请仔细阅读使用说明书，不同批号的试剂组分不得混用或互换。2.未开封的

19、试剂盒存放在 2-8。开封后的各组分需在 2 个月内使用完毕，且不超过试剂盒标签上注上海铭源数康生物芯片有限公司 7-5明的有效期。试剂盒各组分从 2-8取出使用前需平衡至室温。3.采取血样时病人无须禁食。4.血液采集后应在 4 小时内使用， 全血样本勿冷藏或者冷冻。 通常情况下， 样本的采集和检测地点基本是相同的，不需长时间转移样本；如果需要异地转移，需在 18-25的条件下运输，时间应小于 4 小时。5.严格无菌操作避免试剂、检测孔、细胞悬液及培养基污染。6.残余的标本及所有接触人源性材料的物品均按生物危险品进行消毒处理。7.所有化学试剂均有潜在危险，应佩戴手套使用，并注意安全。【参考文献

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26、um Species Adds a Phylogenetic and Taxonomical Character.Journal of Bacteriology, Sept. 2009, p. 5865 5867, Vol. 191, No. 18.上海铭源数康生物芯片有限公司 7-6【生产企业】企业名称：上海铭源数康生物芯片有限公司地 址：上海市奉贤现代农业园区汇丰北路 699 号邮 编：201403电 话：021- 37196210（技术服务部） 传 真：021-37196289公司网站： http:/ www.health- E-mail ：datahealth-【医疗器械生产许可证号 】【 医疗器械注册证号 】【 产品标准编号 】【 说明书批准及修改日期 】上海铭源数康生物芯片有限公司 7-7