细胞培养中的黑胶虫问题
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1、文档供参考,可复制、编制,期待您的好评与关注! 细胞培养中的黑胶虫问题1.我们实验室最近一次的情况:我们前后从上海细胞中心买了三批细胞,细胞刚到的时候,观察均生长良好,密度适中,培养液清亮,也没有见小黑点,但是对细胞传代以后就陆续出现多少不等的小黑点,有时候在一夜之间暴长,给培养液加庆大霉素,也无济于事,对贴壁细胞用生理盐水及D-hanks液冲洗七遍后见减少,但是随后几天又出现,刚开始怀疑操作有问题,但是由有经验的老师操作也出现这种问题,陆续对培养液,血清及胰酶进行培养也没发现问题。同时培养箱也有本实验室保存的3t3细胞进行培养,生长快,很快铺满,仔细观察也可以见到少量的黑点。后来还有从军科院
2、过来的Hela细胞,没有使用我们的血清,直接吸出多余的培养液后,进行培养,传代后用原来吸出的培养液进行培养,同样发现了问题。可以发现如下的特点:(1)与细胞共生,细胞长的好或密度大的话,小黑点就少,反之则 多;(2)对抗生素无效; (3)可能通过培养箱空气进行污染;(4)单用培养液及血清培养没发现问题。(5)换掖冲洗后也无效。以下是论坛里我找来的相关帖子内容“黑胶虫”是近十几年才发现的一种细胞污染物,“黑胶虫”的分类目前尚无鉴定确认。“黑胶虫”可寄生于动物细胞,也可以生存于培养基中,依靠细胞和培养基中的营养为生,并随细胞传代而传代。“黑胶虫”与细胞竞争性生长,开始时对细胞并没有什么影响,但当黑
3、胶虫的数量多到一定程度的时候, 细胞生长就会受到影响直至死亡,严重影响了科研活动的开展和进行。所以“黑胶虫”的污染常在培养条件改变、细胞接种密度降低、细胞状态不佳时显现并使实验中断,尤其在冻存细胞复苏时可造成大量细胞死亡。目前比较公认的观点认为“黑胶虫”是一种微生物,增殖缓慢但对细胞有损害,数量达到一定程度可引起细胞死亡,其来源可能是细胞本身的污染或从动物取材时污染造成的。该污染在全世界细胞实验室中普遍存在,解决该问题是一个世界性难题关于是什么的问题的讨论 A.玻璃培养瓶中的类似氧化硅的东西(曾经有文献报道过)B.据说这是黑胶虫,又有人说是原生动物,好象也没个统一的说法C.据病毒所和军科院鉴定
4、是一种寄生于牛血清内的一种原虫,似乎和草履虫和变形虫有类似之处,然而由于课题经费不够而不能继续进行下去。D.有人说是纳米级的细菌其他的特点(1)形态上有些像细菌,直径约在0.51微米,(2) 在400X倒置显微镜小,有典型的布朗运动(不规则的原地小距离抖动)。(3) 细胞内好像也有存在,(4) 但并不引起培养液混浊(5) 时间稍长,细胞状态明显恶化,并最后死亡大家的处理:1.换好一点的血清(我觉着和血清的关系不大)。2.如果是贴壁细胞的话,可用无菌的PBS洗几次,可一定程度上缓解。若是悬浮的话,就不太好处理拉,可以向其中少加一点滋养细胞(从小鼠腹腔内取的巨噬细胞,这种细胞不分裂,过一阵就死掉了
5、,做抗体杂交瘤融合的同志肯定知道)。加滋养细胞对有黑胶虫的刚复苏的细胞很有效!还有就是实验环境要注意好,保持细胞间整个环境的洁净度。3.换用进口的一次性塑料培养瓶。4.建议清理无菌室所有物品,重新灭菌,用KMnO4熏蒸,按首次使用无菌室做,细胞重新复苏,。5. 在换液前先加入生理盐水并轻轻拍打,冲洗干净后再加入培养液,坚持天天洗,传代时加生理盐水再离心一次,接种密度稍大一些,一段时间后,虫子就会大大减少,对细胞的生长也不会有大的影响。6.有材料称minocycline具有一定的作用,可以和换液结合起来使用。 杀灭黑胶虫的一种方法估计养细胞者,很多人遇到过所谓的“黑胶虫”。最近养细胞,不幸的是,
6、也中奖了,看到培养瓶里仿佛一夜之间冒出来的密密麻麻的小黑东西,真是有苦难言,因为曾在园子里看过有关“黑胶虫”的帖子,不好对付,没有有效的杀灭方法,据说有专杀培养基,但又有什么好的方法可以消除实验室和培养箱内的污染呢?紫外照射、甲醛高锰酸钾熏蒸-这些方法不知其对“黑胶虫”的确切效果,有些对人有毒害,有没有一种方法,即能杀死“黑胶虫”,对人的毒性又较小呢?我想到了试试新洁尔灭(苯扎溴铵)是否可以,新洁尔灭是外用皮肤消毒剂,我们实验室常规用来擦洗手及工作台面的。首先说明这种东西在低倍下呈黑色点状,在高倍下呈杆状,确实是在不停地运动的,有些战友不相信它会动,也有人不相信有这种所谓的“黑胶虫”,只要静下
7、心来仔细盯住一点,你就会能注意到它确实在运动,我也录了一段相,足以可以证明,太大,160多M。题目:杀灭、处理黑胶虫的一种新方法目的:找到一种高效且低或无毒的杀灭处理“黑胶虫”的方法。方法:取有“黑胶虫”污染的六孔板,每孔内有2ml培养液,向有污染的孔内分别加入0.5ml、1ml、2ml、3ml的新洁尔灭原液,边加边在倒置显微镜下观察。结果:加入新洁尔灭时,培养液内逐渐变得有些混浊,且会有絮状的东西形成(肉眼看是白色的),这实际上是由“黑胶虫”聚集而成(见下面的图),约2-3分钟后,“黑胶虫”慢慢停止了运动。为了进一步观察其效果,把六孔板放入37度培养箱继续培养,第二天观察发现:有些仍成团絮状但不会动;有些贴在瓶壁上也不会动;有些已由杆状变成了圆球状,象是发生了水肿一样,更不会动了,估计“黑胶虫”已死亡。这几种剂量的新洁尔灭效果是一样的。结论:新洁尔灭与水或培养基的比例为1:4时即可杀死“黑胶虫”(更低的浓度没有试,当时杀虫心切,就想多用点,反正也不贵,一瓶新洁尔灭才7块多钱)。可以喷洒或擦洗用于实验室或培养箱内消毒;若细胞不珍贵且不想要了,也可以用来杀灭其中的“黑胶虫”。若细胞珍贵,不要轻易尝试,除非你不想要了;你试了,本人概不负责2 / 2
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