综述：大肠杆菌中重组蛋白的表达：进展与挑战

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1、精选优质文档-倾情为你奉上大肠杆菌中重组蛋白的表达：进展与挑战毫无疑问，重组蛋白在微生物中的表达革新了生物化学领域。以前，纯化少量的目的蛋白需要处理几千克的动物或植物组织，或是大量的生物体液，这个时代已经一去不返了。对于每个研究者来说，如果他要开始一个项目，需要某种纯化的蛋白。他马上就会想到，怎样通过重组表达的方式获得这种蛋白。目的重组蛋白的大量表达使人们能够对其生物化学性质进行分析，将其应用于工业并发展成为商业化产品。从理论上来讲，获得重组蛋白的过程相当直接：获得目的基因，克隆到表达载体，转入表达宿主，诱导，纯化。然而，实际上，事情通常并不是这样。宿主菌生长差，包涵体的形成，蛋白无活性，甚至

2、无法获得任何蛋白，这些都是实验中会遇到的问题。在过去，有许多综述详细地介绍了这个课题。综合来说，这些论文收集了2000多个例子。然而在重组蛋白表达纯化领域，一直都在进步着。因此，在本综述中，我们对本领域最近取得的进展做了评述。同时，对于那些那些对异源表达还不大熟练的研究人员，我们通过回答项目开始就需要解决的问题，提供的许多选择和方法，。这些选择和方法，在过去的几十年里，曾被成功的用来表达一系列的蛋白。问题一：选择哪种生物体作为表达宿主？整个过程的开始就是要选择宿主细胞，利用它的蛋白合成机制来获得珍贵的蛋白。宿主的选择决定了我们以后所需要的技术，包括各种分子工具，仪器或者试剂。在这些微生物体中，

3、现有的宿主系统包括细菌，酵母，filamentous fungi, 和 unicellular algae。他们各有优点和缺点，宿主的选择可能取决于我们要表达的蛋白。例如，如果目的蛋白需要翻译后的修饰，那么我们就要选择真核表达系统。在本篇综述里，我们主要详细介绍大肠杆菌表达系统。众所周知，利用大肠杆菌作为宿主具有很多优点。1.它有无可比拟的快速生长机制，在glucose-salts培养基中，以及在最优的环境条件下，它扩增一倍的时间大约是20分钟。这意味着以1/100接种的菌液在几个小时就可以生长至饱和。然而，需要注意，重组蛋白的表达可能对微生物体的造成代谢压力，导致菌体扩增大幅减慢。2.高浓度

4、细胞培养物较容易实现。在液体培养物中，理论的浓度估计最低大约是200g 细胞干重/l 或者11013个活力细胞/ml.然而，细菌在复合培养基中的指数生长是的它的浓度远没有达到这个值。在最简单的实验设置中（例如：37，在LB培养基中生长），细菌最高能长到11010/ml,还不到理论值的0.1%。因此，甚至为了获得重组蛋白，我们也需要一种高浓度细胞培养的方法以促进大肠杆菌的生长。作为一个重负荷机器的有机体，由于对其生理的深入研究，这些策略不断的出现。3.用一些廉价的成分，可以很容易的配制富营养的复合培养基。4 DNA的转化方便而且快捷。质粒转入大肠杆菌中甚至可以在5分钟内完成。问题二：选择哪一个质

5、粒?目前最普遍使用的质粒是复制子，启动子，选择标记，多克隆位点组合和融合蛋白以及融合蛋白切除策略多个因素组合的结果。因此，表达载体的种类是非常多的，人们常常不知道选择哪一个才好。想要做一个明智的决定，这些特征需要根据每个人的需要认真的评价。复制子基因单元如质粒能够自动的复制，都包含有复制子。复制子是由复制起点以及相关的反式作用元件。选择一个合适载体的一个重要的参考因素是它的拷贝数。拷贝数是由复制子控制的。通常人们会认为，高含量的质粒会得到更多的重组蛋白，因为细胞内存在大量的表达单位。然而，大量的质粒会造成代谢压力，减缓细菌生长，可能会是质粒变得不稳定，因此，能有效合成蛋白的生物体减少。所以，高

6、拷贝质粒无论如何不会提高蛋白产量的。通常使用的载体，例如pET系列载体，具有pMB1复制起点（ColE1衍生，每个细胞有15-60个拷贝），而在pUC系列中存在pMB1复制起点的一个突变的类型型（500-700个拷贝每个细胞）。ColE1复制起点（15-20个拷贝/细胞）的野生型存在于pQE载体中。这些复制起点是不兼容的，在同一个细胞内会相互竞争复制机制，所以他们不能在同一细胞内扩增。想要利用两个质粒进行双表达，可以使用带有p15A复制起点的表达系统（pACYC和pBAD系列载体，10-20拷贝/细胞）。三表达可以使用pSC101质粒，尽管这种情况很少。这个质粒受到复制子的严谨性控制，因此它的

7、拷贝数很低（100个拷贝/细胞），lacIQ应该克隆在表达载体上。pQE载体利用两个lac启动子序列来提高对T5启动子的控制。T5启动子是由大肠杆菌的RNA聚合酶识别。因为在含有tryptone或者peptone的富营养培养基中可能会含有诱导剂乳糖，在培养基中加入0.2-1% W/V的葡萄糖可以实验对表达的严谨型控制。另一个选择是选用以葡萄糖为碳源的defined培养基。在基于T7启动子的启动子中，渗漏表达可以通过与来自pLysS或者pLysE质粒的T7溶菌酶共表达来避免。采用含有严谨控制启动子的低拷贝质粒（例如araPBAD启动子）也是一个选择。拷贝数控制的一个有趣的离子是pETcoco载体

8、（Novagen）。这些质粒具有两个复制起点。oriS起点和它的控制元件，可以将pETcoco控制在每个细胞一个拷贝。然而，TrfA replicator激活中拷贝复制起点（oriV）而实现拷贝数的扩增（达到40拷贝/细胞）。TrfA基因是在同一个载体上，受到araPBAD启动子控制，因此拷贝数可以由阿拉伯糖控制。控制了本底表达之后，培养物应该是生长良好，直至诱导。此时，如果蛋白是有毒性的，细胞生长会停滞。在许多情况下，当达到并超过宿主容忍度，某个一个蛋白的毒性水平变得明显。在这种情况下，表达水平可以随意控制。使用Lemo21（DE3）菌株可以实现Tunable表达。这个菌种与BL21（DE3

9、）pLysS菌种相似，然而，T7溶菌酶是来自受到tunable启动子rhaPBAD控制的lysY基因。在高浓度的L-rhamnose糖存在下，会产生更多的T7溶菌酶，细胞内会有更少的T7RNA聚合酶，会表达更少的重组蛋白。为了确定最佳的表达条件，需要检测0-2000M L-rhamnose糖对表达的影响。相反，当采用IPTG作为诱导剂时，不能实现剂量依赖的表达，因为IPTG可以通过Lac透过酶或者渗透非依赖多肽途径激活转运进入细胞。而Lac透过酶的表达是异源的而且活性透过酶的数量是高度可变的，蛋白表达不会可预测地随着IPTG浓度变化。TunerTM（DE3）菌株（Novagen）是一个BL21

10、的衍生菌株，包含一个lac透过酶的突变（lacY），使IPTG均等地进入LacY细胞，使诱导在一个浓度依赖，均一的水平。同样，通过将lacOc替换野生型的启动子构建了一个大肠杆菌菌株，将lac启动子转换为一个连续的启动子。这个修饰避免了一部分细胞的瞬时的非遗传的LacY的表型，使诱导剂乳糖同步地进入。第二个修饰（gal+）可以使细菌完全利用乳糖作为碳源。有一点需要注意，tunable启动子可以被糖类诱导（乳糖，阿拉伯糖，rhamnose）。对于araPBAD启动子，通过补充不同浓度的阿拉伯糖，目的蛋白的产量可以增加100倍。这使人们错误地认为重组蛋白的合成水平可以随意控制。然而，蛋白表达水平随

11、着活性糖透过酶的多相性而改变，与LacY相似。因此，即使蛋白终产量可以控制，每个细胞的蛋白量是高度可变的，有些可以表达大量蛋白，而有些细胞根本没有蛋白。为了表达一些有毒性的蛋白，需要专门选择一些大肠杆菌的突变体。在一次对提高膜蛋白生产的Bl21（DE3）的衍生菌株的筛选分离中，Miroux 和Walker发现了C41(DE2)和C43（DE3）菌株。最近发现，以前在表达重组蛋白过程中阻止细胞死亡的未明确特征的突变体存在于lacUV5启动子。在BL21（DE3）细胞中，lacUV5启动子趋势T7RNA聚合酶的表达，但是在Walker菌株中在-10区的两个突变使lacUV5启动子回复到更弱的野生型

12、。这导致重组蛋白合成量更少（可能细胞耐受更强）。另一个解决方案是将蛋白从细胞中移除。分泌到周质或者培养基有时是唯一的生产重组蛋白的方法。周质表达的第一个选择是翻译后的Sec-依赖途径。将一个合适的前导肽融合到重组蛋白上，可以使蛋白运输到周质空间。广泛使用的用来分泌的信号肽包括：Lpp, LamB, LTB, MalE, OmpA, OmpC, OmpF, OmpT, PelB, PhoA, PhoE, 或者 SpA。也可以采用基于SRP（信号识别颗粒）路径的共翻译转运机制。SRP识别N端的疏水性信号序列。与膜受体FtsY相互作用之后，新生链和核糖体复合物被转运到SecYFG 转运酶。通过SRP

13、途径，二硫键异构酶I（DsbA）也被用来将重组蛋白转移到周质中。密码子偏好密码子偏好发生在外源编码DNA的同义密码子与宿主密码子有很大不同时。在合成全长重组蛋白时，低丰度的tRNA逐渐消耗净。这种缺失导致氨基酸错误的加入和/或产生不完整多肽，因此影响异源蛋白的表达水平和/或活性。表达重组蛋白要检查是否有密码子偏好问题时，可以使用很多免费在线应用来检测一段基因中的稀有密码子（molbiol.ru/eng/scripts/01_11.html, nihserver.mbi.ucla.edu/RACC/，等等）。稀有密码子是在大肠杆菌中使用频率在1%以下的密码子。解决密码子使用偏好问题有两个策略：外

14、源编码序列优化或者通过修饰宿主提高稀有tRNA的数量。密码子使用优化的原理是依照宿主密码子使用偏好修改目的基因中的稀有密码子。在这个过程中蛋白的氨基酸序列不能改变。这可以通过定点沉默突变或者重新合成整个基因或者一部分。通过沉默突变来优化密码子是一个费力的而且昂贵的过程，因此对于生产许多重组蛋白来说并不实用。另一方面，基因合成简单得多，因为他只需要从海量的组合中选择最合适的序列。改正密码子使用是一个棘手的事情。“一个氨基酸一个密码子”策略没有考虑到除了密码子稀少以外的影响蛋白表达水平的因素。例如，在细菌基因N端富含稀有密码子，蛋白表达实际上是增加的。这个原因并不在于密码子稀少而是RNA二级结构的

15、减少。另外，最近研究表明高水平蛋白表达主要（不仅仅）是由开放阅读框的解码数度决定（比如，核糖体翻译一个mRNA所需要的时间），尤其是当（快的）密码子处于mRNA的5端。这导至起始位点的核糖体快速的消失，因此新的核糖体遇到一个空的其实密码子并快速的参与到翻译当中。最后，一些密码子的组合可以形成类似SD的结构，导至翻译通过mRNA与翻译核糖体的16S rRNA杂交终止。沿着mRNA的翻译终止对蛋白折叠有有利的一面，因为它允许新合成的链形成合适折叠的中间构象。所有这些翻译控制机制对合成基因比例的设计构成了一个挑战。更新的算法应该考虑到5RNA结构，类SD结构的存在，起始位点核糖体的清空率和对共翻译折

16、叠有利的翻译缓慢区域的存在。另一方面，当细胞生产大量的蛋白（异源基因表达的蛋白），编码稀有密码子带电荷的rRNA成为决定蛋白表达的主要因素。低丰度的tRNA消耗导致核糖体停止，然后与RNA链脱离，导致不能产生全长的产物。几种菌株携带包含额外的tRNA基因的质粒可以解决这个问题。BL21(DE3)CodonPlus菌株（Stratagene）包含pRIL质粒（p15A复制子，可以与含有ColE1和类似ColE1复制起点这些最常用的表达载体兼容），可以提供AGG/AGA (Arg), AUA (Ile), and CUA(Leu)的tRNA基因。BL21(DE3)CodonPlus-RP (Str

17、atagene)修改了AGG/AGA (Arg) 和 CCC (Pro)的使用。Rosetta(DE3) 菌株 (Novagen) 和 TunerTMRosetta(DE3) 菌株 (Novagen) 是 TunerTM的衍生菌，含有pRARE质粒（p15A复制子），可以提供所有上面提到的密码子，另外还有GGA（Gly）。应该注意的是这些菌种的使用通常会提高蛋白表达量但是有时候会导致蛋白可溶性的降低。我们已经发现那些RIL（AGG/AGA,AUA, 和CUA）密码子含量超过5%的蛋白在Codon-plus菌种中表达时可溶性较差。在这些宿主中，有RIL密码子导致的翻译终止可能无效，导致翻译速度提

18、高，最终导致蛋白聚集。分批培养的制约因素当重组蛋白的表达量很低，通过不同的机制也无法提高，那么目的蛋白的量可以通过使培养基达到更高的浓度来放大。这可以通过改进几个参数来实现，比如培养基成分和通过剧烈的摇动来提供更好的通气。LB培养基是培养大肠杆菌使用最多的培养基。这种培养基容易配制，富含营养成分，其渗透压对于细菌对数后期的生长是最优的。所有这些特征使LB培养基足够适用于蛋白表达，虽然它并不是获得高浓度培养物的最佳选择。这是因为LB培养基中碳水化合物（和其他可用的碳源）和二价阳离子的含量非常少。理所当然，增加胰蛋白胨或者酵母提取物可以提高细胞的浓度。补充二价阳离子（毫摩尔水平的MgSO4）也会提

19、高细胞浓度。加入葡萄糖却没有太大的作用，因为葡萄糖代谢产生的酸超过了LB的缓冲能力。而在摇瓶中控制pH是非常费事的。如果培养物的酸化构成一个问题，培养基可以用50mM的磷酸钠盐作为缓冲液。2YT，TB（Terrific Broth）和SB（Super Broth）培养基的成分很容易得到，对于培养高浓度细胞，优于LB培养基。培养基成分的一个主要的突破来自于2005年Studier的进一步的工作，在那篇报道中发展了自动诱导的概念。在自动诱导培养基中，葡萄糖，乳糖和甘油被用作优化的混合物。葡萄糖是优先使用的碳源，在细胞生长中首先被代谢。葡萄糖阻止乳糖的吸收，直至葡萄糖消耗干净，这通常发生在在对数中后

20、期。然后是消耗甘油和乳糖，后者也作为lac控制的蛋白表达的诱导剂。这样，避免了为了及时添加诱导剂而检测生物量以及调节培养基。随着每升培养物中细胞数量的增加，氧气供给对细胞生长产生了巨大的影响。提高溶氧最简单的方式就是提高摇菌的转速。例如，对于一般的三角瓶，最优的转速在400rpm-500rpm。带挡板的三角瓶中的搅动会更剧烈一些，在这些条件下，350rpm-400rpm足以保证很好的通气。然而，剧烈的摇动会形成泡沫，降低氧气的传输。因此，推荐加入消泡剂，尽管消泡剂会影响几种微生物的生长和重组蛋白的产量。合适的通气也取决于培养物所占摇瓶的总体积。一般来说，培养物的体积应该低于摇瓶容积的10%。另

21、一个可以使细胞浓度达到很高的方法是流加式发酵。在重组蛋白生产是极少讨论的两个参数是种子培养基的准备和诱导时间。大多数程序要求稀释过夜培养的饱和培养物（100倍稀释）到更大体积的培养基中。然而，渗漏表达会导致质粒不稳定，最终导致目的蛋白产量低。在终止培养基中，细胞也处于不一致的代谢状态。通过稀释接种到新鲜培养基中，细胞将会以不同的速率生长，导致不可复制的诱导点。一个合适的方案是，种子培养基可以在20-25培养或者使用一个缓慢释放葡萄糖系统。在接种和进一步培养之后，通常是在对数中期加入诱导物，因为在这个时间细胞生长快速，蛋白翻译达到最大。然而，也可以在稳定期早期诱导。实际上，在一些情况下，在这个阶

22、段诱导目的蛋白可溶性更高。很可能是因为蛋白合成的减慢降低了包涵体的聚集。包涵体的形成当一个外源基因转入大肠杆菌，spatio-temporal control of its expression is lost。新合成的重组多肽是在大肠杆菌的微环境中表达，这个微环境与多肽原来的环境可能有所不同，例如pH，渗透压，redox potential, cofactors,和折叠机制。在高水平的表达中，多肽中的疏水张力也会以很高的浓度存在，相似的区域会相互作用。所有这些因素会导致蛋白质不稳定和聚集。这些蛋白质聚集体称为包涵体。包涵体的形成是由于蛋白聚集状态和可溶状态的不平衡导致。因此，通过改善导致包涵

23、体形成的因素来获得可溶的重组蛋白是可能的。一个方法就是将目的蛋白融合到一个助溶标签上。在一些情况下，形成包涵体是有优势的，尤其是当这个蛋白可以容易地在体外重新折叠。如果是这样的话，可以调整条件以利于包涵体的形成，提供了一个重要的一步纯化表达蛋白的简单方法。二硫键的形成对于许多重组蛋白来说，二硫键的正确形成对于获得有生物活性的三维构象是至关重要的。错误的二硫键形成会导致蛋白的错误折叠，聚集为包涵体。在大肠杆菌中，半胱氨酸的氧化发生在周质空间，在这里二硫键是由大量的酶催化形成的。主要的酶是Dsb家族。相反，二硫键在细胞质中很少折叠，可能是因为半胱氨酸残基是在许多酶中是催化位点的一部分。在这些位点的

24、二硫键的形成可能会导致蛋白的失活，错误折叠和聚集。在细胞质中具有更低的氧化还原电势，细胞质是由trxB系统和gor系统保持在一个还原的环境。这中情况对含有二硫键的蛋白质的表达有巨大的影响。一个选择就是使蛋白分泌到周质表达。尽管如此，通过对大肠杆菌进行改造，可以使细胞质变成一个杨欢的环境，更加有利于二硫键的形成。值得一提的两个菌株是Origami (Novagen) 和SHuffle (NEB) strains。OrigamiTM菌株在K-12的基础上有一个双突变，trxB，gor（因为这个双突变的细胞是无法存活的，需要在ahpC基因加入一个抑制突变来保证活力）。OrigamiTM也可以以BL2

25、1(DE3) lacY (TunerTM, Novagen)背景获得。Rosetta-gamiTM B strain (Novagen)额外补充了pRARE质粒，修改了菌体的密码子偏好。SHuffle T7 Express strain BL21(DE3) background, NEB做了进一步的改进。除了trxB，gor突变外，它在染色体中可以组成性地表达二硫键异构酶DsbC。DsbC促进错误折叠的蛋白重新折叠成正确的形式，也可以作为一个伴侣促进那些不需要二硫键的蛋白的折叠。由于DsbC的作用，聚集为包涵体的目的蛋白减少了。分子伴侣的共表达/化学伴侣和cofactor补充分子伴侣处于蛋白质

26、质量控制的中心，帮助新生多肽形成最终的结构。其他一些类型的专门的分子伴侣，比如ClpB，可以分解包涵体中未折叠的多肽。重组蛋白高水平的表达导致cytosol的分子聚集，质量控制机制在这种情况下可能达到饱和。解决这个问题的一个方法是通过去除诱导剂（离心将细胞加入含有可以抑制蛋白合成的chloramphenicol新鲜培养基中）来终止蛋白表达。这使分子伴侣重新促进新合成的重组多肽折叠。因为这些功能，人们自然而然将一个或者几个分子伴侣共表达来抑制包涵体的形成。在商业上使用最多的系统是Takara的分子伴侣质粒组合。这个组合包括了5个质粒（pACYC衍生），使不同的分子伴侣或者他们的组合过量的表达：(

27、i) GroES-GroEL, (ii) DnaK/DnaJ/GrpE, (iii) (i)+(ii), (iv) trigger factor, (v) (i)+(iv).另一方面，如果手边没有这个系统，自然的分子伴侣网络可以通过加入benzyl alcohol或者热激来诱导，尽管不推荐使用后者。当蛋白是以包涵体形式纯化的，尿素变性然后进行体外折叠，加入0.1mM-1M的osmolytes（也成为化学伴侣）提高可溶蛋白的产量。这中情况可以通过在培养基中补充proline, glycine-betaine, and trehalose来mimicked。促进正确折叠蛋白的形成最终正确的构象和稳

28、定的折叠路径也可能需要在培养基中添加特殊的cofactors。比如金属离子（iron-sulfur和magnesium）和多肽cofactors。加入这些化合物极大地提高了可容蛋白的产量和折叠速率。减慢表达速率降低蛋白表达速率为新合成的重组蛋白提供正确折叠的时间。降低细胞质蛋白浓度有利于蛋白的正确折叠。迄今为止，减慢蛋白合成最为常用的方法是降低培养温度。低温降低蛋白的聚集，由于温度依赖的疏水性影响高温则促进蛋白聚集。当出现包涵体的问题时，重组蛋白表达应该在15-25进行，尽管有报道在4，72小时成功表达了。然而，低温诱导会减慢菌种生长，减少合成速率，最终导致蛋白产量低。蛋白折叠也可能因为分子伴

29、侣网络效率低而受到影响。ArticExpressTM (Stratagene) 菌株 (B系)拥有来自psychrophilic bacterium Oleispira antarctica冷接头的chaperonin Cpn60和co-chaperonin Cpn10。Chaperonins表现出在4-12高度的重折叠活性，同时赋予大肠杆菌在低温生长的能力。蛋白没有活性活性获得大量的可溶蛋白并不是蛋白表达的最后一步。蛋白仍然可能质量较差，比如它可能没有活性。这主要是由不完全折叠导致。在这种情况下，蛋白有一个稳定的可溶构象但是它活性位点实际的结构仍然不正确，所以蛋白仍然没有活性。在这些情况下，

30、一些选择可能会有帮助。一些蛋白需要小分子或者prosthetic groups来形成最终正确的构象。往培养基中加入这些化合物可以极大地提高重组蛋白的产量和质量。错误的二硫键折叠也会导致蛋白质没有活性。另外，蛋白低温表达对蛋白质量也会有很大的影响。Villaverde实验室的工作表明当培养温度降低时，构象的质量和高度可溶的重组蛋白的功能会有提高。当包内分子伴侣DnaK的浓度提高也会发生同样的情况。这个现象call into question利用可溶性作为蛋白质量的指示。基于这个事实，最好是所有的蛋白都低温表达或者至少，比较不同温度下重组蛋白的活性。如果异源蛋白的活性对细胞有毒性，表达载体的基因重

31、构会导致活性丢失，使宿主能存活下来，最终稿富集起来。这种质粒结构上的不稳定可以通过DNA测序来检测。任何的点突变，缺失，插入或者重排都可以解释纯化蛋白的底活性。结束语对于重组蛋白的表达，大肠杆菌重来都是人们优先选择的微生物细胞工厂。大肠杆菌是表达来自真核和原核细胞的稳定折叠的，球形的蛋白的合适宿主。尽管膜蛋白和超过60kDa的蛋白很难表达，还是有报道成功表达了这些蛋白。大规模的表达实验已经表明少于50%的细菌蛋白和少于15%的非细菌蛋白可以在大肠杆菌中可溶表达，这表明这个系统的适用性。然而，当遇到难于表达的蛋白，事情就变得复杂起来。当面对一个在大肠杆菌中表达新蛋白的挑战时，我们希望得到一个可能的解决问题的清单。尽管如此，a word of caution is needed.不幸的是，这里提到的许多方法在许多情况下可能并不适用。这可以理解，为了解决重组蛋白表达所遇到的问题提出的方法通常是针对不同蛋白的，有偏好的。比如，有一些事情，发表的工作是这样做的，但是对于其他人却不是这样。That being said，庆幸有科学团队共同的努力，这篇文章中的方法不在是偶然的而是可以系统地应用。另外，这个领域一直在扩大，甚至在距第一个在大肠杆菌表达的人类蛋白40年以后，仍然有很大的进步空间。专心-专注-专业