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1、实验一植物叶片DNA的提取DNA extraction实验原理I 二I利用基因组DNA较长的特性，可以将其与细胞器或质粒等小分子DNA 分离。加入一定量的异丙醇或乙醇，基因组的大分子DNA即沉淀形成纤 维状絮团飘浮其中，可用玻棒将其取出，而小分子DNA则只形成颗粒状 沉淀附于壁上及底部，从而达到提取的目的。在提取过程中，染色体会发 生机械断裂，产生大小不同的片段，因此分离基因组DNA时应尽量在温 和的条件下操作，如尽量减少酚/氯仿抽提、混匀过程要轻缓，以保证得 到较长的DNA。一般来说，构建基因组文库，初始DNA长度必须在lOOkb 以上，否则酶切后两边都带合适末端的有效片段很少。而进行RFL
2、P和 PCR分析，DNA长度可短至50kb,在该长度以上，可保证酶切后产生 RFLP片段（20kb以下）,并可保证包含PCR所扩增的片段（一般2kb以下）。不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA的提取方法有所不同； 不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同，分离 方法也有差异。在提取某种特殊组织的DNA时必须参照文献和经验建立 相应的提取方法，以获得可用的DNA大分子，尤其是组织中的多糖和酶 类物质对随后的酶切、PCR反应等有较强的抑制作用，因此用富含这类 物质的材料提取基因组DNA时，应考虑除去多糖和酚类物质。实验材料和试剂实验材料：植物幼嫩叶子。实验所需试剂:1.2.
3、3.4.提取缓冲液 I : 100 mmol/L Tris Ci (pH&0)，20mmol/L EDTA，500 mmol/L NaCl, 1.5% SDS80:4:16/氯仿:戊醇:乙醇RnaseA母液其它试剂：液氮、异丙醇、TE缓冲液，无水乙醇、70%乙醇、3mol/L NaAco实验仪器离心机各种型号的微量移液枪实验步骤:1.水稻幼苗或叶片0.1.0.2g,剪碎，置研钵中，加入lmL提取缓冲液, 研磨成浆；2.3.吸入1.5mLEP管中，剧烈摇动混匀；60C水浴保温30-60min,不时颠倒混匀；4. 室温下1 OOOOrpm离心5min；5. 小心吸上清于新的离心管中，加入等体积氯仿
4、，剧烈震动；6. 室温下1 OOOOrpm离心5min；7. 小心将上清吸入新的离心管中；&加入1倍体积异丙醇，室温下放置片刻即出现絮状DNA沉淀。9. 8000rpm离心5min ,弃掉上清；10.75%酒精洗一次，晾干沉淀；10加入5gL RNaseA (10gg/jiL)，37C lOmin,除去RNA。11加50-lOOg冰融解，20贮存。1 植物叶子0.1-0.2g,加入ImL提取缓冲 液，研磨成浆碎置预冷研钵中2吸入1.5mLeppendorf管中，摇动混匀3. 60C水浴保温3060min4. lOOOOrpm离心5min5吸上清于新的离心管中，加入等体积氯仿，颠倒混匀6.再次l
5、OOOOrpm离心5min；将上清小心吸入新的离心管中;7.加入1倍体积异丙醇,-20 C 放置lOmin,出现絮状DNA沉 淀；随后8000rpm离心5min , 弃掉上清；75%酒精洗沉淀一 次晾干沉淀；加5yL RNaseA(lOgg/iL), 37C lOmin,除去RNA；加50-100piL 的 TE Buffer ,取电泳检测；其余20 C贮存备用。DNA样品0.7% Agarose胶上电泳（例图）实验注意事项1微量移液枪的使用一定要规范，吸取氯仿等有机试剂要注意不要将试剂吸入枪中;2提取过程中的机械力可能使大分子DNA断裂成小片段，所以为保证DNA的完整性, 各步操作均应较温和，避免剧烈震荡。思考题:1 为什么构建DNA文库时，一定要用大分 子 DNA?2.如何检测和保证DNA的质量？
植物叶片中DNA的提取
