微生物检验技术知识点

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1、1微生物：是一群形体细小、结构简单、人肉眼看不见，必须借助于光学显微镜、电子显微镜放大几百倍、几千倍甚至几万倍才能看到的生物。2 微生物的种类：原核细胞型：细菌、放线菌、螺旋体、立克次氏体、支原体、衣原体； 真核细胞型：酵母菌、霉菌、微藻类等； 非细胞型：病毒、亚病毒（类病毒、拟病毒、朊病毒）。3 病源微生物：感染人、动植物，导致疾病发生的有害微生物，称之为病原微生物。4、微生物对产品的污染：对产品造成污染的微生物来源：土壤、空气、水、人和动植物、生产原料、生产器械及包装材料等5 微生物检验的意义：1）是衡量动植物性产品卫生质量的重要指标之一，也是判定被检产品能否食用的科学依据之一。2）通过微

2、生物检验，可以判断产品加工环境及产品卫生环境，能够对产品被微生物污染的程度作出正确的评价，为各项卫生管理工作提供科学依据，提供传染病和人类、动物和食物中毒的防治措施。3）微生物检验是以贯彻“预防为主”的卫生方针，可以有效地防止或者减少食物中毒、人畜共患病的发生，保障人民的身体健康；同时，它对提高产品质量，避免经济损失，保证出口等方面具有政治上和经济上的重要意义。6 微生物检验的范围与对象： 微生物检验范围1.生产环境的检验：车间用水、空气、地面、墙壁等。2.各种产品的原、辅料检验：包括食用动物、谷物、添加剂等一切原辅材料。3.各类产品加工、储藏、销售诸环节的检验：包括食品从业人员的卫生状况检验

3、、加工工具、运输车辆、包装材料的检验等。4.产品的检验：重要的是对出厂产品、可疑产品及食物中有毒食品的检验.微生物检验对象 7类(1)食品 (2)化妆品 (3)药品 (4)一次性用品及其他生活用品(5)应施检疫的出口动物产品 (6)环境 (7)有关国际条约或其他法律、法规规定的强制性卫生检验的进出口商品我国卫生部颁布的食品微生物指标有菌落总数、大肠菌群和致病菌三项大肠菌群是指示水质受粪便污染的指示菌，细菌总数指示水体受污染物污染的情况。微生物检验常规技术包括显微技术，染色技术，灭菌和消毒技术，培养基制备技术，接种，分离纯化和培养技术，无菌取样技术，微生物的计数技术，菌种保藏技术，微生物常规鉴定

4、技术等平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释之后,其中的微生物充分分散成单个细胞,取一定量的稀释样液涂在平板上,经过培养,由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落,即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。统计菌落数,根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。菌落形成单位cfu，colony-forming unit 。疏水网膜法(HGMF)：采用疏水网膜过滤样品，将捕获了被检微生物的疏水网膜上倾入适当的琼脂，经一定时间培养后即可计数直接荧光过滤膜技术(DEFT)：将样品经特殊滤膜过滤后，经吖啶橙染色，利用紫外线显微镜来快速测定活菌数。葡萄糖苷酶荧光法：通过在培养基中加入指示剂、色素、荧

5、光物质，成为快速检验大肠菌群的常用方法。第二章 第一节 微生物检验的基本程序1 检验前的准备 2样品的采集 3样品的送检 4样品的处理方法5 致病菌检验参考菌群的选择 6样品的检验 7检验结果的报告检验前的准备1. 准备好所需的各种仪器：如冰箱、恒温培养箱、显微镜等2. 按技术要求将各种玻璃仪器进行清洗、烘干、包扎、灭菌，冷却后送无菌室备用。3. 准备好实验所需的各种试剂、药品，制备好普通营养琼脂或其他选择性培养基。根据需要分装试管或灭菌后倾注平板或保存在46 的水浴中或保存在4 的冰箱中备用。4. 做好无菌室或超净工作台的灭菌工作，提前1h灭菌3060min。5. 检验人员的工作衣、鞋、帽、

6、口罩等灭菌后备用。6. 工作人员进入无菌室后，实验没有完成之前不得随便出入无菌室。微生物实验室检验 流 程 无菌取样样品均质样液稀释样品接种恒温培养结果观察食品微生物检测常规微生物项目：细菌总数、大肠菌群、酵母总数、霉菌总数，此类细菌不致病，但会严重影响食品的外观及风味。目前常用微生物培养法来计数菌落，允许有该类菌落，但菌落总数不能超标。致病微生物项目：沙门氏菌、李斯特菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157：H7、弯曲杆菌、致病弧菌、副溶血弧菌、志贺氏菌、假单胞菌等。致病微生物在食品中是绝对不允许存在的，所以快速检测食品中是否存在有致病微生物，是食品安全检验的重中之重。食品微生物检验指标 我国卫

7、生部颁布的食品微生物指标有菌落总数,大肠菌群和致病菌三项。1.菌落总数：菌落总数是指食品检样经过处理，在一定条件下培养后所得1g或1mL检样中所含细菌菌落的总数。2.大肠菌群：大肠菌群是寄居于人及温血动物肠道内的肠居菌，它随着的大便排出体外。食品中如果大肠菌群数越多，说明食品受粪便污染的程度越大。3.致病菌：致病菌既能够引起人们发病的细菌。对不同的食品和不同的场合，应该选择一定的参考菌群进行检验。4.霉菌及其毒素：我国还没有制定出霉菌的具体指标，鉴于有很多霉菌能够产生毒素，引起疾病，故应该对产毒霉菌进行检验。5.其它指标：还应包括病毒：肝炎病毒、猪瘟病毒、鸡新城疫病毒、马立克氏病毒、口蹄疫病毒

8、、狂犬病病毒、猪水泡病毒等；另外，从食品检验的角度考虑，寄生虫也被很多学者列为微生物检验的指标。样品的采集目的：便于食品卫生质量监督管理; 鉴别食品中是否存在有毒有害物质;为新产品、新资源利用、新食品、新化工产品、新工艺在投产前进行卫生鉴定。采样标签的填写标签内容主要：编号、样品名称、生产单位、生产日期、产品批号、产品数量、存放条件、采样时间、采样人姓名，现场情况。样品采集的种类1. 大样，指一整批；2. 中样，是从样品中各部分取得的混合样品，一般为200g；3. 小样，又称检样，做分析用的，一般为25g采样的步骤：采样前调查现场观察确定采样方案采样 样品封存 开具采样证明采样的要求1、严格遵

9、守样品采集的操作规程。2、所采样品必须具有代表性。3、采样操作要防止污染，防止变质、损坏、丢失。4、不得加入防腐剂、固定剂等。 5、样品采集和现场测定必须有二人以上参加 。检验样品：食品生产环境如水、空气、土壤样品; 生产各工序样品如设备、管道;各类食品 发生食物中毒时的样品微生物检验的取样方案1 ICMSF取样方案； 2 美国FDA的取样方案；3世界粮农组织（FAO）取样方案；4 我国的食品取样方案。ICMSF取样方案国际食品微生物规范委员会(简称ICMSF)的取样方案是依据事先给食品进行的危害程度划分来确定的。将所有食品分成3种危害度:I类危害：老人和婴幼儿食品及在食用前可能会增加危害的食

10、品;类危害：立即食用的食品，在食用前危害基本不变; 类危害：食用前经加热处理,危害减小的食品。将检验指标对食品卫生的重要程度分成一般、中等和严重3档。根据以上危害度的分类，又将取样方案分成二级法和三级法。二级法：设定取样数n,指标值m,超过指标值m的样品数为C,只要C0,就判定整批产品不合格。三级法：设定取样数n,指标值m,附加指标值M,介于m与M之间的样品数C。只要有一个样品值超过M或C规定的数就判整批产品不合格。美国FDA的取样方案食品药品管理局(FDA)的取样方案与ICMSF的取样方案基本一致，所不同的是严重指标所取的15、30、60个样可以分别混合，混合的样品量最大不超过375g。也就

11、是说所取的样品每个为100g，从中取出25g，然后将15个25g混合成一个375g样品，混匀后再取25g作为试样检验，剩余样品妥善保存备用。食品微生物检验采样方法:按照上述采样方案,能采取最小包装的样品就采取完整包装,必须拆包装取样的应按无菌操作进行。不同类型的食品应采用不同的工具和方法:1.液体样品：充分混匀,以无菌操作开启包装,用100mL无菌注射器抽取,注入无菌容器。2半固体样品：以无菌操作拆开包装,用无菌勺子从几个部位挖取样品,放入无菌容器。3.固体食品：大块整体食品应用无菌刀具和镊子从不同部位割取,割取时应兼顾表面与深部,注意样品的代表性; 小块大包装食品应从不同部位的小块上切取样品

12、,放入无菌容器。 若为检验食品的污染情况，可取表层样品；若为检验食品品质的情况，应从深部取样。 4.冷冻食品：大包装小块冷冻食品按小块个体采取;大块冷冻食品可以用无菌刀从不同部位削取样品或用无菌小手锯从冻块上举取样品,也可以用无菌钻头钻取碎屑状样品,放入容器。 固体食品和冷冻食品的取样还应注意检验目的,若需检验食品污染情况,可取表层样品;若需检验其品质情况,应取深部样品。5.生产工序监测(1)车间用水。自来水样从车间各水龙头上采取冷却水;汤料等从车间容器不同部位用100mL无菌注射器抽取。(2)车间台面、用具及加工人员手的卫生监测。用5cm2孔无菌采样板及5支无菌棉签擦拭25cm2面积。若所采

13、表面干燥,则用无菌稀释液润湿棉签后擦拭;若表面有水,则用干棉签擦拭,擦拭后立即将棉签头用无菌剪刀剪入盛样容器。(3)车间空气采样。直接降尘法。将5个直径90mm的普通营养琼脂平板分别置于车间的四角和中部,打开平皿盖5min,然后盖盖送检。样品的送检要求 1、采集好的样品应及时送到食品微生物检验室：要快速运送，不要超过3小时；易变质的样品要冷藏，若路途遥远，无需冷冻样品可保持在15低温下运送；需保持冷冻状态的样品，可保存在泡沫塑料隔热箱，维持0。2、样品送检时：必须认真填写送检申请单，以供检验人员参考。3、送检过程：要注意防污染、防散漏、防变质。4、检验人员接到送检单后 应立即登记,填写序号,并

14、按检验要求,立即将样品放入冰箱或冰盒中,并积极准备条件进行检验。5、食品微生物检验室必须备有专用冰箱存放样品 一般阳性样品发出报告后3d(特殊情况可适当延长)方能处理样品;进口食品的阳性样品,需保存6个月方能处理;阴性样品可及时处理。样品的预处理方法(一) 液体样品的处理1瓶装液体样品的处理用点燃的酒精棉球灼烧瓶口灭菌，接着用石炭酸或来苏尔消毒后的纱布盖好，再用无菌开瓶器将盖启开；含有二氧化碳的样品可倒入500mL磨口瓶内，口勿盖紧，覆盖一灭菌纱布，轻轻摇荡，待气体全部逸出后，取样25mL检验。2盒装或软塑料包装样品的处理将其开口处用75%酒精棉擦拭消毒，用无菌剪子剪开包装，覆盖上灭菌纱布或浸

15、有消毒液的纱布在剪开部分，直接吸取样品25mL ，或倾入另一灭菌容器中再取样25mL检验。（二）固体样品的处理1. 捣碎均质法：将中样(100g)剪碎或搅拌混匀，从中取25g放入带225mL稀释液的无菌均质杯中，800010000r/min均质12min即可。是对大部分食品样品都适用的办法。2剪碎振摇法：将中样(100g)剪碎或搅拌混匀，从中取25g检样进一步剪碎，放入带225mL稀释液和适量直径5mm左右玻璃珠的稀释瓶中，盖紧瓶盖，用力快速振摇50次，振幅要大于40cm。3研磨法：将中样(100g)剪碎或搅拌混匀，从中取25g检样放入无菌乳钵中充分研磨后，再放入带有225mL无菌稀释液的稀释

16、瓶中，盖紧盖后充分摇匀。4整粒振摇法：完整自然保护膜的颗粒状样品(如蒜瓣、青豆等)直接称取25g整粒样品置于带有225mL稀释液和适量直径5mm左右玻璃珠的无菌稀释瓶中，盖紧瓶盖，用力快速振摇50次，振幅要大于40cm。5胃蠕动均质法：这是国外使用的一种新型的均质样品的方法。将一定量的样品和稀释液放入无菌均质袋中,开机均质。均质器有一个长方形金属盒,其旁安有金属叶板,可打击均质袋,金属叶板由一恒速马达带动,作前后移动而撞碎样品（三）冷冻样品冷冻样品，先将中样在04 下解冻，时间不能超过18h，或在45 下解冻，时间不能超过15min。再取检样25g做稀释处理。菌落总数：因微生物的生活特性各异，

17、不可能在一种培养条件下全部生长，故检出的菌落数小于细菌总数，但仍可评定食品的污染程度，是常用方法。菌落总数的食品卫生学意义：作为食品被污染程度的指标，反映食品的新鲜程度；预测食品的存放期限程度：食品生产过程中变质与否、食品生产过程中食品的一般卫生状况。大肠菌群食品中大肠菌群的数量测定：一般采用100克或100毫升食品中的大肠菌群最可能数（MPN）来表示。国标测定方法：乳糖九管发酵法。 不仅表明样品中有无粪便污染，另方面还可根据数量的多少，判定样品受污染的程度致病菌检验参考菌群的选择蛋及蛋制品：沙门氏菌、葡萄球菌、变形杆菌等水产品海产品：链球菌、副溶血性弧菌乳制品：沙门氏菌、志贺氏菌、葡萄球菌、

18、链球菌、蜡样芽胞杆菌畜禽肉类：肠道致病菌和致病性球菌米面类：蜡样芽胞杆菌、变形杆菌、酵母霉菌等罐头：耐热性芽胞杆菌、嗜热脂肪杆菌、大芽胞杆菌、凝值芽胞杆菌样品的检验过程（一）、收样： 1、收到样品后逐一核对验收，登记编号。 如2004年收到的50号样品，编号可写成：200400502、立即将样品放在冰箱或冰盒中，并积极做好准备工作。（二）、检验1、选择检验方法国内：国家标准国外：国际标准：如FAO标准、WHO标准； 每个进口国的标准：如美国FDA标准、日本厚生省标准、欧共体标准等2、检验要求（1）按照标准操作规程进行检验操作，边工作边做原始记录。（2）检测结束，连同结果一起交同条线技术人员复核

19、。复核过程中发现错误，复核人应通知检测人更正，然后重新复核。（3）检测人和复核人在原始记录上签名，并编写“检测报告底稿”。（4）所有检测项目完成后，检测人员将原始记录、样品卡、报告书底稿交科主任作全面校核。3、样品的保留（1）阴性样品：在发出报告可及时处理；（2）阳性样品：在发出报告以后3天才能处理样品；（3）进口食品的阳性样品：要保留6个月才能处理。（4）微生物检验不进行复检4检验结果的报告1. 经审核后的报告底稿、样品卡、原始记录，上交打印正式报告二份 。2. 将报告正本交审核人及批准人签名，并在报告书上盖上“检验专用章”CMA章和中心公章后对外发文。3. 收文科室或收文人要在检测申请书上

20、收件人一栏内签字，以示收到该报告的正式文本。4. 在报告正式文本发出前，任何有关检测的数据、结果、原始记录都不得外传，否则作为违反保密制度论处。 第二节 微生物检验的常用仪器 显微镜 移液器、冰箱 超净工作台、灭菌锅 离心机 水浴锅、培养箱 烘箱或干燥箱 匀质器 各种玻璃器材 （一） 普通显微镜的保养：1、观察完后，移去观察的载玻片标本。2、用过油浸镜，应先用擦镜纸将镜头上的油擦去，再用擦镜纸蘸着擦镜液擦拭23次，最后再用擦镜纸将二甲苯擦去。3、转动“物镜转换器”，放在低倍镜的位置。4、将镜身下降到最低位置，调节好镜台上标本移动器的位置，罩上防尘套（二）培养箱普通恒温培养箱 隔水式恒温培养箱

21、电热恒温培养箱生化恒温培养箱 二氧化碳培养箱培养箱的配置和使用：配置：22（）、30（）、37（）培养箱各一个使用注意事项：(1)箱内不能放入过热或过冷的物品，取放物品时应快速进行并做到随手关闭箱门。(2)内放一杯水，以保持湿度。(3)培养物不能放在最底层，也不得放置过于拥挤。(4)每月消毒一次，先用3%的来苏尔液涂布消毒，再用清水擦净。(5)不得当烘箱使用。（三）水浴锅：水浴锅内应注加蒸馏水而非自来水，使用时请注意水位（四）匀质器：无菌均质器 高速匀浆机（五）超净工作台：侧流式、直流式和外流式超净台的使用和注意事项：1使用前先打开紫外灯照射，紫外线照射时间4060分钟；2、使用中，有机玻璃罩

22、受到污染，严禁用酒精棉球擦拭，请用含水棉布檫拭；3、请保持超净台整洁，不要堆积杂物；4、使用完毕，勿忘关闭酒精灯；5、请做好使用记录。6、如遇故障，除记录在册外，还应及时与有关人员联系，尽早排除故障。7、学期开始做无菌试验一次，以保证净化台正常使用。平时可根据情况，定期做无菌试验，以测定净化台是否符合无菌要求。（六）离心机 ：普通离心机 高速离心机 超速离心机转子：许多离心机可以配用不同大小的离心管，只需要改变转子或使用一个与不同的吊桶/适配器相配的转子。1水平转子：盛样品的离心管放在吊桶内，以转子的加速度运转。水平转子用于低速离心机，其主要缺陷是延长了沉淀的路径。同时，减速过程中产生的对流会

23、引起沉淀物的重新悬浮。2角式转子：许多高速离心机及微量离心机安装。由于沉降路径短，沉淀颗粒时角式转子比水平转子的效率更高。3垂直管转子：用于高速及超高速离心机进行等密度梯度离心时。这种转子在沉淀没有形成之前不能用来收集悬浮液中的颗粒。（七）灭菌器 ：干热灭菌器 湿热灭菌器1、电烘箱（干燥箱）用途： 用于玻璃器皿等耐热物品的烤干和灭菌。 玻璃器皿等物的灭菌，温度160165，灭菌 2小时。玻璃器材的干热灭菌方法：(1)将培养皿、吸管等玻璃器皿洗净干燥后，用报纸包好，或装入特制的铁筒中。(2)将包装好的玻璃仪器摆入电热烘箱中，彼此间留有一定的空隙以便流通空气。(3)关紧箱门，打开排气孔接上电源。(

24、4)待箱内空气排出到一定程度时，关闭上排气孔，继续加热至一定温度后，调节温度控制旋钮固定温度，在160165保持2小时即可。 (5)待自然降温冷却后(60以下)才能开门取出玻璃器皿。 2、高压灭菌锅用途：培养基、生理盐水、废弃物、采样器、纱布、衣物的灭菌。种类：手提式、立式、卧式杀菌锅3 滤菌器（八）普通冰箱冰柜1、 取用冰箱冰柜内物品尽可能快，取完后及时将有用物品放回原处；2、 关冰柜门时应轻轻合上，同时将门轻轻往外拉一下检查是否关好;3、冰柜内的不要样品应及时清理二、常用玻璃仪器及用具（一）量器类1、移液管1ml，2ml，5ml，10ml，25ml2、容量瓶50ml，100ml，250ml

25、，500ml，1000ml3、量筒 容量（ml）10、25、50、10、25、500、1000、20004、微量移液器（二）其他常用玻璃器皿1、培养皿3.5cm,7cm，9cm，15cm 2、试管各种试管的使用：13mm100mm ：生化反应及凝集反应 15mm150mm ：斜面培养 18mm180mm：检样稀释3、三角瓶 50mL，150mL，200mL， 250mL，500mL，1L，2L，3L4、烧杯 容量（mL）：25、50、100、150、250、500、1000、2000、3000、5000三、玻璃器皿的清洗和灭菌(一)新购的玻璃器皿1、先用热肥皂水刷洗，流水冲净。2、再浸泡于的盐

26、酸中数小时，最后用流水冲净(二)用过的玻璃器皿 1、含油脂器材的清洗：（1）单独高压灭菌； （2）趁热倒去污物；（3）倒放在铺有吸水纸的篮子上，置100 烘箱中烤0.5h;（4）再用5%的碳酸氢钠水煮两次，再用肥皂水刷洗干净。2、含菌试管的清洗高压灭菌后，肥皂水刷洗干净，烘干或晾干备用。3、含菌平皿的灭菌（1）底盖分开放，放入桶中，高压灭菌；（2）趁热倒去污物；（3）肥皂水刷洗干净，烘干或晾干备用。4、含菌吸管的清洗（1）把含菌吸管投入3%的来苏尔液内浸泡30min以上杀菌；（2）用肥皂水洗涤一次；（3）最后用清水冲洗干净即可。5、载玻片及盖玻片的清洗（1）将载玻片及盖玻片分别浸入5 %的来苏

27、尔液内浸泡过夜，取出水洗干净；（2）盖片用软布擦干即可；（3）染色用的载玻片要放入肥皂水中煮沸10min，再用肥皂水刷洗干净，最后用95%的酒精浸泡片刻，晾干备用。（三）玻璃器材的灭菌（1）清洗后烘干；（2）加塞包扎；（3）灭菌: 干热灭菌:160 165烘箱中烤2h 湿热灭菌:121 20min第三章 细菌生化试验和血清学试验第一节 细菌常见的生化反应试验（一）什么是生化试验? 指通过利用生物化学的方法来测定微生物的代谢产物、代谢方式和条件等来鉴别细菌的类别、属种的试验。 生化试验或称生化反应：细菌的酶不完全相同，对营养物质的分解能力不一致，因此其代谢产物各异。在培养基中加入可与被测终产物反

28、应的指示剂，产生肉眼可见的变化，如颜色的改变等，利用生化方法来鉴定细菌的试验，统称为细菌的生化试验或称生化反应（二）生化试验的方法：1在培养物中加入某种底物与指示剂,经接种、培养后,观察培养基的pH值变化。2在培养物中加入试剂，观察它们同细菌代谢产物所生成的颜色反应。3根据酶作用的反应特性，测定酶的存在。4根据细菌对理化条件和药品的敏感性，观察细菌的生长情况。（三）生化试验的注意事项1. 待检菌应是新鲜培养物，培养1824h。2. 待检菌应是纯种培养物。3. 遵守观察反应的时间。观察结果的时间，多为24或48小时。4. 应做必要的对照试验。5. 提高阳性检出率，至少挑取23待检的疑似菌落分别进

29、行试验。（四） 检验细菌的生化试验范围:1、糖（醇）类代谢试验 2、氨基酸和蛋白质代谢试验3、有机酸盐和铵盐的利用试验 4、呼吸酶类试验 5、毒性酶类试验二、糖醇类代谢试验（一）糖醇类发酵试验（二）葡萄糖氧化发酵（O/F）试验 （三）V-P试验（四）甲基红（Methyl Red）试验 MR（五）七叶苷水解试验 （六）甘油品红试验（一） 糖醇类发酵试验1、原理：不同的细菌对各种糖醇的分解能力及所产生的代谢产物各不同，有的能分解多种糖(醇)，有的只能分解12种糖(醇) ，有的分解糖(醇)能产酸产气，有的分解糖(醇)只产酸不产气，根据这些特点，可鉴别细菌。常用的糖醇 单糖：葡萄糖、甘露糖醇、木糖、半

30、乳糖鼠李糖 双糖：乳糖、蔗糖、麦芽糖、蕈糖 三糖：棉子糖 多糖：菊糖、肝糖、淀粉 醇类：甘露醇、山梨醇、肌醇、卫茅醇2试验方法： 用接种针或环移取纯培养物少许，接种于糖发酵管中，若为半固体培养基，则用接种针作穿刺接种。置361.0 培养13天，每天观察结果。3、结果观察和记录： 产酸产气，阳性，以“”表示 产酸不产气，阳性，以“+”表示 不产酸产气，阴性，以“-”表示应用：沙门氏菌可发酵葡萄糖但不发酵乳糖。大肠埃希菌可发酵葡萄糖及乳糖。有些菌可发酵同一种糖类，其发酵产生的代谢产物也不尽相同。如大肠埃希菌和志贺菌均可发酵葡萄糖，但前者产酸产气，而后者仅产酸，故可利用此试验来鉴定细菌。（二）葡萄糖

31、氧化发酵（O/F）试验1、原理：细菌对葡萄糖的分解，分为氧化型和发酵型。氧化型细菌在有氧的条件下才能分解葡萄糖，无氧的条件下不能分解葡萄糖；发酵型细菌在有氧无氧条件下均可分解葡萄糖；不分解葡萄糖的细菌称为产碱型。 根据糖管的色泽变化可鉴别细菌。2、方法：取待检菌，以穿刺法接种于两管葡萄糖半固体培养基上，在其中一管加入一层（约1cm）灭菌的液体石蜡以隔绝空气，在37培养24h天，每天观察结果。应用：可用于鉴别肠杆菌科细菌（发酵型）与非发酵菌（氧化型或产碱型）。也可用于鉴定葡萄球菌（发酵型）和微球菌（氧化型）。3、结果观察与记录（三） V-P试验1、原理：某些细菌能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸经缩

32、合、脱羧生成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中的O2氧化为二乙酰，在-萘酚和肌酸的催化作用下，二乙酰与培养基中的蛋白胨中精氨酸等所含的胍基生成红色化合物，即V-P试验阳性，称VP（+）反应。应用：本试验常与甲基红试验一起使用。二者结果通常相反。即如大肠埃氏菌、沙门菌、志贺菌等甲基红呈阳性反应，而VP反应则为阴性。沙雷菌、阴沟肠杆菌等，VP反应为阳性，而甲基红反应为阴性。2、试验方法（1）奥梅拉（OMeara）法 （2）贝立脱（Barritt）氏法 （3）快速法（）奥梅拉法 将试验菌接种于磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基，于361 培养48h， 每1mL培养液加奥梅拉OMeara试剂0.1ml，

33、摇动试管12min，静置于37恒温箱4h ，或在4850 水浴放置2h后判定结果。（2）贝立脱法 将试验菌接种于磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基，于361培养2天，每2mL培养液先加入6%a-萘酚纯酒精溶液1mL，再加40%氢氧化钾水溶液0.4ml，摇动25min，阳性菌常立即呈现红色，若无红色出现，静置于室温或361 培养 4h ，如显现红色为阳性，呈黄色或有类似铜色者，可判定为阴性。（3）快速法 将0.5%肌酸溶液2滴放于小试管中，挑取产酸反应的三糖铁琼脂斜面培养物一接种环，乳化接种于其中，加入5%-萘酚3滴，40%氢氧化钠水溶液2滴，振动后放置5min，判定结果。不产酸的培养物不能使用。3、结

34、果观察与记录 （1）发酵管出现红色者，为阳性， 记V-P + （2）发酵管为黄色或铜绿色者，为阴性，记 V-P -（四）甲基红试验（MR）1、原理：细菌分解葡萄糖产生丙酮酸后，由于代谢的途径不同，有的细菌可使丙酮酸转化生成乳酸、琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，使培养基pH值下降至pH4.5以下，使甲基红指示剂变红色，为甲基红试验阳性 ；有的细菌使丙酮酸脱羧后形成酮、醇类中性产物，培养液pH5.4，甲基红指示剂呈桔黄色，为甲基红试验阴性。2、试验方法：挑取新鲜的待试培养物少许，接种于磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基，于361 或30 （以30 较好）培养35天，从第48h起，每日取培养液1mL，加入

35、甲基红指示剂12滴，立即观察结果。3、结果观察与记录（1）呈鲜红色或橘红色为阳性，呈淡红色为弱阳性，记MR +；（2）呈橘黄色或黄色为阴性， 记MR -，迄至发现阴性并培养至第5天仍为阴性，即可判定结果。应用：主要用于大肠埃希菌（阳性）和产气肠杆菌（阴性）的鉴别。 肠杆菌中许多细菌甲基红试验为阳性，如沙门菌、志贺菌、枸橼酸杆菌、变形杆菌等为阳性，但肠杆菌属和克雷伯菌属为阴性。（五） 七叶苷水解试验、原理：七叶苷被细菌分解后，生成葡萄糖和七叶素，七叶素与Fe2+结合，生成黑色化合物，使培养基呈黑色，以此鉴别细菌。2、试验方法：将待试纯培养物少许，接种于七叶苷培养基，于361 培养24h,观察结果

36、。3、结果观察与记录 （1）培养基变为黑色或棕黑色者，为阳性，记录为 + （2）培养基不变色者，为阴性，记录为 -（六） 甘油品红试验1、原理：某些细菌可分解甘油成为丙酮酸，并进一步脱羧生成乙醛，乙醛与无色品红生成醌式化合物，呈深紫红色，以此鉴别细菌。2、试验方法:取待检菌的新鲜纯培养物，接种于甘油品红肉汤培养基中，于361 培养8天,并用未接种的培养基在相同条件下培养作为阴性对照，观察结果。3、结果观察与记录 （1）出现紫色或紫红色者,为阳性，记录为+ （2）与对照管颜色相同者,为阴性，记录为-三、氨基酸和蛋白质代谢试验（一） 靛基质（吲哚）试验1、原理：某些细菌含有色氨酸酶，能分解蛋白胨中

37、的色氨酸，生成靛基质（吲哚）。吲哚与对二甲氨基苯甲醛结合，可形成红色化合物，即玫瑰吲哚，以此鉴别细菌。 应用：主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。2、试验方法所用试剂:（1）柯凡克(Kovacs)试剂或（2）欧-波试剂 将待检菌小量接种于培养基中，于361 培养2448h时后，加入柯凡克试剂数滴，轻摇试管，呈红色者为阳性。 或沿试管壁缓慢加入欧-波试剂约0.5ml覆盖液面，两液接触处呈现玫瑰红色者，为阳性反应，无红色者为阴性反应。3、结果观察与记录： 呈现玫瑰红色，为阳性反应，记+ 无红色者，为阴性反应，记-（二） 硫化氢（H2S）试验1、原理：某些细菌可分解培养基中的含硫氨基酸或含硫化合物，产生硫化

38、氢，硫化氢遇铅盐或铁盐可生成黑色沉淀物PbS或FeS，以此鉴别细菌2、试验方法：挑取待检菌，用穿刺接种法接种于三糖铁培养基上，于361培养2448h，观察结果。3、结果观察与记录 培养基底部呈黑色，为阳性，记+ 培养基底部无黑色，为阴性，记-应用：用于肠道杆菌鉴定试验，如：沙门氏菌属、爱德华菌属、枸橼酸杆菌属及变形杆菌等为阳性；肠道杆菌中其他菌属为阴性，沙门菌属中的甲型副伤寒沙门菌也为阴性。（三） 尿素酶试验1、原理：某些细菌能产生尿素酶，将尿素分解产生氨，氨使培养基变为碱性，使培养基中的酚红指示剂呈粉红色，培养基由黄色变为红色，为阳性。以此鉴别细菌。应用：主要用于肠杆菌科中变形杆菌属的鉴定。

39、奇异变形杆菌和普通变形杆菌尿素酶阳性，雷氏普罗威登斯菌和摩氏摩根菌阳性，斯氏和产碱普罗威登斯菌阴性。2、试验方法：挑取大量培养1824h的待试菌，浓密涂布接种于尿素琼脂斜面上，不要到达底部，留底部作变色对照。培养2、4和24h分别观察一次结果，培养基变为粉红色为阳性，颜色不变者为阴性。如阴性应继续培养至4天，作最终判定。3、结果观察与记录： 培养基变呈粉红色，为阳性，记 + 培养基颜色不变，为阴性，记 -（四） 氨基酸脱羧酶试验1、原理：某些细菌能产生氨基酸脱羧酶, 可使赖氨酸、鸟氨酸生产脱羧作用, 生成胺类物质和CO2。胺类物质使培养基呈碱性变紫色，为阳性, 如呈黄色为阴性，以此鉴别细菌。2

40、、试验方法：取待检菌，分别接种于含有氨基酸的培养基内和不含氨基酸的对照培养基内，在361 培养14天，每天观察结果。3、结果观察与记录： 试验管呈紫色，对照管呈黄色，为阳性，记 + 试验管、对照管都呈黄色，为阴性，记 -。阳性反应试验管颜色变化过程：紫色黄色紫色原理：对照管呈黄色，说明有细菌生长。在培养的早期（1012h），细菌发酵葡萄糖产酸使培养液pH下降，指示剂溴甲酚紫由紫色变为黄色，以后由于氨基酸脱羧生成胺，pH又回升至碱性，指示剂显紫色。应用：沙门菌属中除伤寒和鸡沙门菌外，其余沙门菌的鸟氨酸和赖氨酸脱羧酶试剂均为阳性。志贺菌除宋氏和鲍氏志贺菌外其他志贺菌均阳性。故可作为肠杆菌科细菌鉴定

41、的重要方法。此外，对链球菌和弧菌科细菌的鉴定也有重要价值。（五） 苯丙氨酸脱氨酶试验1、原理：某些细菌可产生苯丙氨酸脱氨酶，使苯丙氨酸脱去氨基，形成苯丙酮酸，苯丙酮酸与氯化铁作用生成绿色化合物，以此鉴别细菌。2、试验方法：从待检菌琼脂斜面上挑取大量培养物，接种于苯丙氨酸培养基上，在361 培养1824h后，加入氯化铁溶液45滴，转动试管，使试剂与菌苔表面充分接触，立即观察结果。3、结果观察与记录 试验管立即出现绿色，为阳性，记 + 无色为阴性，记 -。 应用：本试验特异性较高，主要用于肠杆菌科细菌鉴定。变形杆菌属、摩根菌属和普罗威登菌属细菌均为强阳性，肠杆菌科中其他细菌均为阴性。（六） 明胶液

42、化试验1、原理：有些细菌具有明胶酶（亦称类蛋白水解酶），能将明胶先水解为多肽，又进一步将多肽水解为氨基酸，明胶失去凝胶性质，使培养基由固态变为液态。2、试验方法： 挑取培养1824h的待试菌，以较大量穿刺接种于明胶高层约2/3深度。于2022培养714天。明胶高层亦可培养于361。 另取一支未接种的培养基一同培养作对照，每天取出两支试管，放入冰箱放置2030min后，再观察结果。3、结果观察与记录：明胶液化，为阳性，+。明胶凝固，为阴性，-。四、 有机酸盐和铵盐的利用试验碳源利用试验：细菌对单一来源的碳源利用的鉴定试验（一） 枸橼酸盐利用试验1、原理：某些细菌能利用柠檬酸盐作为唯一碳源，分解枸

43、橼(柠檬)酸盐生成碳酸盐；同时分解培养基的铵盐生成氨，使培养基变为碱性，使指示剂溴麝香草酚蓝由淡绿转为深蓝色，为阳性。2、试验方法：挑取待检菌，在西蒙枸橼酸盐培养基斜面上密集划线接种，在361 培养14天，每天观察结果。3、结果观察与记录： 斜面有菌苔生长，培养基斜面变为蓝色或深蓝色，为阳性，记+； 无菌苔生长，培养基斜面仍为绿色者，为阴性，记-应用：枸橼酸盐利用试验用于肠杆菌科中各菌属间的鉴别，在肠杆菌科中，埃希菌属、志贺菌属、爱德华菌属等为阴性，其他菌属为阳性。（二） 丙二酸盐利用试验1.原理：某些细菌可以利用培养基中的丙二酸盐作为唯一碳源,丙二酸盐被分解成碳酸钠,使培养基变为碱性,培养基

44、由草绿色变成蓝色，为阳性，以此鉴别细菌。2、试验方法：取待检菌新鲜纯培养物，接种于丙二酸钠培养基上，于361 培养48h，观察结果。3、结果观察与记录： 培养基由草绿色变成蓝色,为阳性,记+ 培养基无颜色变化,为阴性,记-应用：常用于肠杆菌科细菌鉴定，亚利桑那和克雷伯菌属为阳性，枸橼酸杆菌属、肠杆菌属和哈夫尼亚菌属中有些菌种也呈阳性反应，其他各属均为阴性。Mimic试验：吲哚（I）、甲基红（M）、VP（Vi）、枸橼酸盐利用（C）四种试验常用于鉴定肠道杆菌，合称为IMViC试验。 I - 吲哚（indol）试验 M - 甲基红（methyl red）试验Vi - VP（Voges-Proskau

45、er）试验 C -枸橼酸盐利用（citrate utilization）试验I M Vi C试验 大肠埃希菌 + + - - 产气杆菌 - - + + 五、 呼吸酶类试验（一） 氧化酶试验1.原理： 氧化酶使细胞色素C氧化后，氧化型细胞色素C再使盐酸二甲基对苯二胺氧化，使生成玫瑰红色到暗紫色的醌类化合物,再和-萘酚结合,生成吲哚酚蓝,呈蓝色反应，为阳性。试剂：1% -萘酚-乙醇液 1%盐酸二甲基对苯二胺2、试验方法：用滴管直接滴加1%盐酸二甲基对苯二胺试剂12滴在培养物上,再加入1% -萘酚-乙醇液12滴, 在30秒内判定试验结果。3、结果观察与记录： 在30秒内呈蓝色反应,为阳性,记 + 不

46、变色或为红色者,为阴性,记 -应用：奈瑟菌属的菌种均呈阳性反应。也用于区别假单胞菌与肠杆菌，肠杆菌科细菌为阴性，假单胞菌为阳性。莫拉菌属也为阳性。 本试验中避免接触含铁物质，否则易出现假阳性，选铜绿假单胞菌为阳性对照，大肠埃希菌为阴性对照。（二） 过氧化氢酶（触酶）试验1.原理：某些细菌可分泌过氧化氢酶，加入过氧化氢后，可将过氧化氢分解生成水和氧气，产生气泡，即为阳性反应。2、试验方法：挑取固体培养基上的新鲜菌落一环，置于洁净玻片上（或试管），滴加3%过氧化氢液数滴，或在琼脂斜面培养物上直接滴加过氧化氢液，立即观察结果。3、结果观察与记录： 产生气泡者，为阳性，记+ 不产生气泡者，为阴性，记-

47、应用：绝大多数细菌均能产生过氧化氢酶，但链球菌属触酶阴性，故常用此试验来鉴别链球菌。应注意本试验不宜用血琼脂平板上的菌落（易出现假阳性）。由于陈旧培养物可失去酶活性，所以试验应取新鲜培养菌。用金黄色葡萄球菌作阳性对照，阴性对照用链球菌。（三）硝酸盐还原试验1、原理：某些细菌具有还原硝酸盐的能力，可将硝酸盐还原为亚硝酸盐，在酸性条件下，亚硝酸盐可生成亚硝酸，亚硝酸与对氨基苯磺酸作用，生成重氮苯磺酸，重氮苯磺酸再与-萘胺作用，生成红色的化合物，呈红色反应，为阳性反应试剂：A、对氨基苯磺酸试剂 B、-萘胺试剂2、试验方法：取待检菌新鲜纯培养物，在硝酸盐培养基上接种，在361 培养14天，每天取2mL

48、培养液,加入A、B试剂的等量混合物各二滴混匀，立即观察结果。3、结果观察与记录： 呈现红色，为阳性，记+ 若无红色出现，为阴性，记-（四） 氰化钾试验1.原理： 氰化钾是细菌呼吸酶系统的抑制剂,可与呼吸酶作用使酶失去活性,抑制细菌的生长,但有的细菌在一定浓度的氰化钾存在时仍能生长,以此鉴别细菌.2、试验方法:取培养2024h的营养肉汤培养液或菌落1环，接种至对照培养基及氰化钾培养基内，立即以橡胶塞塞紧，361 培养24 48h，观察结果。3、结果观察与记录: 对照管有菌生长，试验管有菌生长为阳性，记+。 对照管有菌生长，试验管无菌生长为阴性。记-。六、毒性酶类试验（一） 溶血试验1、原理: 某

49、些细菌在代谢过程中能产生溶血素，可使人或动物的红细胞发生溶解，不同的细菌有不同的溶血反应，借此可鉴别细菌。2 试验方法: 平板法 试管法（1）平板法:将培养物接种于血平板培养基上，361 培养24 48h，观察结果。溶血试验的溶血类型及现象: （1） （甲型）溶血: 菌落周围出现较窄的半透明的草绿色溶血环。 （2） （乙型）溶血: 菌落周围出现较宽的透明溶血环。 （3）（-丙型）溶血: 菌落周围无溶血环。（2）试管法: 将待检菌培养液与等量的2%羊血球混合，在361 培养16 18h，观察结果。如溶血，培养液可出现透明状。3、结果观察与记录: 有溶血现象，为阳性，记+； 无溶血现象，为阴性，记

50、 -(二) 链激酶试验1、原理： A群链球菌群能产生链激酶，该酶能使血液中的纤维蛋白酶原变成纤维蛋白酶，而后溶解纤维蛋白，使血凝块溶解 ,为阳性反应。此试验用于测定链球菌的致病性。阳性反应具有致病性。2、试验方法： 吸取草酸钾血浆0.2 mL(0.01 g草酸钾加5 mL兔血浆混匀，经离心沉淀，吸取上清液)，加入0.8 mL生理盐水，混匀后，再加入待检菌36下培养18-24h肉汤培养物0.5 mL和0.25氯化钙0.25 mL，混匀，放37水浴中，2 min观察一次。 待血浆凝固后继续观察并记录溶化时间。如2 h内不溶化，继续放置24 h后观察。同时用肉浸液肉汤做阴性对照，用已知的链激酶阳性的

51、菌株做阳性对照。3、结果观察与记录； 如凝块全部溶化,为阳性+ 凝块24 h仍不溶化,为阴性-（三）卵磷脂酶试验1、原理：某些微生物能产生卵磷脂酶，在钙离子存在时，能迅速分解卵磷脂，生成不溶性甘油酯和水溶性磷酸胆碱，在卵黄琼脂平板上菌落周围形成不透明的乳浊环或混浊白环，或使血清、卵黄液变混浊，以此鉴别细菌。2、试验方法：（1）卵黄平板法 A法：将待检菌培养物划线接种或点种于卵黄琼脂平板上，361 培养3 6h，观察结果。B 法：先用卵黄磷脂酶抗血清将平板涂一半，置于36 待干后，将待检菌接种于未涂抗血清的一半卵黄琼脂平板上，再转划已涂过抗血清的一半，361 厌氧培养24 48h，观察结果。在未

52、涂抗血清的一半平板上，菌落周围形成较大的不透明乳白色混浊区，在涂抗血清的一半平板上，菌落周围无不透明混浊区，为阳性。两边均无不透明区，为阴性。乳糖卵黄琼脂平板,借以确定该菌可否产生卵磷脂酶。卵磷脂酶具抗原性，其活性可被相应抗血清所抑制，（2）卵黄盐水法： 将庖肉培养基培养物经除菌过滤，收集滤液。在两支灭菌试管内，每管加入1%卵黄盐水0.4mL,在一管中加入滤液0.2mL，另一管加入生理盐水0.2mL作对照。在36 水浴中，经2h、 4h、 8h、 24h观察结果。 管底发生混浊沉淀，对照管无沉淀者，为阳性。3、结果观察与记录： 菌落周围形成较大的不透明区，为阳性。 两边均无不透明区，为阴性。

53、管底发生混浊沉淀，对照管无沉淀者，为阳性。 两管无沉淀者，为阴性。（四） 血浆凝固酶试验1、原理：致病性葡萄球菌能产生血浆凝固酶，可使血浆中的纤维蛋白原转变成纤维蛋白，附着在细菌的表面，形成凝块；或作用于血浆凝固酶原，使它成为血浆凝固酶，从而使抗凝的血浆发生凝固现象,为阳性。2、试验方法（1）玻片法：取清洁干燥载玻片，一端滴加一滴生理盐水，另一端滴加一滴兔（人）血浆，挑取菌落分别与生理盐水和血浆混合，5 min内,如血浆内出现团块或颗粒状凝块，而盐水滴仍呈均匀混浊，则为阳性;如两者呈均匀混浊，无凝固则为阴性。（2）试管法：取灭菌小试管3支，各加入血浆无菌水(1:1)0.5ml，1支加入被检菌株

54、的营养肉汤培养液（或浓菌悬液）0.5ml；其余2支作对照管，1支加入金黄色葡萄球菌的营养肉汤培养液或菌悬液0.5ml作阳性对照;另1支加入营养肉汤或0.9氯化钠溶0.5ml作空白对照。将3管同时放37温箱或水浴中培养，每0.5 h观察一次， 4 h 内无凝固现象者，观察直至24小时。3、试管法的结果观察与记录： 空白对照管的血浆流动自如，阳性对照管血浆凝固，试验管血浆凝固者为阳性； 均无凝固则为阴性。七、 三糖铁（TSI）试验1、三糖铁试验的原理： 如果细菌可利用乳糖和蔗糖发酵产酸或产酸产气，培养基全部变黄； 如果只可以利用葡萄糖，葡萄糖被分解产酸可使斜面先变黄，但因量少，生成的少量酸，因接触

55、空气而氧化，加之细菌利用培养基中含氮物质，生成碱性产物，故使斜面最后为红色，底部由于是在厌氧状态下，酸类不被氧化，仍保持黄色。 如果细菌又能分解含硫化合物，产生硫化氢，培养基底部变黑。 2、试验方法：以接种针挑取待试菌可疑菌落或纯培养物，穿刺接种并涂布于斜面，置361培养1824h，观察结果。第二节 细菌对抗菌药物敏感性的检验1、扩散法： 琼脂加上细菌所需要的各种养料，将培养基融化后，倒入无菌培养皿中，冷却，凝成一个平面或叫平板(平皿)。这时将含有少数细菌的菌液涂到平板上，培养后细菌就会分别在平皿上繁殖，如果在平皿的培养基内事先加入抗生素纸片，由于药物在培养基中扩散，起了抑(杀)菌作用，形成了

56、不长菌落的抑制圈。 抑制圈的大小，反映某一抗生素对该菌抑菌的程度。K-B法：最常用的药敏试验是WHO推荐的Kirby-Bauer纸片扩散法(K-B法)。该法将药敏试验抑菌环大小分为四个等级，即：敏感、中度敏感、中介度、耐药。由于中介度介于敏感和耐药之间，所以不予报告，故化验单上只报告敏感、中度敏感或耐药。【临床意义】 1敏感：表示被测菌株所引起的感染可以用常用剂量的该抗菌药物治愈，禁忌症除外。2中度敏感：表示被测菌株可以通过提高剂量被抑制或在药物被生理性浓集的部位被抑制，如-内酰胺类药物。3中介度：这一范围只是抑菌环直径介于敏感和耐药之间的“缓冲域”，以防止由微小的技术因素失控所导致的较大的结

57、果解释错误。抑菌环落入中介度范围，意义不明确，如果没有其他可替代的药物，应重复做药敏试验，或以稀释法测定MIC。4耐药：被测菌不能被常用剂量所达到组织内或血液中的抗生素所抑制。5最低抑菌浓度：抑制被测菌的最低药物浓度。6最低杀菌浓度：抗菌药物杀灭细菌所需的最低浓度。 联合药敏试验：【临床意义】常用于严重感染时对两种或两种以上抗生素的选择。常用K-B法和方阵棋盘稀释法。结果以部分抑菌浓度FIC的指数报告。 1FIC指数05，为协同作用。即两种抗菌药物联合后的药效大于同样浓度的两种药物抗菌作用的总和。 2.FIC指数051，为相加作用，即两种药物联合后其活性等于两种药物抗菌作用的总和。 3FIC指

58、数12，为无关作用，即联合药物的活性与单独的抗菌作用相同。 4FIC指数2，为拮抗作用，即两种药物联合后的抗菌活性小于单独一种药物的抗菌作用。K-B纸片琼脂扩散法（1）原理：将含有定量抗菌药物的纸片贴在测试菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸收琼脂中的水分溶解后不断地向纸片周围扩散，形成递减的浓度梯度。 在纸片周围可抑菌浓度范围内测定菌的生长被抑制，从而形成无菌生长的透明圈即抑菌圈。 抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感性。(2) 制备抗菌药物纸片 专用药敏纸片：用加样或浸泡的方法使每片的药量达到一定的规定量，冷冻干燥后密封，-20C保存备用。（3）配制培养基 水解酪蛋白（Mueller-Hi

59、nton，MH）琼脂是对生长较快的需氧和兼性厌氧菌进行药敏试验的标准培养基，pH7.2-7.4，琼脂厚度为4mm。 对营养要求较高的细菌进行药敏试验时，应在MH琼脂中加入相应的营养添加剂。（4）细菌接种 接种物的准备可采用生长法或直接菌落悬液法。 为使药敏试验的接种浓度标准化,应使用0.5麦氏比浊标准的菌液浓度，制备好的菌液应在15min内接种完毕。 置35孵育16-18h后读取结果，厌氧菌应孵育在含CO2的环境中，葡萄球菌和肠球菌必须孵育24h，以检测对苯唑西林和万古霉素的耐药性。（5） 结果解释和报告 用游标卡尺或直尺量取抑菌圈直径，参照NCCLS标准判断结果。常分为以下三级：敏感、中度敏

60、感、低度敏感（6）纸片法药敏结果的影响因素 培养基的质量对结果的准确性有直接影响，如pH、硬度、湿度和深度等； 药敏纸片的含药量是影响抑菌圈大小的重要因素； 接种菌量正确与否是影响结果的重要因素之一； 试验操作质量；培养条件和温度、时间； 抑菌圈测量工具的精确度； 质控菌株本身的药敏特性是否合格，有无变异。（7）质量控制 采用标准菌株是进行药敏试验质量控制的主要措施。 常用的临床药敏质控标准菌株有：金黄色葡萄球菌ATCC25923，大肠杆菌ATCC25922，铜绿假单胞菌ATCC27853 等。2、稀释法(1)液体稀释法 先将测试抗菌药物作一系列倍比稀释，然后各试管加入适当稀释的试验菌液，摇匀

61、，经培养后观察，以抗菌药物最小抑菌浓度(MIC)管，即为试验菌株的敏感度。(2)琼脂稀释法： 将不同剂量的抗菌药物，分别加于融化并冷至45的定量琼脂培养基中，混匀，倾注成无菌平板，即为含有药物浓度递减的培养基; 接种测试菌于该培养基上，经培养后观察，被检菌生长情况，最低药物抑制细菌生长者，即最小抑菌浓度(MIC)。3、自动分析法 国内采用AUTOBAC仪器作细菌药敏测定，仪器由测定环药物纸片，培养振荡机及光度计主机等来检定数据，按耐药、中等耐药、敏感，并把最小抑菌浓度都打印出来。 该仪器仅适用于测定需氧菌及兼性厌氧菌，不适于专性厌氧菌及结核分枝杆菌的测试。第三节 微生物培养及实验基本操作技术一、培养基配制培养基是指人工配制的、