β-半乳糖苷α-,唾液酸转移酶的表达与乳腺癌的预后以及肿瘤进展的相关性研究

《β-半乳糖苷α-,唾液酸转移酶的表达与乳腺癌的预后以及肿瘤进展的相关性研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《β-半乳糖苷α-,唾液酸转移酶的表达与乳腺癌的预后以及肿瘤进展的相关性研究（84页珍藏版）》请在装配图网上搜索。

1、IIll l ll I II II It lll l ll IIlY31 1 9053p-galactoside一仅一2，6一sialyltransferase2 oVerexpression is associated with poor prognosis and induces tumor development in breast cancerAuthorS signature：一Supervlsor 7S signature：Thesis reviewer l：AnonymityThesis reviewer 2：AnonymityThesis reviewer 3：Anonymit

2、yThesis reviewer 4：AnonymityThesis reviewer 5：AnonymityChair：ProfWangQingqing Zhej iang University(Committee of oral defence)Committeeman 1：ProfZengSu Zhejiang University Committeeman 2：ProfYingGuoqing Zhejiang University Committeeman 3：ProfChengHao Zhejiang University Committeeman 4：ProfSuiMeihua Z

3、hejiang Provincial PeopleS Hospital Committeeman 5：Date oforal defence：2021521万方数据浙江大学研究生学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得逝鎏盘鲎或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何奉献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。一躲拉 字日期：知年J月以学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解逝姿盘鲎有权保存并向国家有关部门

4、或机构送 交本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权逝姿态堂可以将 学位论文的全部或局部内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影印、缩 印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：导师签名：签字日期：?z年r片叫日签字日期：少年一月别日(万方数据浙江大学博士学位论文致谢致谢接近30年的成长道路，离不开亲友和良师的关爱和帮助，特此，在即将结束 学业，开始人生新的征途之际，向你们表示真挚的感谢!首先，我要向研究生期间的导师，浙大求是特聘教授范伟民致以真诚的 谢意。范老师学识渊博，为人豁达乐观，且平易近人。五年前第一次来到实验室， 范

5、老师那温暖的笑容令我至今难忘。五年的光阴转瞬间过，范老师的头发比五年 前苍白了许多，他眼角的皱纹也比五年前密集了许多，然而他温暖的笑容却始终 没有变化，作为一名教授教授，他给我们创造了良好的学习和科研环境，教会了 我们科研的根本思路和方法，带着我们走进科学的殿堂。除了老师的身份，他像 一位慈祥的家长，给予我们温暖的关心，包容我们的错误，陪伴我们在学习和成 长的道路上一路成长，他又像一位要好的朋友，分享我们的生活，和我们一起去 食堂吃饭，去校外踏春。范老师不仅有深厚的学识，还有温文儒雅的谈吐，淡泊 名利的处世态度也深深地打动和影响了我。在此，向范老师多年来辛勤付出致敬! 遇见范老师，作为我学业的

6、导师，是我的荣幸!感谢实验室的每一位同窗，潘杰，司文功，徐良，郑慧琳，沈佳颖，陈丹妮， 钟冠胜，楼威洋。还有已经毕业的师兄师姐，黄圆，蒋东海，邹伟斌等。缘分让 来自五湖四海的我们相聚在范老师的实验室，我们互相帮助，互相鼓励，分享彼 此的快乐，承当彼此的痛苦，组成了一个温馨的大家庭，平淡的研究生生活因为 有了你们而增光添彩。在我即将离开这里之际，向你们对我的帮助表示衷心的感 谢，请记住我永远是你们中间的一员，“we are伐木累!感谢在我成长的道路上指导过我的老师们，特别是我小学的班主任黄莲蓬老 师，高中班主任陈浩老师，研究生期间的合作导师杨义燕老师，浙一传染科的徐 凯进老师。20多年的学生生涯

7、，一路走来，没有你们的帮助，我也许早就已经中 断了学业。庆幸学业的道路上有了你们的引导!还有感谢我的妻子，我们相伴8年，历经风风雨雨，一起走南闯北，陪伴彼 此走过了人生最美好的年华，希望能与子携手，相伴终老。感谢我的母亲在我成T万方数据浙江大学博士学位论文致谢长的时光对我的养育和严格的教导，并用il己瘦弱的肩膀撑起了整个家庭的重担。 你们是我现在在这个世上最亲的亲人，希望我们共同携手，把我们的家给建设好。 感谢其它的亲人，姑姑一家，文母娘，外公外婆，舅舅一家，我的成长离不开你 们的关心与支持。还有很多帮助过我的人，不能一一道谢，在此向你们表示我诚挚的谢意!最后，我最想感谢一位平凡的老人我的祖母

8、。她没有渊博的学识，也没 有万贯的财富，然而她将自己一生的全部时光奉献给了她所爱的亲人，实践了生 命的真谛奉献。回首近30年的人生路，奶奶含辛茹苦地将我抚养成人，视我 为掌上明珠，给了我太多太多，却从来不计任何回报。我总想着等到我工作赚钱 了好好孝敬奶奶，觉得她身体硬朗，回报奶奶来日方长。然而，子欲养而亲不待，在我即将学成之时，因为意外，她永远地离开了她深爱的孙儿。奶奶一生坎坷， 少年丧父，中年丧夫，老年丧子，她生前总是说，她活着最后一个愿望就是看着 我立业生子，然而吝啬的苍天却残忍地拒绝了一个可怜老人最后的一个愿望。世 界上最爱我的一个人就这样永远的离开了我，没有一句il台10的话语，甚至都

9、来不 及见上最后一面。每每想起这些，总是令人肝肠寸断。回忆奶奶的一生，是奉献 的一生，是百折不挠的一生，是平凡中见证伟大的一生。她勤劳，她朴素，她真 诚，她善良，我永远会以有这样一位好奶奶而骄傲!奶奶，您这辈子过得太苦太 累了，愿您在天堂好好的安息吧!您对孙儿的爱，孙儿会一辈子牢牢地铭记在心。 孙儿会对自己的子女儿孙讲述您的故事，将您的美德，世世代代传扬下去!II万方数据浙江大学博士学位论文中文摘要D半乳糖苷a【2，6唾液酸转移酶2的表达与乳腺癌的预后以及 肿瘤进展的相关性研究浙江大学医学院：肿瘤学博士研究生：程骏驰导师：范伟民教授中文摘要乳腺癌是女性发病率第一位的肿瘤，也是女性中常见的肿瘤相

10、关死因。乳腺癌 的诊断治疗措施还不是非常令人满意，需要研究人员们去探索新的诊断或治疗的 靶点。p半乳糖苷oc一2，6唾液酸转移酶1(ST6Gall)是目前研究最为透彻的唾液酸 转移酶之一，在包括乳腺癌在内的多种肿瘤中均出现表达上调，且与肿瘤的进展和 转移关系密切。作为ST6Gall的同工酶，ST6Gal2在近年来被人发现。然而目前 对ST6Gal2功能所知甚少，ST6Gal2对肿瘤进展的作用目前仍不清楚。为了研究ST6Gal2在乳腺癌中的作用，我们收集了40例乳腺癌临床标本和相 应的癌旁正常乳腺组织。我们运用RT-PCR和免疫组化染色来研究ST6Gal2在肿 瘤组织中的表达是否出现升高。我们接

11、下来从癌症基因组图谱(TCGA)数据库 下载了778例乳腺癌病人的基因表达谱和病人疾病特征的数据，并根据患者肿瘤 的ST6Gal2表达水平将其分为两组：ST6Gal2高表达组和低表达组，用Fisher确 切概率法比拟其病理特征的差异：如病理分期，ER，PR，HER2表达水平，年龄等。 此外，我们绘制了两组病人的生存率曲线，用对数秩和检验(Log。rank)统计了两组生存率的差异。随后我们选取了5珠乳腺癌细胞株，用Western Blot检测了它们 ST6Gal2的表达水平，并在其中挑选了两组相对ST6Gal2高表达的细胞株进行后 续实验。我们用siRNA沉默了两株细胞中ST6Gal2的表达，用

12、RT-PCR检测了沉 默的效果。然后用CCK8和流式细胞仪检测了细胞的增值和周期变化，并用纤连III万方数据浙江大学博士学位论文 中文摘要蛋白包被的12孔板和Transwell实验检测了细胞的粘附和侵袭能力的变化。为了 做进一步的机制研究，我们用前面从TCGA下载的基因表达谱数据，做基因富集 分析(GSEA)来研究ST6Gal2的表达与粘附和转移相关的基因集中基因表达的相 关性。并选取了具有代表性的促进侵袭的基因，用RT-PCR和WesternBlot检测了 ST6Gal2的沉默对这些基因表达的影响。我们通过RT-PCR和免疫组化发现，相比拟正常组织，ST6Gal2的表达在肿瘤 组织中升高。我

13、们通过分析TCGA数据得出，ST6Gal2的高表达和年龄以及HER2 的表达水平具有正相关性。重要的是，我们发现，ST6Gal2的高表达与乳腺癌的预 后不佳显著相关。我们通过siRNA沉默两株乳腺癌细胞株ST6Gal2的表达，发现 细胞的生长受到抑制，细胞出现G0G1期周期阻滞，且细胞与基质的粘附和侵袭 能力下降。GSEA分析结果显示，ST6Gal2的高表达与粘附和转移相关基因集中的 基因的表达升高出现显著的相关性。进一步的Western Blot和RT-PCR说明，沉默 ST6Gal2导致6个与转移和侵袭有关的基因：RhoA、TGFB3、VEGFC、CTNNBl、 FUT8以及WISP一1的

14、表达下调。总之，我们的研究说明ST6Gal2的高表达可能导致肿瘤的进展并可能因此导 致乳腺癌病人不佳的预后。我们的发现说明ST6Gal2有潜力成为一个预测乳腺癌 预后的生物学标记或作为治疗的一个靶点。 关键词：乳腺癌；D半乳糖苷仪一2，6唾液酸转移酶2；癌症基因组图谱；基因富集 研究。万方数据浙江大学博士学位论文英文摘要B-galactoside-伐一2，6一sialyltransferase2 oVerexpression is associated with poor prognosis and induces tumor development in breast cancerColle

15、ge of Medicine，Zhejiang UniversityOncologyPhDCandidateJunchi Cheng Supervisor ProfessorProfWeimin FanAbstractBreast cancer is the most common cancer among women worldwide and stays one of the leading causes of cancer deathDespite some progress has seen in the field of breast cancer research，the diag

16、nosis and treatment of breast cancer are still unfavorable SO far,leading to unsatisfactory prognosis and high mortalityTherefore，novel targets for diagnosis and treatment for breast cancer has yet to be discovered 3-galactoside一0【一26一sialyltransferase 1(ST6Gal 1) is one of the best known sialytrans

17、ferase which has been shown by many publications that it is highly expressed in many types of malignancies including breast cancer and plays an important role in tumor development and invasionAs an isoenzyme of ST6Gal l，recently ST6Gal2 has been characterized，however its function in tumor developmen

18、t or tumor invasion has not been clarified yetTo study the potential function of ST6GAL2 enrolled in the regulation of breast cancer,we performed Realtime PCR(RT-PCR)and immunohistochemical stain to detect the expression levels of ST6GAL2 in both tumor tissue and normal tissue of the40 clinical brea

19、st cancer samplesGene expression profile of 778 BC patients was downloaded from The Cancer Genome Atlas(TCGA)and analyzed：We divide patients into ST6Gal2 high expression group and ST6GN2 low expression group，and the association between ST6Gal2 expression and pathological parameters such as tumor sta

20、ge，ER，PR or HER2 profiles and patientsage was measured by Fisher Exact TestV万方数据浙江大学博士学位论文 英文摘要Also，the correlation between ST6Gal2 expression and patientssurvival time was analyzed by Logrank testSubsequently，the expression level of ST6Gal2 of five breast cancer strains was detected by Western Blot

21、 and the expression of ST6GAL2 in tworelatively ST6Gal2 higher expression breast cancer strains was silenced by siRNA RT-PCR and Western Blot was performed to validate the effect of siRNA silenceCell proliferation and cell cycle were analyzed via CCK一8 assay and flow cytometryAlso， adhesion and inva

22、sion were detected by a fibronectincoated 1 2一plate microplate andTranswell assayIn order to clarify the mechanical bases，we performed gene setenrichment analysis(GSEA)to analyze the correlation between elevated ST6Gal2 expression and elevated expression of genes pertaining to adhesion and metastasi

23、s gene setWestern blot and RT-PCR were used to analyze the expression level of genes linkedto adhesion and metastasis pathway in breast cancer cellsWe found that ST6GAL2 expression level was higher in BC tissues compared with normal adj acent tissues via both RT-PCR and immunohistochemical stainWe a

24、nalyzed the data from TCGA and found higher expression of ST6Gal2 was positively correlated to aging and HER2 positive statusImportantly，elevated expression of ST6Gal2 waspositively correlated to worse prognosisWe detected the expression level of ST6Gal2 in five breast cancer strains and found MCF一7

25、 and T47D expressed relatively high ST6Gal2We subsequently tested the in vitro function of ST6GAL2 by silencing the gene expression in MCF一7 and T47DSilencing ST6GAL2 inhibited cancer cellproliferation by arresting cell cycle arrest in G0G 1 phase and dampened cell adhesion and invasionA GSEA analys

26、is revealed that ST6GAL2 was positively correlated with the elevated expression of genes pertaining to the gene sets of focal adhesion andmetastasisFurther Western Blot and RT-PCR showed Silencing ST6GAL2 inhibitedexpression of RhoA，TGFp3，VEGFC，CTNNB 1，FUT8 as well as WISP一1，all of which play a cruc

27、ial role in breast cancer metastasis and invasionIn summary,just like its counterpart ST6Gal l，ST69a12 might play an important role in tumor invasion and thus lead to an inferior prognosis in breast cancer patients These findings indicated that ST6GAL2 might serve as a useful potential target for tr

28、eatment or a prognosis predictor of breast cancerVI万方数据浙江大学博士学位论文英文摘要Key Words：Breast cancer；3-galactosidecL-2，6-sialyltransferase2；The CancerGenome Atlas；gene set enrichment analysisVII万方数据塑坚奎堂堕主等型奎缩略语及中英文对照缩略语及中英文对照：弋：一英文缩写英文中戛-一p_半乳糖苷0l_2，6-唾液酸转ST6Galpgalact。side仪2，6sialyltransferase2；移酶TCGAThe C

29、ancer Genome Atlas癌症基因组图谱 RT-PCRReal Time Polymerase Chain Reaction实时定量聚合酶链反响 DdH20doubledistilled deionized water重蒸去离子水 DEPCDiethypyrocarbonate焦碳酸二乙酯达尔伯克(氏)必需根本培DMEMDulbecc。，s Minimum Essential Medium养基PBSPhosphate Buffer Saline磷酸盐缓冲液SiRNAShort Hairpin Ribonucleic Acid)小干扰RNADNADeoxyribose Nucleic

30、Acid脱氧核糖核酸PIPropidium Iodide碘化丙啶CCK一8Cell Count Kit 8细胞计数试剂盒_8human epidermal growth factorHER2表皮生长因子受体2receptor一2EREstrogen Receptor雌激素受体PRProgesterone receptor孕激素受体TritonX一1 00polyethylene glycol octylphenol ether聚乙二醇辛基苯基醚Wntl Inducible Signaling PathwayWISP1Wml诱导的信号通路蛋白1Protein 1glyceraldehyde-3-

31、phosphateGADPH甘油醛。3磷酸脱氢酶dehydrogenaseVIll万方数据塑望奎堂堕主堂焦笙壅一缩略语及中英文对照一：=：=二：二：二：=：续表缩略语及中英文对照一ESEnrichment Score富集得分FDRFault Discovery Rate错误发现率NESNormallized Enrichment Score标准化富集得分SDSSodium Dodecyl Sulfate十二烷基酸钠PMSFPhenylmethanesulfonyl fluoride苯甲基磺酰氟 TEMEDN，N，N，N一Tetramethylethylenediamine四甲基二乙胺 TGF。

32、p3transforming growth factor。D3转化生长因子受体3FUT8fucosyltransferase 8岩藻糖转移酶8 CTNNB 1J3-CateninD连环蛋白 VEGFCvascular endothelial growth factor C血管内皮生长因子c RhoARAS homolog family member ARAS超家族成员AGSEAGene Set Enrichment Analysis基因富集实验_-一一一IX万方数据目录致谢I中文摘要III英文摘要v缩略语及中英文对照一VIII目录正文、，N蟊1第一局部ST6GAL2在乳腺癌中的表达水平与疾病预

33、后的关系411实验材料与仪器4111实验材料4112实验器材4113实验溶液4114实验方法512实验结果7121临床标本中ST2Gal2的表达水平检测7122 TCGA数据库的数据分析913讨论1214结论13第二局部ST6GAL2在乳腺癌进展中的作用一15 21实验材料与仪器15211实验材料15212实验器材1 5X万方数据213实验溶液16214实验步骤1 622实验结果22211用siRNA沉默ST6Gal2的表达22222细胞增殖和周期的变化24223 ST6Gal2沉默对细胞粘附能力和侵袭能力影响2523讨论2724结论29g-局部ST6GAL2介导肿瘤侵袭的初步机制研究3031

34、实验材料和仪器30311实验材料30312实验器材30313实验溶液30314实验和分析方法3132实验结果35321基因富集分析35322 ST6Gal2对转移相关基因的表达影响3633讨论3834结论41全文总结42全文参考文献43综述49作者简历以及在学期间取得的科研成果71XI万方数据浙江大学博士学位论文正文前言p半乳糖苷伐2，6唾液酸转移酶2的表达与乳腺癌的预后以及 肿瘤进展的相关性研究浙江大学医学院：肿瘤学博士研究生：程骏驰导师：范伟民教授前言恶性肿瘤已成为全世界范围人类的首要死因，据世界卫生组织(WHO)的统 计，2021年，全球新发肿瘤病例到达了1400万例，而因癌症死亡的病例

35、到达820 万例。据WHO预测，未来20年内肿瘤的新发病例可能到达2200万。其中乳腺癌 是最常见的女性恶性肿瘤，也是导致死亡的最常见的癌症之一。根据最新的统计 数据，2021年全中国共报告女性乳腺癌新发病例2686万例，占所有女性恶性肿 瘤新发病例的1511。影响乳腺癌患者预后的因素包括肿瘤大小，病理学分型和分 期，以及是否存在淋巴结或远处转移等。这些参数可以帮助判断哪些患者可能会 受益于积极的肿瘤治疗，而那些患者可能有更高的死亡风险。近年来，鉴别肿瘤 的分子特征成为预测肿瘤预后，以及指导肿瘤治疗中的一个重要方面。在乳腺癌 上，最众所周知的分子标志有雌激素受体(ER)，孕激素受体(PR)，以

36、及表皮生 长因子受体2(HER2)等21。而寻找新的分子生物标志，并弄清其在肿瘤发生发 展中的作用，对预测肿瘤的预后，以及提供潜在的治疗靶标方面有极其重要的意 义。唾液酸(N一乙酰神经氨酸)，是一种经常出现在细胞外表糖蛋白或糖脂等多糖 链末端的一种带阴性电荷的单糖31。各种类型的唾液酸修饰被证明与许多生理或病 理过程有关，例如细胞黏附，抗原识别，肿瘤的迁移和转移，受体的活化和信号 的传导等3，41。催化唾液酸残基连接到糖链末端的是唾液酸转移酶(ST)，唾液酸万方数据浙江大学博士学位论文正文前言转移酶的表达异常导致异常的唾液酸修饰，这是肿瘤糖基化修饰异常的主要原因， 例如仪2，3唾液酸转移酶的表

37、达量升高导致肿瘤外表出现唾液酸化的路易斯抗原 Slex或SLe8并与血管内皮细胞外表表达的选择素的受体相互作用介导循环肿瘤肿 瘤和血管内皮的粘附，易化肿瘤穿透血管内皮从而促进远处转移，此外路易斯抗 原和整合素介导的肿瘤与内皮细胞的粘附还被证明可以促进肿瘤血管的生成【5，61。 根据转移唾液酸后形成的糖苷键类型可以将唾液酸转移酶分成4个亚型【71。其中p一 半乳糖苷Q。2，6一唾液酸转移酶(ST6Gal)催化CMP活化的唾液酸残基与细胞表 面糖复合物的N一乙酰半乳糖胺末端以0【2，6糖苷键的形式连接【8。ST6Gall是研究 最深入的唾液酸转移酶之一。在脊椎动物中广泛表达，而在各类肿瘤中常常出现

38、 表达升高，例如结肠癌91，卵巢癌10】，乳腺癌等，其表达常常与肿瘤的预后不 佳相关12，】。目前，ST6Gall的表达受RAS基因的调控14】，其过表达导致了 肿瘤细胞的迁移和侵袭【15，16】，并可抑制FAS介导的凋亡【17】。除此2_夕t-，有研究表 明，ST6GalI具有调控肿瘤干细胞表型的作用1 81，以及介导化疗耐药的作用： ST6Gall的高表达可以介导卵巢癌对顺铂的耐药191和白血病的多药耐药201，甚至 可介导结肠癌对EGFR受体阻滞剂吉非替尼的耐药211，此外，最近的研究说明， 肿瘤外表的a。2，6唾液酸化修饰增加可以介导机体对肿瘤的免疫耐受221。基于以上 事实，ST6G

39、all被认作一个潜在的癌基因，而针对ST6Gall的药物治疗也受到了 人们的关注23，241。ST6Gal2是近年来发现的ST6Gall的同工酶，与ST6Gall的氨基酸序列有 489相同，与ST6Gall相比，ST6Gal 2在肠道和脑部的表达升高，其生物学功能 ST6Gall相同，但其转移唾液酸的活性低于ST6Gall，并选择性地参与寡聚糖的唾 液酸化25，2刚。目前，很多研究都集中在唾液酸化在肿瘤发生与进展中的作用， ST6Gall的在正常组织和肿瘤中的角色得到了深入的研究并被认为是一个癌基因。 与之相比，仅有少数文献报道了ST6Gal2在乳腺癌中表达升高【271，而ST6Gal2在 肿

40、瘤或正常细胞中的作用那么尚不清楚，需要进一步的研究。因此，在本项研究中，我们试图研究ST6Gal2在乳腺癌进展中的作用。我们 发现在乳腺癌中ST6Gal2的表达经常出现升高，而伴有ST6Gal2表达升高的病人万方数据浙江大学博士学位论文 正文前言其预后常常显著地差于ST6Gal2不升高的病人。在本项研究中，我们还发现 ST6Gal2基因的沉默抑制了肿瘤增殖，黏附，侵袭。进一步的机制研究说明，ST6Gal2 的表达可上调控制粘附和侵袭的基因表达。综上所述，ST6Gal2可能是一个预测乳 腺癌预后的生物学标记物，并且可能成为治疗乳腺癌的一个潜在靶点万方数据浙江大学博士学位论文正文第一局部ST6Ga

41、l2在乳腺癌中的表达水平与疾病预后的关系第一局部ST6Gal2在乳腺癌中的表达水平与疾病预后的关系11实验材料与仪器111实验材料石蜡包埋组织切片总RNA提取试剂盒(天根，北京)，PrimerScript RT reagent (RR037A)逆转录试剂盒(TAKALA，日本)，SYBR Green Relatime PCR Master Mix试剂盒(TAKALA，日本)。RNase free枪头(Axygen，英国)，RNase free 15ml EP管。石蜡，甲醛，二甲苯，无水乙醇，30过氧化氢(国药，上海)广谱 二抗，中性树脂，DAB浓缩试剂盒(长岛生物，上海)，苏木素，柠檬酸，柠檬

42、 酸钠(Sigma。Aldrich，美国)；ST6Gal2抗体(abcam，美国)。112实验器材PCR仪(BIORAD，美国)，RT。PCR仪(Roche，美国)，制冰机(Thermo， 美国)，低温高速离心机(Thermo，美国)，微量移液器(Gilson，法国)，冷冻 冷藏冰箱(海尔，山东青岛)，涡旋混合器(琪特，上海)，紫外分光光度计 (SHIMADZU，日本)；石蜡切片机(徕克，上海)，石蜡摊片机(徕克，上海)， 显微镜(OLYMPUS，日本)，恒温水浴锅(精恒，上海)。113实验溶液PBS溶液：600 ml的ddH20中溶解8 gNaCl、02 gKCl、144 gNa2HP04和

43、024g KH2P04，HCl调节溶液pH至74，定容至1 L，滤器过滤后，高压灭菌，室温保-仔。o1 molL枸橼酸酸钠缓冲溶液：用o1 molL柠檬酸38 ml、o1 molL柠檬酸钠162 mL混合。不同浓度的酒精溶液：按比例取无水乙醇和PBS缓冲液，混合均匀，4密封 保存。4万方数据浙江大学博士学位论文正文第一局部ST66a12在乳腺癌中的表达水平与疾病预后的关墨114实验方法RlPCK(1)提取石蜡样品总RNA 取临床切除的乳腺癌标本，并用石蜡包埋，4保存。采用石蜡包埋组织切片总RNA提取试剂盒操作步骤提取石蜡样品总RNA。并用紫外分光光度计测量RNA 的纯度。提取RNA的大致流程为

44、：切取石蜡样品薄片，将5张切片置于RNasefree 离心管中，加1 mL二甲苯，涡旋，室温离心12000 rpmmin，2 min。取沉淀参加 l mL无水乙醇，涡旋，离心。吸除上清，翻开管盖，将剩余乙醇挥发完。参加裂 解液RF和蛋白酶K，涡旋，55。C和80。C分别孵育15 min。室温，离心12000 rprrdmin，5min。取上清转移入新的RNaseFree离心管。加缓冲液RB，涡旋，加 无水乙醇，涡旋。将溶液和沉淀参加吸附柱CR3，12000 rpmmin离心。弃掉收集 管中的废液。配置DNAse I工作液，向吸附柱CR3中央参加80旺，室温放置15 min。 先后向吸附柱CR3

45、中参加500 p,L去蛋白液RWl和漂洗液RW，室温12000 rpm离 心1 min，弃废液。重复漂洗步骤数次，并室温晾干。将吸附柱CR3转入新的 RNAseFree离心管中，向吸附膜中间部位滴加DEPC水，室温放置2 min，12000 rpm离心2 min，得到RNA溶液。(2)反转录 按以下体系参加：DEPC水25 BL；5PrimeScript Buffer 2 BL；PrimeScript RT Enzyme MIX 105 gL；RT Primer 2L；Total RNA 3灶L，总体积10灶L。反响程序：42。C，15 min；85。C，5s；4。C，5min；稀释到20L，

46、置于一20。C保4-仔。(3)实时定量PCRGADPH的引物序列为5AcccACTcCTcCAcCTTTG3(上游引物)和5一 cCAcCAcccTGTTGcTGTAG3 (下游引物) ST6Gal2 的引物序列为 5-CCCACGTTCACACCATTCTC3 ( 上 游 引 物 ) 和 5一GGTGGCTCACGCCTATAATC一3(下游引物)，引物序列委托生物公司合成。按照气万方数据浙江大学博士学位论文 正文 第一局部ST6Gal2在乳腺癌中的表达水平与疾病预后的关系TAKALA公司生产的SYBR Green Relatime PCR Master Mix试剂盒(RR420A)的 操作

47、步骤，采用GADPH作为内参，RTPCR检测ST6Gal2基因的表达。扩增体系 如下：SYBRGreen Mix 125儿；2)上游引物F o5 gL；3)下游引物R 05“L；4)DEPC dH20 95旺5)cDNA模板2 gL。总体积25此。PCR仪的设置为：1)预变性95。C，30 S， (升温速率44。Cs)1周期。2)PCR分析模式：定量分析95。C，5 S(升温速率44。Cs)； 60。C，30 S(升温速率22。Cs)40周期。3)融解分析模式：融解曲线95。C，5 S(升温速率44。Cs)；60。C，30 S(升温速率22。Cs)；95升温速率o1 1。Cs；1周期。 4)降

48、温5030 S。5)数据分析，本实验采用相对定量法，mRNA相对表达量=2。饥，ACT=CT。 的基因一CT内参基因。免疫组化取上述包埋完成的切片，将玻片置于65。C恒温烘箱中烤片30 min；置于二甲 苯I中浸泡15 min，再置于二甲苯II中浸泡15 min。将脱蜡后的切片经100酒 精、95酒精、85酒精、75酒精分别浸泡5 rain，自来水冲洗10 rain。水浴锅 加热枸橼酸钠缓冲液至95。C左右，放入切片加热10一15 rain。将玻片置于3H202 中，湿盒孵育1 0 rain，以消除内源性过氧化物酶的活性。PBS冲洗3minx3次。滴 加一抗，湿盒孵育，或者4。C孵育过夜。PB

49、S冲洗3 minx3次。滴加HRP标记广 谱二抗，湿盒孵育，室温下放置20 rain。30 rain。PBS冲洗3 minx3次。DAB染色， 观察到切片有颜色改变时，立即用自来水洗去染色液。苏木素复染3 rain，1盐酸 酒精分化，显微镜下观察，控制染色程度。自来水冲洗10 rain，放入65。0烘箱中 烘干水分。将玻片置于二甲苯中透明3 minx2次，中性树胶封片，放入65。C烘箱中15 min。通过显微镜观察各组的基因表达情况并拍照，采集分析样本相关部位， 并计算阳性面积。万方数据浙江大学博士学位论文正文第一局部ST6Gal2在乳腺癌中的表达水平与疾病预后的关系TCGA数据库数据获取和分

50、析登录癌症基因组图谱公共数据库 s：tcga-datancinihgovtcga下载乳腺癌 的基因表达谱数据和相应的病人临床特征信息，总共获得1041例乳腺癌的基因组 表达谱数据，其中778例有对应的临床信息。分析基因组表达谱并选取ST6Gal2 的表达信息。根据ST6Gal2的平均表达水平将病人分为两组，高于平均表达水平 的高表达组和低于平均表达水平的低表达组。采用Fisher确切概率法分析ST6Gal2 的高表达与影响预后的临床病理特征如年龄，淋巴结转移情况，临床分期，ER表 达情况，PR表达情况，HER2表达情况的关系；对数秩和检验(Logrank)分析 生存两组率曲线之间的差异显著性。

51、统计学分析采用SPSS软件(V210)统计数据。用T检验分析RTPCR数据和免疫组化 样本中ST6Gal2阳性染色面积；认为P005时为有统计学差异。12实验结果121临床标本中ST2Gal2的表达水平检测为了检测ST6Gal2在乳腺癌中的生物学作用，我们收集了40例手术切除的乳 腺癌组织和癌旁正常乳腺组织，进行固定并制作石蜡标本。我们首先用RTPcR 检测了病人肿瘤组织和周边正常组织的ST6Gal2的mRNA相对表达。结果如图11 所示，与正常乳腺组织相比，乳腺癌病人肿瘤组织中的ST6Gal2表达水平升高了 172倍，t检验显示两者差异具有显著性(P0001)。万方数据浙江大学博十学位论文I

52、I!文第一局部ST6Gal2存乳腺痛I勺表达水平与疾病预后的火系0，04?Z叱E O03 002O01N1Vo_L口I-旦口篮000Norma图11临床样本中ST6Gal2的相对表达情况ST6Gal2的mRNA相对表达量的计算 方法为2“sT6断T堕。GADP盯T。绿色和红色的柱子实体代表25一75的样本区间 范围，柱子实体两侧的线条代表样本的最大分布范围。中间的横线代表中位数。 Normal：正常乳腺组织Tumor：肿瘤组织。：l：木丰说明正常组织和乳腺癌组织ST6Gal2 的表达水平差异的P值0001。k。0、!-j_，。，。，式、，oi、。jj：、1一|，。一，：爻，黪毒j：、!、：l、

53、o!。：伊：。：j 0：。?，I，一0、誊蠢等冀_|-。4亨亭f：万方数据浙江大学博士学位论文正文第一局部ST6Ga2在乳腺癌中的表达水平与疾病预后的关系122 TCGA数据库的数据分析我们进一步分析了TCGA数据库上778例病人的ST6Gal2表达情况和临床资 料。该778例病人的一般临床资料如表11所示。该778例病人平均年龄为58岁， 最小年龄26岁，最大年龄90岁。99的病例为女性，而862的病例为乳腺导管 癌。AJCC临床分期I、II、III、的病理占比分别为171、572、238、19。 根据该778例乳腺癌病人的ST6Gal2平均表达水平，将病人分成两组，表达水 平高于平均水平的

54、ST6Gal2高表达组(n=440)和表达水平低于平均水平的ST6Gal2 低表达组(n=338)。我们采用Fisher确切概率法分析ST6Gal2的表达与影响预后 的临床病理特征如年龄，淋巴结转移情况，临床分期，ER表达情况，PR表达情 况，HER2表达情况的关系，结果如表12所示。ST6Gal2的表达水平和病人的年 龄以及HER2的状况显著相关，HER2阳性，年龄大的患者其ST6Gal2高表达的概率显著升高。这提示ST6Gal2的表达可能与预后不良相关。而淋巴结转移与否， PR状态，ER状态，临床分期等临床特征与ST6Gal2的高表达与否没有显著性的 关联。万方数据浙江大学博士学位论文正文

55、第一局部ST6Gal2在乳腺癌中的表达水平与疾病预后的关系年龄(平均，范围)58，(2690)(years) 性别女770(9901男8(100)病理学分型导管癌67 1778(862)小叶癌65778(840)其它42778(540)肿瘤位置左乳401778(5 15)右乳377778(485)AJCC临床分期I133778(171)II445778(572)I1 85778(238)_r、，15778(190)10万方数据浙江大学博士学位论文正文第一局部ST6Gal2在乳腺癌中的表达水平与疾病预后的关系表12ST6GAL2表达水平与乳腺癌临床病理参数之间的关系接下来我们分析了ST6Gal2

56、的表达水平和病人的预后之间的关系。根据上文 的方法，我们将病人分为ST6Gal2高表达组和ST6Gal2低表达组，并绘制生存曲 线。我们用对数秩和检验(Logrank)分析生存两组率曲线之间的差异显著。结果 如图12所示，ST6Gal2高表达组病人总生存率显著低于低表达组病人，两组生存 率曲线之间存在显著性差异(P=0017)。说明ST6Gal2可能对乳腺癌的预后有影 响。万方数据浙江大学I尊十学位论文 JI：文第一局部ST6Gal2存乳腺痛扣的表达水半与疾病预后的义系Tmle(days)图13 ST6Gal2高表达组和低表达组病人的生存率曲线根据TCGA数据库中乳 腺癌病人的ST6Gal2表达量的数据，将病人分为两组，分别绘制生存率曲线。横 坐标为存活时间，纵坐标为生存率。红线为ST6Gal2高表达组，蓝线为低表达组。13讨论肿瘤外表分子的唾液酸化在肿瘤的发生开展当中扮演的重要的作用，ST6Gall 是与肿瘤进展关系最密切的唾液酸转移酶之一，在肿瘤的唾液酸化修饰中具有重 要的地位，在多种恶性肿瘤中均发现的ST6Gall的表达上升。ST6Gal2是近来发 现的ST6Gall的同工酶。之前的研究多集中在ST6Gall的角色