第十四讲 蛋白芯片和组织芯片.ppt

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1、蛋白芯片和组织芯片第十四讲第十四讲蛋白质组学(proteomics) 以细胞内全部蛋白质的存在及其活动方式为研究对象 蛋白质组学不同于传统的蛋白质学科之处在于它的研究是在生物体或其细胞的整体蛋白质水平上进行的，它从一个机体或一个细胞的蛋白质整体活动的角度来揭示和阐明生命活动的基本规律。蛋白芯片 蛋白芯片是微缩化的如ELISA的免疫检测方法 跟DNA芯片类似，蛋白芯片是把抗原、抗体、多肽样本高密度地点制在芯片上，使多种样本能同时得到检测 可借用DNA芯片产业的成熟经验，如点样仪，扫描仪，图像处理，蛋白芯片的制备以蛋白共价结合在玻片上为主，便于快速和自动处理 提高了蛋白质鉴定的速度与重复性，在蛋白

2、质的生物活性以及大分子与蛋白质之间相互作用等方面展示了独有的魅力 蛋白芯片的操作流程 点样样品的准备：蛋白的纯化，并将蛋白溶解于点样液中 点样 点样后：洗涤洗去未结合的蛋白质 蛋白芯片的封闭（blocking） 将待检的蛋白样品或小的分析物加入到蛋白芯片上；加入蛋白质样品与芯片进行抗原抗体反应 洗涤、检测 在上述各步中要特别注意降低非特异的结合，同时增强检测的灵敏度和精确度芯片制备 芯片制备的方法包括机器人接触式点样、压电喷墨点样。这与DNA芯片相似。 为达到蛋白质组学分析中揭示蛋白表达特征（包括蛋白质修饰）、蛋白质相互作用、蛋白质的功能等目的，要将蛋白质固定在固相支持物的表面，并保持其原有的

3、折叠构相（functional protein activity）及生物学功能，所以在固定及之后的操作中要保持蛋白质的水合状态以防止变性。 玻片由于具有廉价、表面光滑、低荧光背景及性能稳定等优点，已经被广泛应用于蛋白质微阵列的制作 蛋白质一般要在点样液中加入含甘油、BSA的磷酸盐缓冲液中，以防止微滴的蒸发。制作芯片的表面基质 和良好的DNA芯片表面一样，良好的蛋白质芯片基质表面应该适合不同的化学处理。 能获得良好的，形态一致的样点 尽量降低非特异结合 应考虑到不同蛋白不同的理化性质，如极性、疏水性、电荷和结构，蛋白芯片应能使点在芯片上的不同种类的蛋白能与待检的其他蛋白或配基结合 根据蛋白芯片用

4、途的不同，使用不同的蛋白固定方法。一般的蛋白固定方法包括：被动吸附、共价偶联、亲和结合被动吸附（passive adsorption） 是制备蛋白芯片最简单的方法：将蛋白直接点样到疏水或荷电介质表面，蛋白将被吸收 Lueking等用点样机器人将蛋白溶液高密度点样到PVDF滤膜上，可以在滤膜上检测到特定的蛋白，且具有较高的灵敏度 在分析自身免疫病人的血清进行自身抗体定量分析的过程中，Joos等人利用硝酸纤维素膜、多聚赖氨酸包被的载玻片制做芯片。另外，也可以将硝酸纤维素膜放在载玻片上以便进行芯片的制备及后续的检测分析。 聚赖氨酸修饰玻片虽然不是通过共价键固定蛋白质的，但由于聚赖氨酸修饰玻片广泛地作

5、为基因芯片的载体，且制作简单，具有较高的信躁比以及较均一的点样形态等优点，仍有许多蛋白质微阵以聚赖氨酸修饰玻片作为载体。 Angenendt等通过比较多种载体以及其表面修饰方法发现，聚赖氨酸修饰的玻片上点样点的形态比较均一，点间变异系数(11%)小于其他载体。但是聚赖氨酸修饰玻片同其他二维载体表面一样，敏感度不佳，最低检测限较高。 Haab等报道了用聚赖氨酸修饰的玻片为载体的抗体微阵列来研究抗原抗体的相互作用，但在玻片表面固定抗体时拖尾现象很明显，而且在点的内部抗体的分布也是不均匀的，影响结果的正确性和精确性。被动吸附表面介质 聚苯乙烯塑料表面（polystyrene plastic surf

6、ace） 聚丙烯酰胺凝胶（3-dimensional polyacrylamide gel）是一种三维表面的介质，与二维表面相比，可以提供更高的灵敏度、动态范围和天然构想。它是基于聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理。丙烯酰胺凝胶聚合后，可以将成型的胶置于载玻片表面，Miller等人将184个抗体点样到水凝胶包被的载玻片和多聚L赖氨酸包被的载玻片上(with a cross-linking layer) ，水凝胶表面的的信噪比更高。 被动吸附适于进行灵敏的蛋白质表达及抗体特异性的筛选，但是由于蛋白是随机吸附到介质表面的，蛋白会有部分的变性，无法进行定量分析，蛋白结合到基质上的方向也很难控制。不同蛋白质的吸

7、附能力不同，信躁比也较低。 由于某些吸附能力较弱，洗脱过程中一些蛋白质有可能脱落。由于蛋白质在基质表面固定的部位及方向不同，其生物活性将有所差别，使实验的重复性不好。共价交联covalent coupling 大部分蛋白质芯片的制备方法都依赖通过蛋白质表面的氨基或巯基与活化的介质（通常为玻片）表面随机的共价交联。 MacBeath和Schreiber使用乙醛aldehydes 、甲硅烷处理载玻片，然后将蛋白质点样到处理过的玻片上。乙醛与蛋白N端氨基或蛋白质表面赖氨酸反应形成Schiff碱，这样可以使蛋白以几个特定方向与芯片表面连接，以便蛋白可以用不同的表面与其它蛋白或小分子反应。他们用这种方法

8、成功地检测了蛋白蛋白反应，分离出蛋白激酶的底物。醛基修饰玻片 醛基修饰玻片也是在DNA微阵列中广泛应用的载体，现在这一方法在蛋白质微阵列中得到了应用。该方法通过醛基和蛋白质上的氨基形成Schiff碱而把蛋白质共价固定到载体表面，由于蛋白质表面通常含有多个氨基，这些基团都能和载体表面的醛基结合，所以蛋白质在表面的固定是无序的。 通常用含乙醛的硅烷试剂处理载玻片，使载玻片表面带有活性醛基基团，醛基与蛋白质所带的氨基反应而将蛋白质固定在载体上，这种方法适合固定较大的蛋白质分子. 玻片表面上未反应的醛基用小牛血清白蛋白(BSA)封闭，同时在载体表面形成的BSA分子层作为分子屏障防止了其他分子和微阵列载

9、体的非特异性结合。共价交联醛基修饰玻片 BSA封闭后，由于BSA分子层的屏障作用，阻碍了待检物质和微阵列上小的蛋白探针的结合 若固定较小的蛋白质分子或肽，则用BSA-NHS修饰载玻片，具体方法为：先在载玻片上吸附上一层BSA分子，然后用N,N 一二珑拍酞胺碳酸(N, N -disuccinimidylca rbonate)进行活化，BSA上的赖氨酸、天门冬氨酸、谷氨酸残基活化后可以与待固定蛋白质氨基共价结合而把蛋白质探针固定在载体上面，然后再用甘氨酸封闭未反应的活性基团共价交联环氧基修饰玻片 环氧基修饰玻片是一类较新的蛋白质微阵列载体，其表面的环氧基活性很强，不但可以和氨基反应，还可以和蛋白质

10、表面的其他基团如羟基、巯基、羧基等反应 经过氨丙基三甲氧基硅烷(aminopropyltrimethoxysilane,APPS),巯丙基三甲氧基硅烷(mercaptopropyltrimethoxysilane,MPTS)、丙基三甲氧基硅烷(glycidoxypropyltrimethoxysilane,GPTS)和多聚赖氨酸修饰的700多张玻片进行了详细的比较分析，结果各种玻片表面修饰方法中，经丙基三甲氧基硅烷处理的环氧基玻片最为理想。 zhu等将蛋白共价交联到具有甲硅烷接头的玻璃介质表面。 将液态硅酮橡胶Liquid silicone elastomer倒在蚀刻好的模子上，再将成型的橡胶

11、覆盖在玻片表面制备成有微孔的芯片。用一种交联剂GPTS（glycidoxypropyltrimethoxysilane）活化表面，然后将蛋白（激酶、底物等）交联到基质表面。与酶联免疫吸附测定类似，在加激酶、33p -ATP和缓冲液前先用1% BSA对微孔芯片进行封闭。在已知的122种酵母蛋白激酶中，用十七种不同的底物蛋白芯片对其中119种蛋白进行了分析。他们发现了许多可以进行酪氨酸磷酸化的激酶。共价交联covalent coupling 共价交联的方法使活化的介质表面和蛋白的连接更稳定，蛋白质也更少发生变性。但是由于多个连接位点的拉伸作用，变性仍不可避免。蛋白连接的方向也是多样的，连接位点可能

12、会封闭所固定的蛋白与抗原相结合的位点，这是由于对抗原结合位点的直接化学修饰，或者介质表面和相邻抗体的空间位阻。 共价交联制备的芯片实验重复性较好。共价交联covalent coupling 亲和结合Affinity binding 通过生物素（biotin）抗生物素蛋白链菌素（avidin）或hexahistidine镍（Ni）的相互作用介导的亲和结合是一种常用的生物学结合方法。 zhu等人报导在5800种酵母蛋白的N端融合上谷胱苷肽S多组氨酸(GST-His6)。然后将这些蛋白在酵母中表达。将蛋白样品点到镍包被的载玻片上，融合蛋白即可以其N端的His6与载体结合。蛋白结合的方向是一致的。同时

13、他们还将蛋白点到乙醛处理过的载玻片上。虽然两个载玻片上都可以固定蛋白质，但镍包被的载玻片固定得更好。 hexahistidine镍与目标蛋白间的连接不是非常牢固，由于对很多常用化学试剂非常敏感，连接容易断开。 生物素抗生物素蛋白（biotin-avidin）相互作用的连接则在许多化学环境中都很牢固，是稳定的非共价结合。所以目前这种连接被广泛应用于生化反应中的固定。亲和结合Affinity binding 亲和结合Affinity binding ABS为亲和素(avidin)生物素(biotin)系统(system)的略语。 亲和素是一种糖蛋白，分子量60000，每个分子由4个能和生物素结合的

14、亚基组成。生物素为小分子化合物，分子量244。用化学方法制成的衍生物素-羟基琥珀酰亚胺酯可与蛋白质和糖等多种类型的大小分子形成生物素标记产物，标记方法颇为简便。 生物素与亲和素的结合具有很强的特异性，亲和力较抗原抗体反应大得多，两者一经结合就极为稳定。 Silzel 等曾利用吸附在聚苯乙烯表面的亲和素avidin将生物素化的捕捉抗体连接到载体上。他们用到的是一种商品化的去糖基化亲和素NeutrAvidin，在连接能力方面它与抗生物素蛋白链菌素（streptavidin）或avidin没有统计上的差别。在制备抗体芯片时，将点有NeutrAvidin的芯片与过量的生物素化的捕捉抗体共同保温。 Ro

15、we等人也报导过类似的亲和连接方法。他们是通过交叉连接将生物素化的抗体固定到avidin包被的硅烷化的载玻片上。亲和结合Affinity binding 亲和结合Affinity binding 为保持蛋白地生物活性使之与配体或底物结合，蛋白与基质结合的方向很重要。亲和结合可以保证蛋白的方向性和牢固性。 亲和结合的蛋白在其末端需要一个标签，所以要求蛋白质要适合修饰。二维表面修饰 以玻片为载体的二维表面修饰如聚赖氨酸聚赖氨酸修饰、氨基修饰、醛基修饰、环氧基修饰及链霉亲合素修饰等都可以归为此类。这类载体大部分通过共价键或特殊分子间的高亲合力把蛋白质固定在其表面，所以蛋白质结合牢固。 制作相对简单，

16、点样点形态较为均一，在目前应用比较广泛。但是该类载体对蛋白质的固定量仍不理想，固定在上面的蛋白质容易变性。三维表面修饰 在玻片表面包被一层凝胶或树突状多聚物，然后可以再在这些基质上引入活性基团，从而在玻片表面形成了三维立体结构。如用聚丙烯酞胺在玻片表面构建了具有三维立体结构的凝胶微阵列载体。 这种三维结构的载体相比二维载体表面有以下几个优点:首先，由于三维多孔结构，载体表面和蛋白质探针的接触面积大大增加，从而对蛋白质的固定量也比二维平面载体大得多;其次，凝胶内的湿润微环境使固定在上面的蛋白质溶液不易蒸发，从而更好地保持了蛋白质的活性，减少了蛋白质的变性失活。三维结构的缺点 表面修饰载体荧光背景

17、较强，载体的三维多孔结构使非特异性结合的蛋白质滞留在其中不易洗脱，同时这些三维结构的载体本身就具有较高的荧光背景。 三维修饰表面是近年来较受注目的一种修饰方法，显著增加的蛋白质固定量以及有利于保持蛋白质活性是这类载体的主要优点，但该类载体制作复杂，不同实验之间以及同一实验内部变异较大。protein microarrayarrayIT TMG. MacBeath and S.L. Schreiber, 2000, Science 289:1760、 蛋白质G（Protein G）和免疫球蛋白（IgG）; 、 核因子NF-B复合物中的p50和NF-B抑制因子IB; 、 FKBP-rapamyci

18、n结合蛋白（FRAP）的FKBP12-rapamycin结合域（FRB）和人immunophilin FKBP12蛋白，这二种蛋白质的结合作用需要小分子rapamycin。 将各对蛋白质中的第一种同时点样于醛基化玻片，每种蛋白质重复四个点，制备5张芯片，分别与不同荧光标记的配体蛋白质杂交反应，结果与预期一致：偶联BODIPY-FL荧光素的IgG或Cy3- IB只能检测到其各自作用的蛋白质 G或p50。而且，只有加入rapamycin后，Cy5标记的FKBP12才能与FRB蛋白质样点作用产生荧光信号，说明固定于芯片上的蛋白质保持了功能活性。蛋白质的预处理 通常用来制备芯片的蛋白质应具有较高的纯度

19、和完好的生物活性，所以点样前必须选择合适的缓冲液将蛋白质溶解。一般是采用含40甘油的PBS缓冲液，一则可以防止溶液蒸发，使蛋白质在芯片的整个制作过程中均保持水合状态；再则该缓冲液可有效防止蛋白质变性，从而维持其生物活性。蛋白质预处理完毕即可加入样品槽中进行点样。点样制备蛋白分子微阵列 点制基因微阵列的商业化点样仪也可以用于点制蛋白微阵列。 微阵列的封闭 蛋白质固定后要将载体上其他无蛋白质样品区域封闭，以防止待测样品中的蛋白质与其活性基团结合、形成假阳性。针对上述几种载体，封闭所用的试剂主要有BSA和Gly两种。封闭后，用PBST(含0.1%Tween 20的PBS)反复洗涤芯片，除去多余的封闭

20、液。小 结 蛋白芯片的点样方式 蛋白芯片实验基本流程及其注意事项蛋白芯片的应用蛋白芯片的应用 抗体芯片Antibody (Ab) Microarray 比较两种生物学样本中基因表达的相对差异 玻璃芯片上点共价结合有上百个抗体covalently bound，如单克隆抗体 抗体是由单克隆细胞产生并纯化得到的，可大规模生产，具有特异性和一定亲和能力，能与特定的靶分子抗原进行结合 可用于毒性检测，疾病筛查和药物发现等多项研究AntigensAntibodies 抗原： 能够在机体中引起特异性免疫应答的物质称为抗原 由于免疫应答同时取决于机体，而不仅是进入机体的物质，所以抗原的定义是相对的。 按临床意

21、义分为外源性和内源性抗原。许多抗原是血液或其他体液中不存在的外源物质。 抗体： 抗体是在抗原刺激下机体免疫应答的产物。所有抗体都具有与抗原特异性结合的能力。 抗体的化学本质是免疫球蛋白即球蛋白。不过只有当免疫球蛋白针对已知抗原时，才能够称这种免疫球蛋白为抗体。 抗体活性是指与抗原特异性结合的能力，即二者之间的特殊亲合力。两者非共价键结合。普遍存在于哺乳动物和人类的血液、组织液中。 IgG, IgA, IgM, IgD, and IgEAntigensAntibodies抗体的结构抗体的结构 抗体是具有4条多肽链的对称结构，其中2条较长、相对分子量较大的相同的重链(H链)；2条较短、相对分子量较

22、小的相同的轻链(L链)。链间由二硫键和非共价键联结形成一个由4条多肽链构成的单体分子。 Y型结构Antigen/Antibody InteractionAb Array 试验流程 从样品中抽提蛋白质，如血清 用荧光染料Cy5 and Cy3分别标记蛋白质 (direct labeling, paired Ab sandwich assay). 洗涤去掉未结合的染料 与蛋白芯片反应 扫描，分析结果 基于荧光标记的分析：共价耦联固定在玻片上的抗体用来捕捉荧光标记的抗原 所有的抗体需要经过质控检验，利用各自纯化的特异性的抗原或利用细胞系或组织样本检测过其特异性 参照样本的选择（reference p

23、ool）： 类似于基因芯片的参照样本的选择，从每个样本中取等量的样本进行混合，保证参照样本中每种蛋白都有sandwich-style antibody-pair microarray assays.single antibody/labeled sample microarray assays.一般选择两个针对抗一般选择两个针对抗原上不同决定簇的抗原上不同决定簇的抗体体直接标记Direct Labeling 样本中所有的蛋白都用荧光或者生物素biotin进行标记 优点：优点： 对于每个靶蛋白只需要一个特异性的抗体，可检测那些只有一个抗体的靶蛋白 缺点缺点: 背景比较高：所有的蛋白都直接从样本中

24、进行标记，样本中的蛋白包括了血清中高浓度的白蛋白albumin；非特异性的结合或者这些高浓度蛋白对抗体的吸附作用可以导致对试验结果的干扰 检测灵敏度的下降和数据准确性的下降 标记位点可能严重改变抗原结合位点，导致抗原抗体结合位点的破坏 双抗体夹心法 Dual Antibody Sandwich 抗体点在芯片上，捕捉抗原底物后，再加入检测抗体 （detection antibody），后续加入每个抗体与点于芯片上的抗体是一一对应关系，即对应着同一个抗原。 优点优点: 通过两个特异性抗体与抗原的结合，提高了特异性，因而夹心法比直接标记法更灵敏 缺点缺点: 由于芯片上是同时点了多种抗体，用于同时检测

25、多种抗原，而后续试验过程中又加入了多种检测抗体，过多的抗体加入同一反应体系中，可能导致交叉反应和抗体的沉淀 protein microarrays (Antibody arrays)ELISA 方法检测抗体芯片结果方法检测抗体芯片结果The Enzyme-Linked Immunoab Sorbent Assay 是经典的用于是经典的用于检测样品中抗原抗体结合的方法。检测样品中抗原抗体结合的方法。ELISA技术在抗原或抗体上结技术在抗原或抗体上结合了酶反应基团（合了酶反应基团（measurable enzyme）。抗原或抗体的固相）。抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。加入酶反应的底物后，

26、底物被酶催化化及抗原或抗体的酶标记。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，由此成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，由此进行定性或定量分析。进行定性或定量分析。用血浆信号蛋白对阿兹海默症的诊断进行分型及预测用血浆信号蛋白对阿兹海默症的诊断进行分型及预测 Classification and prediction of clinical Alzheimers diagnosis based on plasma signaling proteins. Nature Medicine 13, 1359 - 1362 (2007) RayBi

27、otech的核心产品（人C-1000抗体芯片）， 一次性可检测120个细胞因子 从老年患者的血浆中鉴定出18个生物标志蛋白。实验证明用这18个生物标志蛋白来预测阿兹海默症与诊断结果相比有高达90%的准确率。经过生物学分析，研究者认为早期阿兹海默症的造血功能、免疫反应系统，细胞凋亡及神经元架构的功能失调会导致这18个蛋白标志物的改变。这一发现的意义在于对阿兹海默症（Alzheimers disease）进行分子水平的检测能够帮助完善对此病症的处理及治疗。实验发现的血浆中的这18种信号蛋白不仅可以用来对阿兹海默症进行分型，还可以用来鉴别出一些有轻微认知障碍的人，这些人在2-6年后也可能进展为阿兹海

28、默症患者。 RayBiotech L系列抗体芯片系列抗体芯片 高通量高通量 RayBiotech L系列抗体芯片是目前同类产品化抗体芯片中检测指标最多的。这些蛋白包括细胞因子，趋化因子，生长因子，血管生成因子，蛋白酶，可溶性受体和其他细胞培养上清中存在的蛋白以及作为内参的看家基因。 人L系列抗体芯片（同时检测507种蛋白质） 小鼠L系列抗体芯片（同时检测308种蛋白质） 大鼠L系列抗体芯片（同时检测90种蛋白质）SELEX 技术及aptamer SELEX 技术 适配分子（aptamer）技术是一种体外筛选和放大技术，通过该技术可得到一段能与各种目标分子高亲和、高特异结合的核酸序列，该核酸序列

29、称为适配分子（aptamer）。这种体外的筛选技术就称为指数级富集的配体系统进化技术（systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX） SELEX技术应用大容量的随机寡核苷酸库，结合PCR，以指数级富集与靶分子特异结合的寡核苷酸，经过几轮至数十轮的筛选，获得高亲和力、高特异性的核酸配基。SELEX技术的发展 1990年，Tuerk等人和Ellington等人首次利用该技术成功地筛选出T4DNA聚合酶和有机染料的RNA特异配基 此后，利用SELEX技术筛选到的靶分子从开始的一些核酸结合蛋白，如DNA聚合酶、复制酶、逆

30、转录酶，扩展到非核酸结合蛋白，如细胞生长因子、激素、小肽、抗体及ATP、氨基酸等小分子有机物，甚至金属离子。SELEX技术基本路线（1） 首先用组合化学合成DNA的方法合成随机序列的核酸库。 在一定温度下将寡核苷酸随机序列库与靶分子共同孵育于缓冲液中，组合库中的极少数分子将与靶分子结合。SELEX技术基本路线（2） 将结合的分子与未结合的分子分离开。如靶目标是蛋白质分子，通常用硝酸纤维素膜截留与靶蛋白质分子结合的序列，或预先用生物素修饰靶蛋白质分子，再用表面包被有链亲和霉素的磁珠捕获与蛋白质分子结合的序列。对于小分子靶目标，预先将其固定到固相支持物上制成亲和基质，通过简单的洗脱即可分离结合与非

31、结合序列。 SELEX技术基本路线（3） 侯选序列的DNA片段和RNA片段，可分别通过PCR和RT-PCR扩增，再开始下一轮筛选。随着每一轮筛选严谨度的不断增加，低亲和力序列逐步被淘汰。严谨度与温度、pH值、金属离子、靶目标浓度等有关 在每一轮筛选中应进行平行的亲和力检测实验 ，约经1015轮筛选后可达到亲和饱和度，PCR扩增产物即用于克隆、测序。 SELEX技术基本路线 针对同一靶分子，用不同类型的寡核苷酸文库筛选得到的配基序列是完全不一样的。 如用单链DNA文库筛选的凝血酶的特异结合配基序列是G四联体结构，而用5（1戊炔基）2脱氧尿嘧啶替代该DNA文库中的胸腺嘧啶，筛选出的特异配基序列完全

32、不一致，若改用RNA文库，则筛选出的特异核酸配基为茎环结构。这三种配基皆有抗凝血作用文库构建 RNA文库由含有T7启动子的双链DNA模板转录产生 单链DNA文库：双链DNA模板变性：将双链DNA模板库热变性后快速冷却， DNA无法复性； PCR引物5端标记生物素，扩增后纯化有生物素的单链；不对称PCR；逆转录影响因素 针对不同的靶分子、不同的文库、不同的实验目的所需要的筛选条件都不相同 对不同靶分子分离介质不同：对小分子通常用固定化的配基制成亲和层析柱；对大分子，常将靶分子固定在特殊修饰的纤维素滤膜上Aptamer的优势（1） 对大多数靶分子而言，鉴定过程经815次循环可达到要求，一次典型的S

33、ELEX过程需23个月。比制备单克隆抗体所需时间短。 适配体最突出的特征是高亲和力与高特异性，有的适体的亲和力甚至高于天然配体。适体识别靶目标特异性的分辨率极高，镜象异构体及结构类似物分子间一个基团的差异都能被适体所识别Aptamer的优势（2） SELEX实验对靶目标的性质无限制。迄今为止，已筛选出金属离子、有机染料、药物、氢基酸、辅酶、氨基多糖、多肽、蛋白质及整体病毒颗粒和细菌的适体。 适体的筛选完全在体外进行，不涉及任何动物和细胞，对毒物分子或免疫原性差的分子更具重要意义。Aptamer的优势（3） 适配体可以在变性条件下分离纯化，性质稳定，功能丧失的适体可很快复性。 在单克隆抗体技术中

34、，如果得到的抗体不是最好的，就必须重新筛选，而很难对已有抗体进行改进 Aptamer技术则可以在原aptamer基础上筛选出亲和力和特异性更好的aptamerAptamer的修饰光交联Aptamer 某些修饰的寡核苷酸能被光激活而产生活性基团，与靶分子共价结合 用5溴尿嘧啶或5碘尿嘧啶修饰aptamer，经短暂的紫外光暴露后，5替代基团与富电子氨基酸发生交联。易发生交联的氨基酸有色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸，要求光交联的氨基酸残基与Aptamer的5修饰基团在空间几何形状上有较严格的配合。这种光交联的严格性增加了Aptamer与靶分子作用的特异性。 交联的发生使Aptamer与靶分子间形

35、成共价结合，这样可以在极端条件下去除非特异结合的分子，防止了可能发生的靶分子分离，大大降低分析的背景。Aptamer的修饰抵抗核酸酶 RNA库经2位的修饰，具有了核酸酶抗性，可用于分析含有核酸酶的体液中的靶分子 DNA具有较好的稳定性，修饰和未修饰的DNA Aptamer均已用于体液中靶分子的分析Aptamer结合的特异性 目前已经报道筛选出特异配基的靶分子多达几十种，而且特异性极强。 茶碱是缓解哮喘的药物，但有毒副作用，需定期检查血清中的含量以防毒副作用的发生。茶碱与其他黄嘌呤类似物咖啡因、可可碱的结构非常相似，而后两者常存在于血清中。 常规的茶碱单抗检测有交叉反应，而通过SELEX方法筛选

36、到的寡核苷酸配基仅特异结合茶碱，与其他两中物质均无反应。其中与茶碱的亲和力比与咖啡因的亲和力高10 000倍。Aptamer的结构 Aptamer大小一般在1015碱基，这些寡核苷酸配基常存在于一些分子间结构中，如发夹、口袋等结构，能形成稳定的空间结构。 配基与靶分子的结合部位的平均大小为3040nm。Aptamer的特性 与单克隆抗体相比作用的靶分子范围更广，除金属离子、有机染料、药物、氨基酸、细胞因子、辅因子、氨基糖苷、抗生素、碱基类似物、核苷酸和多肽可以作为寡核苷酸配基的靶分子外，完整的病毒颗粒和细菌病原体也可以通过复合靶SELEX技术筛选出高亲和力的寡核苷酸配基；与靶分子的结合具有比抗

37、体更强的特异性和亲和力，且不受组织或样品中非靶蛋白的干扰。如上述茶碱的例子；能克服毒性抗原和免疫原性弱的抗原免疫动物所受的限制；Aptamer的特性 在体外筛选，不需经过体内(动物、细胞)体系，筛选出的配基在体外合成，较单抗制备具有简单、快速、便宜、纯度高等优点；筛选出的配基在合成时，可以精确、定点、随意连接其他功能集团和分子，如巯基、氨基、荧光素、生物素及酶等； 寡核苷酸配基在变性条件下分离纯化，性质稳定，变性的配基可很快复性，可长期保存和室温运输。Aptamer与蛋白芯片双位点结合试验（夹心法） 抗原/抗体夹心法是目前最常用的诊断模式。在分析中被测物被夹在两个适配体之间，一个配体用于捕捉，

38、另一个用于检测。 Aptamer在夹心分析中即可用作捕获适配体，也可用作检测适配体。Aptamer与蛋白芯片Aptamer与蛋白芯片但到目前为止，核酸配基尚不能同时发挥捕捉和检测两方面的作用，所以基于Aptamer的夹心分析都是用一个抗体作为第二配体。Aptamer竞争结合配体（抗原）的相同部位，而难以找到两个结合位点不同且没有重叠的Aptamer 。这是由SELEX过程本身决定的。SELEX过程寻找的是亲和力最高的Aptamer,，若亲和力达到极限，最后产生的是亲和力最高的、结合在最佳部位的AptamerAptamer与蛋白芯片虽然已经建立起了以抗体为基础的能同时检测大量蛋白质的微阵列技术，

39、但以Aptamer为基础的微阵列有其独特的优势：简便快速，容易形成自动化平台；密度高，可以精确固化；可以从化学合成得到均相的核酸配基；坚固、长寿；除亲和特异性外，还存在着交联特异性。小 结 蛋白芯片的类型 比较成熟的是抗体芯片；抗体芯片的基本原理 Aptamer的筛选；与蛋白芯片相比的优势组织芯片组织芯片（tissue microarray） 1998年Nature Genetics首先报道组织微阵列（TMA）。 以形态学为基础的高通量、多样本的分析工具。它是将数十个甚至上千个微小组织片整齐排列在一张载玻片上而制成的高通量组织切片，形成微阵列，将标记的特定基因的核酸探针或抗体探针与之杂交以检测

40、该基因在不同组织中的表达情况。 传统的核酸原位杂交或免疫组化实验的集成，核酸原位杂交或免疫组化一次检测一个基因在一种组织中的表达，而组织芯片一次检测一个基因在多种组织中的表达。 组织芯片又称组织微阵列（ tissue microarray，TMA），它是将数十个乃至数以千计不同来源的组织样品粘贴到同一张固相载体如玻璃片或硅片上，形成组织微阵列。在同一反应条件下进行免疫组化染色、原位杂交、FISH 和原位PCR 等以了解病变组织与相应正常组织内靶基因或蛋白质的细胞来源、分布特征和表达差异等。 它的最大便利之处在于可以对大量组织标本同时进行检测，缩短了检测时间，减少了不同染色玻片间人为造成的差异，

41、使得各组织或穿刺标本间对某一生物分子的测定更具有可比性。TMA 技术 一直以来所普遍采用的TMA 制作方法为蜡块打孔法，即将个体病人的组织作常规组织处理后石蜡包埋，制成目标蜡块。 根据设计将载体蜡块进行打孔，孔径与采样组织大小一致，直径0. 6 mm（ 穿刺标本）至2 mm（ 组织标本）不等。由有经验的病理医生对目标蜡块组织的HE 切片进行形态学观察，核对组织并在蜡块上准确标记所需要的靶点。利用打孔仪钻取靶点组织，并转移到载样蜡块相应的孔中，即制成所需的阵列蜡块。用常规方法将阵列蜡块作5m 组织切片，裱附于玻片上进行免疫组化染色、原位杂交、FISH 和原位PCR 等。 福尔马林固定的石蜡包埋的

42、组织块蜡块可以长时间的保留蛋白的抗原性。蜡块是构成组织芯片的基本材料。 构建组织芯片先要根据研究目的以及蜡块的组织学特征挑选合格的蜡块，并切片进行haematokylin and eosin (H&E) 染色判断哪个蜡块或者蜡块的那个区域可被利用。 将保留的组织学样本蜡块paraffin blocks (donor block)重新定位到一个新的样本群蜡块 recipient paraffin block。Donor block中挑选形态学上有代表性的区域，用转移蜡块组织专用的针在蜡块中打孔，孔的直径为0.6mm到2mm，并转移并包埋至新的蜡块中。 从新的样本群蜡块中制备组织切片，放置于玻片上

43、，制备成组织芯片。 样本打孔直径的大小以及组织芯片上样本的密度决定了芯片上组织样本的数目。样本都是很珍贵的，打孔直径小，可以避免对原始蜡块的破坏；同时也可以最大限度地取材 组织芯片的制备组织芯片的制备TMA 目前存在的问题 肿瘤的异质性（ 即在同一常规切片中肿瘤组织学类型不一，分化程度迥异）常常影响人们对肿瘤的诊断与评估 同一组织取材大小及数目应该代表组织的典型病变，这可以通过多点穿孔取材加以克服。 到底需要打多少个孔？样本的代表性问题 样本异质性对取材的影响。Camp et al利用38例浸润性乳腺癌病人的样本检测了检测了estrogen receptor、progesterone rece

44、ptor和Her2/neu oncogene 三个基因的表达情况，发现至少需要在同一个蜡块中的两个不同位置分别打孔取材才能很好的代表蛋白的表达情况；Torhorst et al 则分析了553个乳腺癌病人中estrogen receptor (ER)、progesterone receptor (PR) 和 p53的表达情况，结果表明需要在蜡块上打孔四次取材才能客观反映样本的情况需要一个中心孔样本和三个周边取材的样本 前列腺癌标本的异质性比较高，通常需要34个核心组织才能代表样本的真是情况 同一组织蜡块取24个（3 个以上）的核心组织是一个较为有效的解决方法，实验证明实验结果与传统组织切片有着

45、较好的相关性。TMA技术的不足 组织芯片切片厚度通常用显微镜用薄片切片机（microtome）切为4-5 micrometers厚度。 切片过程中，会出现样本丢失的情况。有些Donor block深度长短不一，取自短的Donor block的组织在切片过程中会提前耗尽。 由于组织片过小，制片过程中容易引起组织片的皱褶、移位或脱落，与常规组织切片类似，原石蜡组织块固定、包埋及切片质量好坏是影响组织片脱落的原因之一。 切片转移至玻片的过程中可能会丢失 标本的大小和数量受到限制、各组织柱的高度不同影响制片的质量、不能用于分析薄壁或多层组织如肠道、皮肤和血管等。TMA 目前存在的问题 如此高密度的芯片

46、很难要求病理专家来识别，能够对芯片进行高通量分析的自动化分析系统还没产生，因此读取如此大量数据还存在困难，相配套的自动阅读分析系统和信息处理系统尚需进一步完善。组组 织织 芯芯 片片组织芯片应用 分子流行病学：芯片上的多样本代表的是群体的研究而不是单个肿瘤的研究 用于检测同一肿瘤不同亚型中基因或蛋白产物的表达 用于检测不同肿瘤中同一指标的表达 肿瘤诊断 肿瘤分类 肿瘤浸润与转移研究 指导肿瘤治疗 判断肿瘤预后 药物筛选TMA 在病原体检测中的应用 扩增病原体特异性基因用作TMA 原位杂交探针或制备探针对于病原体特异性抗原的抗体进行TMA 免疫组织化学染色，从基因或（ 和）蛋白质水平增加高通量原

47、位检测组织、细胞病原体感染的可能性。 Arias 等在含有62 例异体移植的肾切除和20 例自身肾组织的TMA 上进行EB 病毒编码的小RNAs（EBER-1 和EBER-2）原位杂交和免疫组化染色，检测其中EBER 的表达情况以研究异体肾移植病人中EB 病毒的感染情况。发现在异体移植的肾组织中EBER 的表达率为30. 6%，而非移植的肾组织中EBER 的表达率仅为5%，在一些失败的异体肾移植病例中，部分淋巴细胞有EB 病毒潜伏感染的迹象，这对更好地理解EBER 表达的临床意义以及进行机能移植研究无疑具有重要价值。TMA 在形态学教学中的应用 在生物学、组织胚胎学及病理学的形态学教学工作中常

48、需要大量组织切片，其制备繁琐，工作量大，储存、携带不便。 TMA 技术可以把所有的组织切片集中到一张普通玻璃切片上，大大减少切片储存空间，学生可以根据实际需要对所学知识进行系统观察，极大地方便了学生在专业课学习过程中的预习与复习。组织芯片的应用 TMA最初只用于肿瘤研究，但它的应用领域一直在不断地拓展。 已经有研究者提出将TMA应用于常规临床病理检测的设想。小 结 TMA的制备 克服了传统形态学方法（如无法同步大规模筛选靶基因或蛋白质表达、组织切片费时及染色试剂消耗量大等）、分子生物学方法（如无法确定生物组织内靶基因或蛋白质的细胞来源及组织分布等）和基因芯片技术（ 如需用新鲜组织和细胞制备cDNA、芯片检测费用昂贵等）单一使用所存在的某些技术缺陷，能够有效地利用一些珍贵的病变组织或穿刺标本来研究特定基因及其相应蛋白质的表达规律以及与疾病之间的相互关系。总 结 蛋白芯片的制备方法 抗体芯片的基本原理 Aptamer与抗体的比较，在蛋白分析中的应用 组织芯片的制备及应用