沉默NET1基因

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1、沉默沉默NET-1NET-1基因基因对肝癌细胞生物学行为的影响对肝癌细胞生物学行为的影响陈莉，王桂兰，秦婧，吴园园，朱建伟陈莉，王桂兰，秦婧，吴园园，朱建伟南通大学附属肿瘤医院病理科南通大学附属肿瘤医院病理科南通大学医学院病理学教研室南通大学医学院病理学教研室 v肝细胞肝癌（肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma HCChepatocellular carcinoma HCC）是全球）是全球性的健康问题之一。我们南通启东是性的健康问题之一。我们南通启东是WHOWHO确定的确定的HCCHCC高发研高发研究现场。究现场。v研究基于我们的首次发现研究基于我们的首次发现NET-1

2、NET-1在在HCCHCC组织中特定表达，组织中特定表达，并发现该基因参与并发现该基因参与HCCHCC细胞的分裂增殖和癌发生、发展密切细胞的分裂增殖和癌发生、发展密切相关的细胞运动过程相关的细胞运动过程, ,探讨针对探讨针对NET-1NET-1的的siRNAsiRNA抑制肝癌癌细抑制肝癌癌细胞株胞株(SMMC-7721)(SMMC-7721)中中NET-1NET-1基因的表达，及该基因对癌细胞基因的表达，及该基因对癌细胞增殖、迁移、内吞的影响。增殖、迁移、内吞的影响。 一、项目研究背景一、项目研究背景NET-1NET-1与与NET-2NET-2到到NET-7NET-7一起统称为一起统称为NET

3、-XNET-X，它们是由，它们是由SerruSerru等于等于20002000年在年在EST EST 数据库中发现的数据库中发现的7 7 个新的含个新的含4 4 次跨膜蛋白超家次跨膜蛋白超家族族( transmembrane 4 superfamily ( transmembrane 4 superfamily 或或tetraspan family, tetraspan family, 简称简称TM4SF) TM4SF) 的成员。的成员。 NET-1(C4.8、P503s、Tspan-1) 定位于染色体定位于染色体1p34.11p34.1上，其上，其mRNAmRNA全长为全长为1297bp(1

4、297bp(基因库登记号基因库登记号码码AF065388)AF065388)，为，为TM4SFTM4SF的成员之一，的成员之一，最近证实其为肿瘤相关基因。最近证实其为肿瘤相关基因。1、NET-1siRNA表达质粒和表达质粒和myc-NET-1重组表达质粒的重组表达质粒的构建构建 。2、细胞培养与转染。、细胞培养与转染。 3、细胞内总、细胞内总RNA抽提及抽提及RT-QPCR检测检测NET-1m RNA。4、Western blot检测检测NET-1蛋白表达。蛋白表达。5、CCK-8法检测细胞增殖活性。法检测细胞增殖活性。 6、流式细胞仪、流式细胞仪(FCN)检测各组细胞处于不同细胞周期检测各组

5、细胞处于不同细胞周期中的比例与增殖指数。中的比例与增殖指数。7、细胞划痕试验检测细胞二围空间的迁移能力。、细胞划痕试验检测细胞二围空间的迁移能力。 8、Transwell小室检测细胞三围空间的迁移能力。小室检测细胞三围空间的迁移能力。9、Capture-ELISA方法测量细胞内生物素标记的转铁方法测量细胞内生物素标记的转铁蛋白水平。蛋白水平。10、 anti-uPAR标记的癌细胞伪足形成实验。标记的癌细胞伪足形成实验。一、一、 材料与方法材料与方法 系统系统 组织组织 成人组织成人组织 胎儿组织胎儿组织 恶性组织恶性组织 第一组第一组 第二组第二组 第三组第三组消化系统消化系统 胃胃 + NA

6、* + 食道食道 + NA NA 小肠小肠 + NA NA 结肠结肠 + NA NA 直肠直肠 + NA + 胰腺胰腺 NA + 肝肝 +泌尿生殖系统泌尿生殖系统 肾肾 + + + 睾丸睾丸 + + + 宫颈宫颈 + NA (halan 细胞细胞l) + 宫体宫体 + NA + 前列腺前列腺 + NA NA 乳腺乳腺 + NA NA 内分泌系统内分泌系统 垂体垂体 + NA NA 甲状腺甲状腺 + NA NA 肾上腺肾上腺 + NA NA淋巴造血系统淋巴造血系统 造血细胞造血细胞 NA * 淋巴结淋巴结 + NA NA 骨髓骨髓 NA NA 脾脏脾脏 + NA NA 胸腺胸腺 + NA NA神

7、经系统神经系统 脑脑 + + NA 脊髓脊髓 + NA NA 视网膜视网膜 + NA NA其他其他 心心 + 黑色素瘤黑色素瘤 + 肺肺 + + NA 肌肉肌肉 + + NA 皮肤皮肤 + + NA 胎盘胎盘 + NA NA *NA:现在未做检测；现在未做检测； *白血病，淋巴瘤白血病，淋巴瘤 1. 检测人体组织中检测人体组织中NET-1mRNA表达表达锁定研究目标锁定研究目标 HCC二、结果二、结果M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11Lanes M: 200ng of 1kb size ladder (New England BioLabs); Lanes1-3: Normal

8、 Fetal Liver Tissues; Lanes 4-7: Normal Adult Liver Tissues; Lanes 8 -11: Liver Cancer Tissues 转染NET-1siRNA和myc-NET-1后SMMC-7721细胞中NET-1mRNA的表达（RT-QPCR）以未处理组为1。NET-1-siRNA组和myc-NET-1组分别与未处理组相比 (P0.05，p0.01)；NET-1-siRNA组与pU6H1-GFP组相比(P0.05，p0.01)；myc-NET-1组与pcDNA3.1/myc组相比( P0.05，p0.01) 2 2、RT-QPCRRT-

9、QPCR检测转染检测转染NET-1siRNANET-1siRNA和和myc-NET-1myc-NET-1细胞中细胞中NET-1 NET-1 mRNAmRNA的结果的结果 3. NET-1蛋白表达在蛋白表达在HCC组织中显著高于癌旁组组织中显著高于癌旁组织中。织中。-actinNET-1Lanes 1,3,5,7 cancerous tissues; Lanes2,4,6,8: adjacent noncancerous tissues（1）随时间的延长）随时间的延长NET-1-siRNA处理组细胞增殖明显减少；处理组细胞增殖明显减少； NET-1稳稳定表达组细胞增殖明显增多。定表达组细胞增殖明

10、显增多。4. 干扰干扰NET-1 可以抑制可以抑制HCC细胞增殖细胞增殖（2）NET-1-siRNA处理组细处理组细胞存在胞存在G0/G1和和G2/M期阻滞，期阻滞，G0/G1和和G2/M期期细胞比例分别增细胞比例分别增加了加了17.04%和和10.97%，S期细期细胞比例降低。胞比例降低。NET-1稳定表达稳定表达组细胞更快地进组细胞更快地进入细胞周期进程，入细胞周期进程，G0/G1期细胞比期细胞比例明显降低。例明显降低。GFPsiRNAGFPsiRNA组组NET-1 siRNANET-1 siRNA组组对照组对照组NET-1过表达组过表达组5. 干扰干扰NET-1 可以抑制可以抑制HCC细

11、胞迁移细胞迁移在在NET-1siRNA组中组中显著减少显著减少(p0.05)，在在myc-NET-1组中明组中明显增加显增加(p0.05） NET-1 siRNA处理细处理细胞后迁移能力明显下胞后迁移能力明显下降。降。转染转染48h后穿过后穿过Matrigel胶细胞数胶细胞数NET-1 siRNA组组（21.425.74）和）和pU6H1-GFP（45.608.25）差异有显）差异有显著统计学意义（著统计学意义（P0.05）；）；myc-NET-1组（组（64.806.14）和和pcDNA3.1/myc（38.207.22）差异有显著统计学意义）差异有显著统计学意义（P0.05）。）。 6.

12、干扰干扰NET-1 可以抑制可以抑制HCC细胞内吞细胞内吞 转铁蛋白转铁蛋白(Tfn)内吞实验显示，内吞实验显示，NET-1 siRNA组癌细胞组癌细胞的内吞能力明显下降。的内吞能力明显下降。其他组间的内吞作用变化不明其他组间的内吞作用变化不明显显 。未处理未处理 anti-NET-1 兔兔IgG NET-1siRNA GFP-siRNA7. 干扰干扰NET-1 可以抑制可以抑制HCC细胞侵袭伪足形成细胞侵袭伪足形成NET-1siRNANET-1siRNA处理细胞伪处理细胞伪足形成细胞百分比明显足形成细胞百分比明显减少减少(p0.01)(p0.01) NET-1siRNANET-1siRNA处

13、理处理细胞中以细胞中以anti-anti-uPARuPAR标记的癌细标记的癌细胞伪足明显减少胞伪足明显减少。 8.干扰干扰NET-1 可以抑制裸鼠可以抑制裸鼠HCC的生长的生长myc-NET-1NET -1 siRNA9.NET-1表达与表达与HCC临床病理因素和预后的研究临床病理因素和预后的研究(1) NET-1(1) NET-1表达与表达与HCCHCC临床病理因素临床病理因素密切相关。密切相关。 NET-1NET-1基因蛋白表达与基因蛋白表达与HCCHCC临床病理因素的关系临床病理因素的关系(76(76例例) )（2）Kaplan-Meier生存曲线生存曲线 （3）Cox比例风险模型多因素

14、生存分析比例风险模型多因素生存分析HCCHCC转移、组织学分级，癌中转移、组织学分级，癌中NET-1NET-1、JAB1JAB1、p-p27T187p-p27T187、p-p27S10p-p27S10、PCNAPCNA表达均具有表达均具有独立的预后意义。独立的预后意义。风险分析提示这些因素增强时均能增加风险分析提示这些因素增强时均能增加HCCHCC病人的死亡风险病人的死亡风险( (其风险比均其风险比均1)1)三、讨论三、讨论 本文通过构建本文通过构建NET-1siRNA和和myc-NET-1表达质粒，并表达质粒，并转染肝癌细胞转染肝癌细胞SMMC-7721。研究发现。研究发现NET-1基因参与

15、肝癌基因参与肝癌细胞的增殖分裂活动，干扰肝癌细胞细胞的增殖分裂活动，干扰肝癌细胞NET-1基因的表达，基因的表达，可以抑制癌细胞的增殖，使细胞生长受限，可以抑制细胞可以抑制癌细胞的增殖，使细胞生长受限，可以抑制细胞在二围、三围空间的迁移能力、癌细胞内吞能力和侵袭性在二围、三围空间的迁移能力、癌细胞内吞能力和侵袭性伪足形成能力。相反，增加伪足形成能力。相反，增加NET-1基因的表达，癌细胞表基因的表达，癌细胞表现为显著增生，更快地进入细胞周期，迁移能力提高。研现为显著增生，更快地进入细胞周期，迁移能力提高。研究结果揭示了肝癌细胞中究结果揭示了肝癌细胞中NET-1基因的功能，为肝癌的发基因的功能，

16、为肝癌的发生、发展机制增添了新的内容。生、发展机制增添了新的内容。 NET-1表达与表达与HCC临床病理因素和预后相关性的研究临床病理因素和预后相关性的研究显示为显示为NET-1表达与表达与HCC的组织学分型、病理分级、脉管的组织学分型、病理分级、脉管转移等临床病理因素密切相关。癌中转移等临床病理因素密切相关。癌中NET-1高表达患者生高表达患者生存期明显减少、存期明显减少、 NET-1高表达具有独立的预后意义。高表达具有独立的预后意义。 NET-1 高表达能增加高表达能增加HCC病人的死亡风险。病人的死亡风险。 1.1.首次发现首次发现NET-1NET-1在肝脏良恶性组织中表达的特点。在肝脏

17、良恶性组织中表达的特点。2.2.在在HCCHCC细胞中干扰细胞中干扰NET-1NET-1表达，抑制癌细胞的表达，抑制癌细胞的迁移、迁移、 侵袭、内吞和伪足形成的能力，并能抑制裸侵袭、内吞和伪足形成的能力，并能抑制裸鼠鼠HCC 生长。提示生长。提示NET-1NET-1可能在可能在HCCHCC细胞运动中发细胞运动中发挥作用，挥作用， 是是HCCHCC细胞增殖相关蛋白。细胞增殖相关蛋白。3.NET-1表达与表达与HCC临床病理因素密切相关，是显著影临床病理因素密切相关，是显著影响患者预后的独立指标，高表达患者死亡风险增加，具响患者预后的独立指标，高表达患者死亡风险增加，具有显著的临床预后评估价值。有

18、显著的临床预后评估价值。4.已研制的已研制的NET-1多克隆抗体，可用于免疫组化、蛋白多克隆抗体，可用于免疫组化、蛋白 印迹等多种实验，具有临床推广使用的可行性与价值。印迹等多种实验，具有临床推广使用的可行性与价值。四、项目研究创新点四、项目研究创新点 致致 谢谢1、该课题研究历时、该课题研究历时9年先后得到了江苏省教育厅高新技术年先后得到了江苏省教育厅高新技术课题和南通市社会发展课题课题和南通市社会发展课题 的经费资助。的经费资助。 2、NET-1抗体的合成得到了美国旧金山基因生物技术公抗体的合成得到了美国旧金山基因生物技术公司的协助。司的协助。3、 课题完成共培养硕士学位毕业研究生课题完成共培养硕士学位毕业研究生12位。他们为该位。他们为该课题中做了大量的工作，付出了辛勤的汗水，奉献了卓越课题中做了大量的工作，付出了辛勤的汗水，奉献了卓越的智慧。的智慧。 Thank you ！