细胞培养技术与应用

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1、 随着现代医药生命科学的发展，细胞培养在其领域和相关领域应用越来越广泛。目前，细胞可以用来用来生产蛋白生物制品、临床上用于移植 、用于检测有毒物质、用于生理、病理、药理等方面的研究，为治疗和预防疾病提供理论依据。 由于在培养中或机体内，细胞行为的基本规律是一样的，因此许多研究可以在体外进行。更重要的是，在体外培养条件下，人们可以有目的、有选择的控制细胞生长的因素环境，因此可以研究在某些特殊条件下的细胞生物学行为，这里主要目的是介绍细胞培养的基本概念和技术及其应用。l1)细胞内部的种种活动,如DNA的复制和转录、蛋白质合成、能量代谢;l2)细胞内部的流动,如RNA从细胞核向细胞质方向运转,激素受

2、体复合物的易位等;l3)生态学,如营养、感染病毒或化学诱变、药物作用;l4)细胞与细胞之间的相互作用,如胚胎诱导、细胞群体的动力学等。 l5)组织工程:种子细胞生物材料l6)干细胞的研究与应用一、细胞培养的基本理论二、细胞培养的基本条件三、基本的细胞培养技术四、细胞培养技术的应用（一）（一）细胞培养技术的历史（二）（二）基本概念、基本理论 （1） 1885年Roux最早尝试使组织离体培养，材料是鸡胚神经板，采用生理盐水为培养液,并首次采用组织培养这个术语。（2） 1907年Harrison 和1912年Carrel开始把组织培养作为一种方法，用于研究离体动物细胞的培养。 (3) 1912年Ca

3、rrel将无菌操作技术引入动物细胞培养，在动物体液中发现促进细胞生长的因子，奠定了无血清培养研究基础。 (4) 1962年Stile成功的大规模悬浮培养了小鼠肾细胞（BHK），从而为动物细胞大规模培养技术的发展奠定了基础。 (5) 1967年Wezel和1972年Knazek先后创立了微载体和空纤维细胞培养体系，使细胞培养技术提高到大规模培养水平。 体外培养技术的发展大致可分三个时期：体外培养技术的发展大致可分三个时期： 50年代之前，细胞培养在多个领域发展时期；年代之前，细胞培养在多个领域发展时期； 50年代是细胞培养迅猛发展时期，多种培养技年代是细胞培养迅猛发展时期，多种培养技术相继建立；

4、术相继建立； 50年代后是体外培养技术与生命科学其他技术年代后是体外培养技术与生命科学其他技术结合发展的新时期，诞生了多种培养应用技术。结合发展的新时期，诞生了多种培养应用技术。我国体外培养技术的发展：我国体外培养技术的发展： 20世纪世纪50年代以后，如张钧、鲍鉴清分别在上年代以后，如张钧、鲍鉴清分别在上海、北京开展部分相关工作海、北京开展部分相关工作1952 鲍鉴清鲍鉴清 天津天津 第一实验室第一实验室1955 编写编写 第一本第一本 组织培养技术组织培养技术1995年年 鄂征主编鄂征主编组织培养和分子细胞学技术组织培养和分子细胞学技术一书一书其他还有：郭辉玉、高尚荫、鄂征、陈瑞铭等其他还

5、有：郭辉玉、高尚荫、鄂征、陈瑞铭等. 由于组织培养在医学研究中的应用，如抗病毒由于组织培养在医学研究中的应用，如抗病毒疫苗的生产等，现已经逐渐发展成为一门精细技疫苗的生产等，现已经逐渐发展成为一门精细技术。许多细胞株、细胞系的培育成功，术。许多细胞株、细胞系的培育成功，尤其是以尤其是以人的肿瘤组织为材料建立的各种细胞系，如人的肿瘤组织为材料建立的各种细胞系，如Hela细胞系（细胞系（Gey，1952），），可用来进行一系列研究，可用来进行一系列研究，更加促进了组织培养技术的发展。更加促进了组织培养技术的发展。 在两种不同类型的细胞混合培养物中发现有在两种不同类型的细胞混合培养物中发现有自发的两

6、类不同细胞间的融合细胞后，为细胞融自发的两类不同细胞间的融合细胞后，为细胞融合技术的发展和应以及杂交瘤技术奠定了基础合技术的发展和应以及杂交瘤技术奠定了基础,并并推动了细胞生物学、细胞免疫学、细胞遗传学、推动了细胞生物学、细胞免疫学、细胞遗传学、病毒学等学科的交叉与发展。病毒学等学科的交叉与发展。 随着细胞生物学和分子生物学间的相互渗透交叉，分子克隆技术与细胞培养技术相结合，在阐明基因的结构和功能、基因在细胞生长和分化中的作用，以及细胞癌变机制等方面起了重要作用。如基因的克隆及在细胞中的作用、克隆癌基因与细胞生长分化的关系，以及反义癌基因RNA对细胞转化的抑制作用的方面起了重要作用。1、体外培

7、养分类、体外培养分类1.1 组织培养组织培养(Tissue Culture)：从体内取出组织摹拟体内生理环境,在无菌 、适当温度和一定营养条件下，使之生存和生长并维持其结构和功能的方法。1.2 细胞培养细胞培养(Cell Culture):从动物机体内取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。其原理是细胞分裂增殖。细胞分裂增殖。1.3 器官培养器官培养（Organ Culture）：培养的是器官的原基、器官的一部分或整个器官,使之在体外生存、生长和保持一定功能的方法。（如下图）2 2、组织培养的细胞生物学特点、组织培养的细胞生物学特点2.1体内外细胞的差

8、异体内外细胞的差异：人工条件和体内实际情况不完全相同时,细胞在体外培养后,一旦失去神经体液调节和细胞间相互影响,生活在缺乏动态平衡的环境中,则发生变化。细胞变化最多见的表现是:返祖（Atavism）现象失去原有组织结构和细胞形态、分化减弱或不显、细胞趋单一化、不死性、恶性状。细胞增殖细胞增殖和分化分化是细胞生命进化中所获得的基本属性,增殖使细胞数量增多;分化使机体结构和功能多样化,最后演变成完整的有机体。2.2 2.2 培养细胞的分化培养细胞的分化 细胞分化机制是极其复杂的,是在细胞与细胞、细胞与体液和细胞与细胞外基质相互作用下,众多基因参与、经过多阶段和多环节完成的动态演变过程。不适应（不适

9、应（Deadaption）细胞在体内时所拥有的分化特性减弱或不显。例如肝细胞在体外丧失了产生酪氨酸转移酶的特性。脱分化脱分化和和去分化去分化（Dedifferentiation）由于基因变异而使细胞失去分化能力。如肝细胞失掉产生精氨酸酶及氨基酸转移酶的特性后,储存肝糖元的能力丧失,并很难再现。 因此,不适应和脱分化是两个不同概念，不适应只是因为生存条件改变而使分化发生抑制;从分子水平考虑,脱分化很可能是基因变异所导致。3 3、培养细胞的形态、培养细胞的形态 3.1.贴附型：贴附型：1）成纤维细胞：心肌细胞，血管内皮细胞等2）上皮型细胞：消化管外皮细胞，肝脏上皮细胞等3）游走型细胞：神经胶质细胞

10、4） 多形型细胞：神经组织细胞3.2.悬浮型：悬浮型：如癌细胞和血液白细胞原代原代培养期培养期: :从体内取出组织接种培养到第一次从体内取出组织接种培养到第一次传代培养这个阶段，一般持续传代培养这个阶段，一般持续1-41-4周。这个阶周。这个阶段细胞比较活跃，有细胞分裂，但不旺盛。段细胞比较活跃，有细胞分裂，但不旺盛。传代期传代期：从原代培养的细胞的一经传代后便称细：从原代培养的细胞的一经传代后便称细胞系。细胞增殖旺盛，当传代胞系。细胞增殖旺盛，当传代10-5010-50次后，细次后，细胞增殖缓慢，以致完全停止。胞增殖缓慢，以致完全停止。衰退期衰退期：细胞增殖缓慢或不增殖。细胞轮廓增强，：细胞

11、增殖缓慢或不增殖。细胞轮廓增强，最后衰退凋亡。最后衰退凋亡。4.1 原代培养（Primary Culture）期：即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，一般持续1一4周。此期细胞呈活跃的移动，可见细胞分裂，但不旺盛。初代培养细胞与体内原组织在形态结构和功能活动上相似性较大，细胞群是异质的（Heterogeneous），也即各细胞的遗传性状互不相同，细胞相互依存性强。如把这种细胞群稀释分散成单细胞，在软琼脂培养基中进行培养时，细胞克隆形成率（Cloning Efficiency）很低，即细胞独立生存性差。克隆形成率：即细胞群被稀释分散成单个细胞进行培养时，形成细胞小群（克隆）的百分数。初代培

12、养细胞多呈二倍体核型；由于原代培养细胞和体内细胞性状相似性大，是检测药物很好的实验对象。 4.2 4.2 传代期传代期初代培养细胞一经传代后便称做细胞系（Cell Line）。在全生命期中此期的持续时间最长。在培养条件较好情况下，细胞增殖旺盛，并能维持二倍体核型，呈二倍体核型的细胞称二倍体细胞系（Diploid Cell Line）。为保持二倍体细胞性质，细胞应在初代培养期或传代后进行早期冻存。当前世界上常用的二倍体细胞一般不出十代内冻存。如不冻存，则需反复传代以维持细胞的适宜密度，以利于生存，但这样就有可能导致细胞失掉二倍体性质或发生转化。一般情况下当传代1050次左右，细胞增殖逐渐缓慢，以

13、至完全停止，细胞进入第三期。 4.3 衰退期衰退期：此期细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖，细胞形态轮廓增强，最后衰退凋亡。在细胞生命期阶段，少数情况下，在以上三期任何一点（多发生在传代末或衰退期），由于某种因素的影响，细胞可能发生自发转化（Spontaneous Transformation）。转化的标志之一是细胞可能获得永生性（Immortality）或恶性性（Malignancy）。细胞永生性也称不死性，即细胞获持久性增殖能力，这样的细胞群体称无限细胞系（Infinite Cell Line），也称连续细胞系（Continuous Cell Line）。无限细胞系的形成主要发生在第二期末，

14、或第三期初阶段。细胞获不死性后，核型大多变成异倍体（Heteroploid）。细胞转化亦可用人工方法诱发，转化后的细胞也可能具有恶性性质。细胞永生性和恶性性非同一性状。初代培养初代培养 细胞系细胞系 （连续细胞系）（连续细胞系）老化传代期0 2 4 6 8 10 12 14 周16 14 12 10 8 6 5 5、组织培养细胞的传代培养、组织培养细胞的传代培养 当细胞生长达到一定密度后，都需要做传代处理，传代的频率或间隔与培养液的性质、接种细胞的数量和细胞增殖速度有关。所谓细胞“一代”即从细胞接种到分离再培养的一段时间。如某一细胞系为50代即该细胞已传代50次。 Hayflick极限极限 体

15、外培养的细胞增殖能力不是无限的，传代次数有一定的界限，称为“ Hayflick极限”。 传代次数与物种寿命有关：小鼠寿命3年，传代12次；龟寿命200年，传代140次。 传代次数与个体年龄成反比：人胚胎，40-60代； 幼年，20-40代；成年，10-30代；早老病儿童，2-10代。 细胞传代的三个阶段 ：（1）潜伏期（潜伏期（Latent phase）： 细胞从接种到贴壁生长繁殖的一段时间。2倍体细胞该期时间长（24-96h），连续细胞系时间短（10-30min）。 （2) 指数生长期（指数生长期（Logarthmic growth phase）： 细胞增殖最旺盛时期，一般用细胞分裂指数（M

16、itotic index MI）表示：即细胞群中每1000个细胞中的分裂相数。体外培养细胞分裂指数介于0.1-0.5%，且受细胞种类培养液成分、pH、温度等影响。 指数生长期是细胞活力最好的时期，在接种细胞数量适宜情况下，指数生长期持续3-5d后，随细胞数量不断增多，生长空间日趋减少，细胞相互接 触 汇 合 成 片 ， 呈 现 接 触 抑 制 （ C o n t a c t inhibition）。而恶性细胞则无接触抑制现象，因此接触抑制可作为区分正常与癌细胞标志之一。但癌细胞则由于营养成分的消耗和细胞代谢产物的影响而发生密度抑制（Density inhibition）。（3)停滞期（停滞期（

17、Stagnate phase）： 即细胞数量达到饱和密度后，细胞与营养液的交换面积减少,代谢产物积累,PH下降细胞停止增殖，进入停滞期。在此时应及时进行换液传代，否则因细胞中毒受损，大量细胞出现死亡，至少再传1-2代后，细胞才能恢复。 （一）仪器和设备:1、常规的细胞培养设备：超净台、CO2孵箱、倒置显微镜、-80 冰箱、液氮灌2、培养器材：培养瓶、离心管、冻存管、纯水设备、干燥消毒除菌设备以及清洗设备等。3、培养箱中控制条件：温度：36.5 0.5湿度：100%CO2浓度： 5% （二）培养液: 1、常用的培养基： 目前常用的基础培养液均有商品化,如RPMI1640，MEM，DMEM，F12

18、等,可根据培养需求合理选择。 液体、粉末（hepes、NaHCO3）2、配制低糖、配制低糖DMEM培养基：培养基：试剂名称试剂名称 体积（质量） 低糖低糖DMEM培养基（干粉）培养基（干粉） 10.0g HEPES 2.2g NaHCO3 2.0g 双抗双抗 100,10ml 于超净台内操作, 加入三蒸水, 充分溶解后, 三蒸水定容到1000ml, 0.22m滤膜过滤，-20C保存备用 3、缓冲系统：常用为HEPES(N-2-hydroxy-ethylpiperazine-N-ethanesulfonic acid)，缓冲效能(pKa)在20时为7.55，37为7.31。HEPES不是起维持p

19、H恒定的作用，而是起恒定和抵抗快速pH变化的，所以调整pH常常用NaHCO3溶液。 （三）细胞培养添加剂：1、血清: 一般最常用新生牛血清、胎牛血清，也用人血清和其它动物血清。由于不同的研究目的，血清成分往往干扰研究实验，如进行某些药物和受体及特殊营养方面研究时，要使用无血清培养基。质量：批间差异很大。浓度：10%20%作用：营养、促细胞分裂繁殖、中和胰酶 2、有机补充物：如丙酮酸钠, 谷胺酰氨等; 3、促细胞分裂因子：如生长因子类如FGF(成纤维细胞生长 因子)，EGF(表皮生长因子);贴壁和铺展因子：如胶原蛋白、纤粘蛋白等，可根据培养细胞的特殊要求进行添加。浓度：一般为1030g/ml (

20、四) 平衡盐溶液:1、作用：主要用于作为稀释和灌注的液体，维持细胞渗透压，提供缓冲系统,使培养液的酸硷度维持在培养细胞生理范围内，提供细胞正常代谢所需的水分和无机离子等。2、常用有：PBS,、Hanks以及生理盐水等，其配方可参考有关书籍。3、配制无钙、镁离子的配制无钙、镁离子的1PBS缓冲液（缓冲液（1000ml）药品名称药品名称质量质量(g)NaCL8.0Na2HPO4.12H2O2.88KCL0.2KH2PO4 0.2加三蒸水定容至1000ml，搅拌，使之充分溶解，过滤或高压灭菌备用。（五）消化液： 1、种类：胰酶消化液、胰酶+乙二胺四乙酸 (Ethylene Diamine Tetra

21、acetic Acid， EDTA ）、胶原酶等。 2、特性：具有普通酶的特性 3、影响因素： 药品名称药品名称质量质量/体积体积(g/ml)胰蛋白酶（胰蛋白酶（Trypsin）0.25g乙二胺四乙酸二钠乙二胺四乙酸二钠（EDTA）0.04gPBS 100ml充分溶解后, 0.22m滤膜过滤，-20C保存备用。(六)抗生素: 青霉素(每毫升培养液50-100单位) 链霉素(每毫升培养液50-100微克) 两性霉素（每毫升培养液20-25微克）。（七）细胞冻存液1、由含20%70%血清的培养基和二甲基亚砜 （dimethylsulfoxide ，DMSO ）组成。2、 DMSO作用：防止细胞因温

22、度剧烈变化导致细胞膜破裂药品名称药品名称体积体积(ml)DMEM培养基培养基70血清血清 20二甲基亚砜（二甲基亚砜（DMSO） 103、冻存液配制（八）（八）培养液的物理性质 PH：大多数细胞在PH7.0-7.4时生长最好，一般不低于6.8，不高于7.6。酚红-常用的指示剂，用来检测PH的变化。红色PH7.4；橙色PH7.0；黄色PH6.5；红蓝色PH7.6，紫色PH7.8。1、温度、温度：温度除直接影响细胞生长外，与培养液的PH值有关，温度低时CO2溶解性增加，从而影响PH。2、渗透压、渗透压:3、粘度、粘度:4、表面张力、表面张力(一) 解离组织1.解离组织:在无菌情况下采取动物的组织或

23、器官,放在含有抗生素的平衡盐溶液(BSS)中,然后尽快在超净台或无菌室内进行解离处理. 解离时应注意解离时应注意:1)尽可能将脂肪和坏死组织去除干净;2)剪碎组织时,避免损伤组织块;3)解离组织用的各种酶系,需要先进行低速离心。1、意义（1）制备具有均匀细胞层的培养物； （2）从单个细胞出发获得细胞群体；从一定量的组织中获得最多的细胞量时，常用酶和鳌合剂进行解离。1）胰蛋白酶解离细胞法：2）胶原酶解离细胞法：这种方法对解离胚胎性、正常和恶性组织是很有效的.胶原酶和透明质酸酶协同作用有助于分离大鼠或兔的肝脏组织.胶原酶最终浓度200u/ml,36.5温育,一般温育4-48h. 3）机械解离细胞法

24、：细胞计数细胞计数1. 准备计数板：准备计数板：2. 准备细胞悬液：准备细胞悬液：要求细胞密度不低于104个/ml，若细胞数很少，应将悬液离心（1000r/min,5min），重悬浮于少量培养液中。消化单层细胞时，务求细胞分散良好，制成单细胞悬液。3. 加样：加样：取样计数前，应充分混匀细胞悬液。加样时不要溢出盖玻片也不能溢入两侧的玻璃槽内，如果产生上述情况需对计数板冲洗和拭干后重新加样，加样量也不要太少或带气泡。4. 计数：计数：在显微镜下，用10物镜观察计数板四角大方格中的细胞数。细胞压中线时只计左侧和上方，不计右侧和下方。记数公式记数公式: 细胞浓度细胞浓度(细胞个数细胞个数/每毫升每毫

25、升)=(4个大方格细胞总数个大方格细胞总数/4)104 细胞原液稀释倍数细胞原液稀释倍数镜下计数时，遇见2个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计数。如细胞团10%以上，说明消化不充分，或细胞数少于2个/mm2或多于50个/mm2，说明稀释不当，需重新制备细胞悬液，计数。1）外植块培养）外植块培养:外植块在一定限度内可保持其原有组织结构,有利于其适应体外培养环境。短期培养的外植块成为细胞培养的材料来源之一。2）单层细胞培养）单层细胞培养:每隔1-3d换液一次,细胞长成单层后进行传代培养。3）悬浮细胞培养）悬浮细胞培养:使细胞成悬浮状态在培养液中连续生长, 或者由于细胞本身是不粘附的,如小鼠白血病

26、细胞和腹水肿瘤细胞,或者是通过机械搅动使细胞保持悬浮状态,也可以通过选择培养得到能悬浮生长的细胞进行悬浮培养。1、培养液和培养物:一定浓度的培养液仅能支持一定数量的细胞生长,不能盲目增加每单位体积的细胞浓度。2、 PH:初培养pH应为7.4,培养过程应不低于7.0。3、培养瓶内的空间:一般培养瓶内培养液与液面上的空间体积之比为1:10。4、容积、深度、表面面积:培养液体积与表面面积的比例为0.2-0.5ml/cm。5、去除死细胞:细胞死亡后释放有害因子6、温度控制:动物细胞培养对温度波动的敏感性很大。温度低于36.5,细胞生长缓慢;温度高于37,细胞失去存活力。因此应按要求严格控制温度。归纳归

27、纳过程过程取取 的组织、器官的组织、器官细胞悬浮液细胞悬浮液 酶酶 贴满瓶壁的细胞贴满瓶壁的细胞单个细胞单个细胞加入加入 液液动物胚胎或幼龄动动物胚胎或幼龄动物物胰蛋白胰蛋白培养培养接触抑制接触抑制原代原代 培养培养1-101-10代细胞代细胞遗传物质遗传物质 改变改变原代细胞原代细胞培养培养加加 液液10105050代细胞代细胞未未遗传物质遗传物质 改变改变无限传代无限传代已已传代传代培养培养胰蛋白胰蛋白 酶酶 1、细胞系：原代培养的培养物中所含的细胞类型多而复杂，因此在培养初期，存活和生长的细胞类型也是多种多样的。所以再培养不仅仅是为了维持细胞不断地生长，而且是培养物逐步演进为具有增殖能力

28、、特征专一、类型均匀的细胞，即细胞系细胞系(Cell line)。 细胞系建立后，应对细胞系进行一系列鉴定，才能应用于细胞生物学、免疫学、细胞遗传学等方面的研究。鉴定内容应包括:1)细胞系的细胞来源：2)鉴定细胞系的纯度：即除了主类细胞外,还杂有哪类细胞。3)细胞系的稳定性：即在细胞连续培养过程中主要指标应无明显变化。4)累积细胞系的形态及其表达特征的基本数据，以及其与来源细胞的差异等。1. 形态学2. 染色体:包括染色体数目和核型分析以及染色体分带技术。3. 同工酶谱：通常以G6PD(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、LDH(乳酸脱氢酶)、核苷磷酸化酶三种方法，可根据条件选择。4.细胞DNA遗传特征:

29、 限制性片断长度多态性(restriction fragment length polymorphism RFLP)，是指在生物进化过程中,DNA序列发生某些中性突变，突变的结果是失去或获得一个酶切点,因此当基因组DNA用限制性内切酶酶切后，限制性内切酶片断加长或缩短，用同源的克隆DNA为探针就可以探测出。另外也可能在生物进化过程中DNA分子结构发生重排，使DNA碱基排列序列改变,影响内切酶切点，使内切酶酶切片断呈多态性。一般采用Southern印迹杂交法检测。 一个克隆的细胞群体是从一个单一母细胞繁殖而来，分离单一细胞并使其繁殖为一细胞群体的方法成为克隆化隆化(cloning)。 1.稀释铺

30、板法(见图)2.饲养层克隆法(见图)3.胶原膜板或纤维蛋白膜板克隆法4.琼脂克隆法(见图)5.在琼脂基底上用甲基纤维素克隆法.(见图) 1、各种生物体细胞染色体各有其一定的数目、形态和结构，其可作为特化细胞的基本标志。 染色体是一种鉴定细胞系的种属、性别来源较为确切的指标；也是检查细胞系是否趋于稳定，在离体培养条件下细胞有否发生转化的可靠指标，是区别正常细胞与恶性细胞的指标。1）染色体数目2）核型分析3）分带技术： G-,C-带分析1）培养细胞：取处于对数生长期，用较大瓶皿培养的80-90%汇合单层培养细胞。2）加秋水仙素：使用最终浓度为0.02-0.8mg/ml营养液，温箱继续培养6-10小

31、时。3）采集分裂细胞：可利用分裂中期细胞体变圆与底物附着不牢固的特点，手持培养瓶，左右反复横向水平摇动，令培养液在培养细胞表面反复冲涮，这样约可使90%的中期分裂细胞从瓶壁脱落；注意勿用力过猛，以防多量非分裂细胞脱落影响观察。4）离心：收集培养液，1000转/分离心5-10分钟。5）低渗处理：吸取上清液，加入预温至37C的0.075MKCL溶液，在温箱中静置20-30分钟。6）预固定：向悬液中加新鲜1：3醋酸甲醇固定液1ml，用吸管吹打均匀；此操作起到使细胞表面轻微固定，可防止固定后细胞粘连成块。7）固定：离心，同4），吸除上清液，加新鲜固定液5-10ml，要用一手微斜持离心管，另一手用吸管吸

32、取固定剂，将固定剂逐滴滴在离心管壁上，使之缓慢流入离心管中，轻轻吹打均匀，放置15-20分钟。8）重复7），末次离心后，小心吸除大部分上清，据悬液中细胞密度大小，余下固定液0.5-1ml。9）制作：用滴片法制片，按如下步骤：将洁净的载玻片放4C冰箱预冷，滴片前从冰箱取出冷载物片一张，在载玻片表面出现微细水气时，立即向片心一侧滴2-3滴细胞悬液（如固定液不散开，可能因载玻片未洗净或不冷所致）。滴片时的距离保持半米高度较好。滴片在室温中自然干燥，然后镜下观察并记数染色体数。10）染色和封片：一般常用Giemsa染色，取Giemsa1份+9份PH6.8磷酸缓冲液混均匀，染色10分钟后，水洗，晾干，直

33、接观察（适用油镜），如标本需要保存或做长期观察，可过二次二甲苯，用中性树胶封片。 该过程难在制出的标本不是非常理想和一致，常出现分裂指数少，染色体分散不良，或染色体过短等，为此在初做时，应做预实验，摸清条件，提高成功率。 细胞培养的污染污染问题非常重要，否则将会前功尽弃。细胞培养一定要建立无菌观念，遇到培养污染要分析原因,及时处理。 细胞培养中常见的污染物有细胞培养中常见的污染物有细菌、酵母菌、细菌、酵母菌、真菌和支原体真菌和支原体。在出现以下情况时培养的细胞可。在出现以下情况时培养的细胞可能有污染能有污染:1) 培养液的酸碱度发生异常的改变。培养液的酸碱度发生异常的改变。2)培养液出现混浊。

34、培养液出现混浊。3)光镜观察到菌丝、菌膜和颗粒。光镜观察到菌丝、菌膜和颗粒。4)细胞出现死亡或增殖缓慢等。细胞出现死亡或增殖缓慢等。1.细菌和真菌污染细菌和真菌污染：细菌可采用涂片染色镜检的方法；真菌可用相应培养基进行检测。2.支原体检测支原体检测: 支原体污染细胞后,能抑制细胞代谢和生长,改变核酸合成，影响细胞的抗原性，引起细胞染色体改变，干扰病毒的复制，以及具有类病毒作用。支原体引起的一些细胞变化，可以继续传代下去，但在培养细胞时由于起初对细胞的繁殖影响较小而往往不引起重视，因此支原体应作为常规检测。 革兰阴性杆菌：洋葱佰克霍尔德菌（Burkholderiacepacia）污染 细菌污染高

35、倍镜图片（1000倍），瑞氏染色 黑焦虫污染 真菌污染 HSC-T6真菌污染 1）荧光技术检测）荧光技术检测:支原体含有支原体含有DNA,能与一种能与一种荧光染料荧光染料Hoechest 33258特异性的结合特异性的结合,可根可根据细胞表面的荧光来显示细胞是否污染有支据细胞表面的荧光来显示细胞是否污染有支原体原体.2）直接培养法）直接培养法: 实验室常用实验室常用3) 放射自显影检测放射自显影检测:4) DNA分子杂交分子杂交:3) 污染支原体的处理污染支原体的处理: 抗生素处理；共培养法抗生素处理；共培养法;重重新克隆法；过滤法。新克隆法；过滤法。1）CPE或集落的检测或集落的检测;2）血

36、细胞吸附试验血细胞吸附试验;3）鸡胚接种鸡胚接种. 在不加保护条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水会形成结晶，能导致细胞内发生一系列变化，如电解质浓度升高、渗透压改变、脱水等，能引起细胞死亡。 向 培 养 基 中 加 入 保 护 剂 甘 油 或 二 甲 基 亚 砜（DMSO），可使冰点降低，在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外。贮存在130以下低温中能减少冰晶的形成。溶解细胞时，速度要快，使之迅速通过细胞最易受损的50后，细胞仍能生长，活力不受损害。 1、冻存：（1）原理（2）注意事项：）注意事项：消化细胞不要过度消化细胞不要过度冻存液冻存液7：2：1或或4：5：1 DM

37、SO为为 无色纯品，变黄勿用。无色纯品，变黄勿用。温度：要逐步降温温度：要逐步降温 从从4 30m-20 30m- 70 1-2h,1-2h,然后移入液氮罐内。然后移入液氮罐内。细胞：对数生长期旺盛的细胞细胞：对数生长期旺盛的细胞做好记录：名称、日期、数量（还有代数做好记录：名称、日期、数量（还有代数)(1)将冻存于液氮中的冻存管取出，迅速放入3740水浴中使其在1min内融化。(2) 无菌操作下打开冻存管，将细胞悬液移至离心管中，补加10ml培养液，5001000rpm低速离心5min，去上清（ DMSO 在常温下对细胞有毒，应在细胞复苏后尽量除去），用培养液适当稀释后装入培养瓶中，置37培

38、养，次日更换一次培养液。待细胞生长至一定密度后即可传代。 冻存要慢，复苏要快冻存要慢，复苏要快(3)细胞能否顺利复苏，影响因素较多，如冻存时细胞能否顺利复苏，影响因素较多，如冻存时细胞的状态以及有无污染等。目前，有学者介绍细胞的状态以及有无污染等。目前，有学者介绍还应注意一点，即还应注意一点，即 细胞溶解后，可缓慢加入细胞溶解后，可缓慢加入10倍倍冻存液的应用液培养冻存液的应用液培养1248h，再换液。目的是，再换液。目的是逐渐稀释细胞和保护剂，避免细胞膜内外渗透压逐渐稀释细胞和保护剂，避免细胞膜内外渗透压变化过于迅速而使部分细胞死亡变化过于迅速而使部分细胞死亡(1) 选生长状态良好的细胞，去

39、掉培养液，充满新培养液，液量要达到培养瓶颈部，拧紧螺帽或塞以胶塞，保留微量空气。若空气留量过多，运输时大气泡来回流动对细胞有干扰作用。 (2) 妥善包装、运输。一般在四五天内到达目的地，对细胞活力无多大影响，时间过长则细胞活力下降。 (3) 到达目的地后，倒出大部分培养液，保留维持细胞生长所需的液量，置37培养，次日传代。四、细胞培养的应用四、细胞培养的应用应用领域：应用领域：1、测试药物的效应、测试药物的效应2、杂交瘤技术中。、杂交瘤技术中。3、基因转导（、基因转导（Gene transfer)4、组织工程中、组织工程中 5、胚胎干细胞的相关研究与应用、胚胎干细胞的相关研究与应用1、测试药物

40、效应、测试药物效应 适用于研究抗癌药物和致畸、致癌、致适用于研究抗癌药物和致畸、致癌、致突变的药物。范围：突变的药物。范围：1）鉴定有潜在活性的化合药物）鉴定有潜在活性的化合药物 2）药物发挥毒性的作用机制）药物发挥毒性的作用机制3）预测可能用于临床的有效的细胞毒性药物）预测可能用于临床的有效的细胞毒性药物4）多种化合物中筛选有效成分及活性范围）多种化合物中筛选有效成分及活性范围 5）确定效应细胞类型）确定效应细胞类型 6）确定毒性范围）确定毒性范围 7）研究药物浓度与暴露时间的关系）研究药物浓度与暴露时间的关系 当一个基因被克隆后，检测它的性状和功能的方当一个基因被克隆后，检测它的性状和功能

41、的方法就是将它再导入细胞内，观察它在细胞内的表达。法就是将它再导入细胞内，观察它在细胞内的表达。 把基因导入细胞内，使外源基因整合到受体细胞把基因导入细胞内，使外源基因整合到受体细胞基因组中，是研究基因表达，结构和功能的重要手段，基因组中，是研究基因表达，结构和功能的重要手段，培养细胞使基因转导最适宜的对象。培养细胞使基因转导最适宜的对象。1.染色体转导染色体转导:利用细胞融合或显微注射法把利用细胞融合或显微注射法把携带目的基因的染色体或染色体片断整合入携带目的基因的染色体或染色体片断整合入受体细胞（或宿主细胞）的技术。受体细胞（或宿主细胞）的技术。2.基因转导基因转导：把已克隆的基因或含有目

42、的基：把已克隆的基因或含有目的基因的因的DNA片断或序列转入受体细胞基因组的片断或序列转入受体细胞基因组的技术。分为技术。分为基因转染基因转染（Gene Transfection）和和转基因技术转基因技术(Transgenic Technique)。 把基因导入体外培养细胞中，观察目的把基因导入体外培养细胞中，观察目的基因在体外细胞中的表达。以体细胞为基基因在体外细胞中的表达。以体细胞为基因导入对象时，一般用培养细胞，也可用因导入对象时，一般用培养细胞，也可用体内二倍体细胞。如用体内细胞，需先从体内二倍体细胞。如用体内细胞，需先从体内取出细胞，导入基因后，再输回体内，体内取出细胞，导入基因后，

43、再输回体内，该技术已成为基因治疗技术之一。该技术已成为基因治疗技术之一。磷酸钙沉淀法；磷酸钙沉淀法；DEAE葡聚糖法：葡聚糖法：原生质融合法：原生质融合法：微量注射法：微量注射法：脂质体包被法脂质体包被法电穿孔法等电穿孔法等可根据试验目的的需要，选择合适的方法。可根据试验目的的需要，选择合适的方法。1)收获细胞, 约2x105细胞重悬于2ml完全培养基中,转种于35mm培养皿中(或六孔板).2)37c,5%CO2培养箱培养18-24h,使细胞达50-80%的融合.3) 在E.P管中制备下列溶液: 溶液A:将2-20g质粒DNA溶于100l无血清培养基中. 溶液B:20lLipofectin稀释于80l无血清培养基中.4)合并溶液A和溶液B,轻轻混合.置于室温15min.5)弃去细胞培养液,并用无血清培养基洗涤细胞1次.6)加0.8ml无血清培养基至Lipofectin-DNA混合物中,混匀后,小心滴加至细胞上,轻轻混匀.7)37C,5%CO2培养箱培养5h.8)弃去转染液,加2ml完全培养基,继续培养.9)转染后48-72h,测定细胞的瞬时表达情况,如用于稳定表达,可于转染48h后更换选择培养基筛选.细胞培养论坛：l1、生物谷：l2、干细胞之家：l3、三叶草生物技术论坛： 复苏过程3、熟悉细胞培养试剂配制及常见细胞培养条件4、了解细胞培养技术的应用